Dit protocol beschrijft een eenvoudige bereidingswijze voor goud nanodeeltjes geïntegreerde foto-responsief liposomen met de commercieel verkrijgbare materialen. Het toont ook aan hoe de microbellen cavitatie proces van de gesynthetiseerde liposomen te meten bij de behandeling van gepulste laser.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Synthese van gouden nanodeeltjes geïntegreerde Photo-responsieve liposomen en waardering van hun Microbel Cavitatie bij Pulse Laser Excitatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Foto-responsieve nanodeeltjes (NPs) hebben aanzienlijke aandacht gekregen vanwege hun potentieel om ruimtelijke, temporele en doseringscontrole te bieden over de afgifte van medicijnen. Echter, de meeste relevante technologieën bevinden zich nog steeds in de ontwikkelingsfase en zijn niet verkrijgbaar voor klinieken. Hier beschrijven we een gemakkelijke fabricage van deze foto-responsieve NPs met commercieel verkrijgbare gouden NPs en thermo-responsieve liposomen. Calcein wordt gebruikt als modelgeneesmiddel om de inkapselingsefficiëntie en het afgifte-kinetisch profiel bij warmte-/lichtstimulatie te evalueren. Ten slotte laten we zien dat deze foto-getriggerde afgifte te wijten is aan de membraanverstoring veroorzaakt door microbubbelcavitatie, die kan worden gemeten met een hydrofoon.
Inleiding
De mogelijkheid om geneesmiddelafgifte te activeren met behulp van externe stimuli is een aantrekkelijke manier om de drugs te leveren in ruimtelijk, temporal- en dosering gecontroleerde mode met maximale specificiteit en minimale bijwerkingen. Uit een breed scala van exogene stimuli-responsieve systemen (licht, magnetisch veld, echografie, microgolfstraling), licht-geactiveerd platforms zijn aantrekkelijk vanwege hun niet-invasieve, eenvoud en flexibiliteit in de klinieken. 1 Uitgebreid onderzoek in het afgelopen decennium heeft verstrekt een verscheidenheid van platform technologieën, zoals nabij-infrarood licht verantwoordelijk goud (Au) nanocages bekleed met slimme polymeren, 2 foto-labiele, polymere nanodeeltjes (NP) geconjugeerd met drugs, 3 en zelf-geassembleerde porphysome nanovesicles. 4 echter deze technologieën nog in de preklinische stadia van ontwikkeling, en vereisen een duidelijk begrip en optimalisatie van parameters die bij het proces van het initiëren en controllen van de geneesmiddelafgifte.
Een van de eenvoudigste en gemakkelijk toegankelijke werkwijzen voor het bereiden van een dergelijk systeem is Au NPs integreren met thermisch-gevoelige liposomen 5,6, die beide zijn overal verkrijgbaar in de markt en zijn uitgebreid onderzocht in preklinische en klinische proeven ook. Ondanks de beperking van bindweefselmassages activering van Au NPs hun plasmonische golflengte, in vergelijking met nabij-infrarood-geactiveerde Au nanostructuren (bijvoorbeeld nanocages) Dit systeem heeft nog steeds grote belofte bij toediening in kleine dieren of topische afgifte bij mensen. 7 Er zijn een aantal vroege pogingen in het combineren van Au NP's met liposomen voor lichte geactiveerd release. 8-11 Terwijl de meeste van hen richten zich op de nieuwheid van materialen, moet de toegankelijkheid en schaalbaarheid problemen die moeten worden aangepakt. Bovendien, de verslagen over de mechanismen vrijlating gebruik van deze nanocarriers zijn nog beperkt.
Hierin de fabricage van fotogevoeligliposomen, tegelijk geladen met drugs en hydrofiele Au NP is beschreven. Calceïne wordt gebruikt als een modelverbinding de inkapselefficiëntie en het afgifteprofiel van het systeem te evalueren. Bovendien, in dit systeem, lichtabsorptie door Au NP verdwijnt de omringende micro in de vorm van warmte, wat resulteert in een verhoging van de lokale temperatuur. Lucht microbellen ontstaan tijdens de laser verwarmen en veroorzaken mechanische verbreking van liposomen (figuur 1). Het mechanisme van microbellen cavitatie wordt bevestigd door hydrofoon metingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding
- Schone 100 ml rondbodem kolven gebruikt koningswater (1 deel geconcentreerd salpeterzuur (HNO3) en 3 delen geconcentreerd zoutzuur (HCl)) en was de kolven met DI water. Autoclaaf kolven en droog ze in een hete luchtoven bij 100 ° C gedurende 15 minuten. Wikkel en opslaan van de steriele kolven tot gebruik.
- Steriliseren in de hand gehouden mini-extruder set met behulp van 70% ethanol.
- Schakel de rotatieverdamper en de temperatuur van het waterbad en de koeltoren bij 37 ° C en 4 ° C respectievelijk.
- Bereid 60 mM voorraadoplossing calceïne door het oplossen van 374 mg van calceïne in 10 ml van 0,1 mM fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,4). Op pH 7,4 onder toepassing van 1 M natriumhydroxideoplossing (NaOH).
2. Bereiding van liposomen
- Verwijder de lipiden (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPPC), 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholijn (mppc) en 1, 2-distearoyl- sn glycero-3-phosphoethanol-amine N - [carboxy (polyethyleen glycol) -2000] (ammoniumzout) (DSPE-PEG2000)) uit diepvriezer (-20 ° C) en ontdooien ze tot KT.
- Weeg 15,9 mg DPPC, 1,3 mg mppc, en 2,8 mg DSPE-PEG2000. Lossen ze samen in 2 ml chloroform.
- Breng de chloroformoplossing de steriele rondbodemkolf en damp het oplosmiddel met de roterende verdamper onder verlaagde druk, om een dunne, droge lipide laag.
- Hydrateren lipidelaag bij 45 ° C met 2 ml waterige oplossing gedurende 30 min met 1,95 ml 60 mM calceïne bereid in stap 1,4 en 50 pl Au NP (3,36 x 10 16 deeltjes / ml).
- Verwarm het verwarmingsblok bij 45 ° C. Plaats een 200 nm polycarbonaat membraanfilter tussen de filter ondersteunt en de montage van de mini-extruder set. Controleer de eventuele lekkage met DI-water.
- Vul een van de spuiten met 1 ml liposoomoplossing van stap 2,4 en extruder; koperde het monster door de oplossing op de spuit aan de andere kant van het assembleren mini-extruder. Herhaal 11 keer.
- Voer het gesynthetiseerde liposomen door een PD-10 ontzoutingskolom de vrije Au NPs, lipiden en calceïne met behulp PBS als elutiemiddel volgens het protocol van de fabrikant te verwijderen.
- Bewaar de monsters in steriele buizen bij 4 ° C en gebruik in 2 dagen.
3. calceïneafgifte van liposomen met Airconditioning
- Bereken de lipide molariteit van de voorraad oplossing door optelling van de molariteiten van DPPC, mppc en DSPE-PEG2000 in stap 2.2. Verdun het liposoom voorraadoplossing tot 5 mM lipide concentratie middels 0,1 mM PBS-buffer (pH 7,4). Breng de monsters naar een centrifugebuis (2 ml).
- Plaats de buis in een warmwaterbad, en de temperatuur geleidelijk op 25 tot 70 ° C. Verhoog de temperatuur met een snelheid van 1 ° C / min in.
- Verzamel fracties (10 ul) bij verschillende temperaturen punten (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 en 70 ° C).
- Voeg 10 ul van 2% Triton X-100 tot 2 ml aliquot van liposomale oplossing van de liposomen verteren 10 minuten bij kamertemperatuur en volledige afgifte van calceïne bereiken.
- Transfer 200 ul van de liposomale oplossing aan elk putje in de 96-well microplaat en meet de fluorescentie-intensiteit van de verzamelde monsters met fluorescentie- microplaat reader. De excitatie en emissie golflengten van calceïne zijn 480 en 515 nm respectievelijk.
- Neemt de fluorescentie-intensiteit van het Triton X-100 behandelde monsters 100% afgifte, wordt het percentage van de afgegeven calceïne op elk tijdstip, met de formule:
Ft is de fluorescentie-intensiteit van de oplossing op een bepaald tijdstip. F i en F x zijn de genormaliseerde eerste en laatste fluorescentie-intensiteiten van de oplossing respectievelijk.
4. Calceïne Releasen van liposomen met gepulste laser
- Transfer 100 ul liposoom oplossing voor een kwarts cuvet en plaats deze in een cuvettehouder. Gebruik een gepulste Nd: YAG laser met een pulsduur van 6 nsec bij golflengte 532 nm als lichtbron. Gebruik de volgende Laser Parameters - Herhaling tarief: 1 Hz; Laser energiedichtheid: 1 mJ / cm2; Beam diameter: 0,5 mm.
- Leid de gecollimeerde laserstraal door de cuvet zodanig dat het licht door de liposoom-oplossing en het verzamelen van monsters na verschillende pulsen.
- Voeg 10 ul van 2% Triton X-100 tot 2 ml aliquot van liposomale oplossing van de liposomen verteren 10 minuten bij kamertemperatuur en volledige afgifte van calceïne bereiken.
- Gezien calceïne is gevoelig voor licht en tijdens de laser experiment kan worden gebleekt, vooraf meten van de blekende werking van gepulste laser op calceïne oplossing om de gegevens te normaliseren van liposoom release.
- In het bijzonder bloot calceïne-oplossing (60 mm) gepulste laser wiste frequentie van 1 Hz voor het variëren pulstal (0, 25, 50 en 100). Meet de fluorescentie-intensiteit calceïne met excitatie en emissie golflengten van 480 en 515 nm respectievelijk voor en na laserbelichting.
- Bereken de hoeveelheid blekende (fluorescentie-intensiteit van calceïne voor laserbelichting / fluorescentie-intensiteit van calceïne na het specifieke aantal pulsen). Met deze factor aan de waarden verkregen van liposoommonsters normaliseren door vermenigvuldiging van de fluorescentie-intensiteit van de liposomen met de factor.
- Meet de fluorescentie-intensiteit van de verzamelde monster met behulp van een fluorescentie microplaat reader bij excitatie en emissie golflengten 480 en 515 nm respectievelijk.
- Neemt de fluorescentie-intensiteit van het Triton X-100 behandelde monsters 100% afgifte, wordt het percentage van de afgegeven calceïne bij elke puls, met gebruik van de formule:
Ft de fluorescentie-intensiteit van de oplossing bij een gegeven aantal pulsen in normaal. F i en F x zijn de genormaliseerde eerste en laatste fluorescentie-intensiteiten van de oplossing respectievelijk.
5. drukmeting Impulsen
- Plaats 100 ul van het monster op een microscopisch preparaat en stel de focus van de laser op het monster.
- Dompel een naald hydrofoon (1 mm diameter en 450 nV / Pa gevoeligheid) in de oplossing.
Let op: De hydrofoon mag niet worden verlicht door het laserlicht om de schade te voorkomen. - Bestralen van het monster met de gepulste laser met variërende puls nummers (0-100) en pulsenergie (20-160 uJ / puls).
- Noteer de druk signalen met een digitale oscilloscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Liposomen werden bereid met een gebruikelijke dunne film hydratatie techniek DPPC, mppc en DSPE-PEG2000 in een molaire verhouding van 86: 10: 4 en 7,95: 0,65. 1,39 mg / ml 12 De grootte van Au NP is cruciaal voor het licht bepalen omzettingsrendement naar warmte in de volgende laserexcitatie experiment. Kleiner de grootte van Au NP, hoe hoger het overdrachtselement efficiency. 13 Aldus 5 nm Au NP, de kleinste monsters van de leverancier voor het inkapselen gekozen. ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dunne film hydratatie is de gebruikelijke werkwijze voor het bereiden van liposomen. Organische oplosmiddelen (chloroform in dit geval) werd eerst gebruikt om de lipiden op te lossen en daarna verwijderd in een rotatieverdamper bij 37 ° C om een lipide dunne film op de kolf genereren. Deze lipide film werd gehydrateerd met een waterige oplossing die 60 mM calceïne en 5 nm Au NP. Tijdens het hydratatieproces, werd de temperatuur gehandhaafd rond 50 ° C en de kolf werd voortdurend geroerd door omzwenken. De sleutel in d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflict worden verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Tier-1 wetenschappelijk onderzoek fondsen door Singapore Ministerie van Onderwijs (RG 64/12 tot CX) en NTU-Northwestern Institute of nanogeneeskunde.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 850355P | Poeder, Bewaar bij -20 °C |
| 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfocholine (MPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 855675P | Poeder, Bewaar bij -20 °C |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanol-amine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout) (DSPE-PEG2000) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 880120P | Poeder, Bewaar bij -20 °C |
| Goud Nanodeeltjes | Sigma Aldrich | 752568-100mL | 5 nm deeltjes, gestabiliseerd bij 0.1 mM PBS |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875-10g | 60 mM, pH 7.4 (aangepast met behulp van NaOH) |
| fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | 0.1 mM, pH 7.4 |
| Dubbel gedestilleerd water | Millipore Milli-DI waterzuiveringssysteem | ||
| Triton X100 | Sigma, Life Sciences | X-100 | Om de liposomen te verstoren om de totale inkapsling te berekenen |
| Rotavapor | Buchi (Zwitserland) | R 210 | Gebruikt voor Liposoom voorbereiding |
| Verwarmingsbad | Buchi (Zwitserland) | B 491 | Gebruikt voor Liposoom voorbereiding |
| Vacuümregelaar | Buchi (Zwitserland) | V-850 | Gebruikt voor Liposoom voorbereiding |
| Vacuümpomp | Buchi (Zwitserland) | V-700 | Gebruikt voor Liposoom voorbereiding |
| Recirculatiebad met temperatuurregelaar | Polyscience | Gebruikt voor Liposoom voorbereiding | |
| Mini-extruder-assemblage met verwarmingsblok | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610000 | Gebruikt voor het extruderen van liposomen |
| Spuiten, 1.000 μl | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610017 | Gebruikt voor het extruderen van liposomen |
| Polycarbonaat filtermembraan, 200 nm | Whatmann | 800281 | Gebruikt voor het extruderen van liposomen |
| Filterondersteuning | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610014 | Gebruikt voor het extruderen van liposomen |
| PD 10 Desalting kolommen, Sephadex G-25 medium | GE Healthcare, Life sciences | 17-0851-01 | Gebruikt om de liposomen te zuiveren |
| Centrifuge | Sigma Laboratorium Centrifuges | 3K30 | Gebruikt om de liposomale oplossing te concentreren |
| Rotor | Sigma | 19777-H | Gebruikt om de liposomale oplossing te concentreren |
| Zetaizer | Nano ZS Malvern | Gebruikt voor de bepaling van liposomengrootte en zetapotentiaal | |
| UV-Visibele Spectrofotometer | Shimadzu | UV-2450 | Gebruikt om de absorptie van de monsters te meten |
| Fluorescent Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Gebruikt om de fluorescentie-emissie van de monsters te meten |
| Nd:YAG Laser | NewWave Research | 532 nm; Maximale vermogen: 17 mJ; Breedte: 406 nsec; Gebruikt voor bemonsteringsbestraling | |
| HNR Hydrofoon | ONDA | HNR-1000 | 1 mm diameter en 450 nV/Pa gevoeligheid, Eigenlijk werkfrequentiebereik: 0.25-10 MHz; Kalibratie: 50 mV/Bar; Gebruikt om de akoestische signalen te meten |
| Digitaal Oscilloscoop | LECORY - Wave Runner 64Xi-A | Frequentie: 600 MHz; Max monster snelheid: 10 Gs/sec (bij twee kanalen); Gebruikt om de gemeten akoestische signalen te registreren |
Referenties
- McCoy, C. P., et al. Triggered drug delivery from biomaterials. Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).
- Yavuz, M. S., et al. Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light. Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).
- Gohy, J. F., Zhao, Y. Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior. Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).
- Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
- Needham, D., Dewhirst, M. W. The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors. Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).
- Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer. Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).
- Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy. Nat. Commun. 5, 3796(2014).
- Paasonen, L., et al. Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes. J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).
- Wu, G., et al. Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells. J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).
- Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes. Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).
- Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).
- Mills, J. K., Needham, D. Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition. Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).
- Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles. J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).
- Chongsiriwatana, N., Barron, A. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. Antimicrobial Peptides. Giuliani, A., Rinaldi, A. C. 618, Humana Press. 171-182 (2010).
- Egerev, S., et al. Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles. Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).
- González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles. Appl. Phys. Lett. 96, 174104(2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
