Isolatie van Infiltrating leukocyten uit Mouse huid met behulp van enzymatische Digest en Gradient Scheiding

Samenvatting

Dit protocol beschrijft enzymatische vertering van muizenhuid in voedingsrijk medium, gevolgd door gradiëntscheiding om leukocyten te isoleren. De zo verkregen cellen kunnen voor verschillende downstream-toepassingen worden gebruikt. Dit is een effectieve, economische en verbeterde alternatief voor weefseldissociatiemachines en agressievere trypsine- en dispase-gebaseerde weefselverteringsprotocollen.

Samenvatting

Het dissociëren van muishuid in een enkele celsuspensie is essentieel voor downstream cellulaire analyse, zoals de karakterisering van infiltrerende immuuncellen in knaagdiermodellen van huidontsteking. Hier beschrijven we een protocol voor de vertering van muishuid in een voedingsrijke oplossing met collagenase D, gevolgd door scheiding van hematopoëtische cellen met behulp van een discontinue dichtheidsgradiënt. Cellen die aldus worden verkregen, kunnen worden gebruikt voor in vitro studies, in vivo overdracht en andere downstream cellulaire en moleculaire analyses, inclusief flowcytometrie. Dit protocol is een effectieve en economische alternatief voor dure mechanische dissociators, gespecialiseerde scheidingskolommen en scherpere trypsine- en dispase-gebaseerde verteringsmethoden, die de celviabiliteit of dichtheid van oppervlakte-eiwitten die relevant zijn voor fenotypische karakterisering of cellulaire functie kunnen aantasten. Zoals hier in onze representatieve gegevens wordt getoond, produceerde dit protocol zeer levensvatbare cellen, bevatte specifieke immuuncelpopulaties en had geen effect op de integriteit van veelgebruikte oppervlaktemarker-eiwitten die in flowcytometrische analyse worden gebruikt.

Inleiding

Huidaandoeningen, variërend van contact dermatitis, eczeem, psoriasis, cellulitis, schimmelinfecties en abcessen op non-melanoma huidkanker bleken te zijn van de 50 meest voorkomende ziekten in de wereld, en de vierde toonaangevende wereldwijde oorzaak van niet-dodelijke ziekten in 2010 ^1. Dienovereenkomstig, het onderzoek van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan diverse huid pathologieën is een noodzakelijke en actieve gebied van onderzoek. Knaagdiermodellen opmerkelijk bruikbaar zijn bij het ​​begrijpen van inflammatoire huidaandoeningen geweest zoals atopische dermatitis ^2, psoriasis ³ of Staphylococcus aureus infectie ^4. Goedkoop, efficiënt, eenvoudig en protocollen voor de enzymatische vertering van muizenhuid weefsel van cellen die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van downstreamtoepassingen beter begrip van de pathofysiologie van huidziekten verschaffen. Hier wordt een eenvoudige en economische werkwijze beschreven voor enzymatische digestie van muizenhuidweefsel en isoleren van huid-infiltrerende leukocyten die kunnen worden gebruikt voor celkweek, in vivo adoptieve overdracht, flow cytometrische analyse en sortering of gene expression studies. Het algemene doel van deze procedure is om een ​​enkele celsuspensie van huid-infiltrerende leukocyten te bereiden met een hoge levensvatbaarheid van de cel terwijl het minimaliseren van de kosten doorgaans geassocieerd met aangepaste reagens kits en mechanische dissociators.

Bestaande huidweefsel dissociatie methoden ^5-7 kan resulteren in lage levensvatbaarheid en oppervlakte celmerker integriteit, of eisen aangepaste enzym kits en dure weefsel dissociatie machines ^8-11. Terwijl de vertering van muizenoor huidweefsel redelijk gangbaar ^12-13, verteren sterk verhoornde huidweefsel (bijvoorbeeld van de flank) kan resulteren in celpreparaten verontreinigd met grote hoeveelheden niet-cellulair afval. In een recente studie, Zaid en collega verteerd muis flank huid gedurende 90 min in 2,5 mg / ml dispase, followed door 45 min bij 3 mg / ml collagenase ^7. In een andere studie, deze onderzoekers gebruikte meervoudige incubaties met een gecombineerde digestie van 2,5 uur, inclusief het gebruik van trypsine / EDTA, collagenase III en dispase ^5. Het gebruik van trypsine wordt niet aanbevolen voor de huid enzymatische digestie, zoals behandeling met trypsine van verschillende fabrikanten heeft aangetoond dat meetbaar invloed op de integriteit van celoppervlakeiwitten op zoogdiercellen ^14-15. Bovendien kan dispase aanzienlijk proliferatieve vermogen van CD4 en CD8a T cellen en beïnvloeden oppervlakte overvloed van ten minste 20 moleculen met gemeenschappelijke T cel activatie merkers zoals CD62L ^16. Andere protocollen RPMI 1640 in digestiemedium ^6. Echter, de aanwezigheid van ^Mg2 + en ^Ca2 + in RPMI uitgebreide celaggregatie ¹⁷ veroorzaken.

Een ideale protocol voor het weefsel dissociatie moeten streven naar een hoge levensvatbaarheid van de cellen, laagniveaus van cel- aggregatie en minimale schade aan oppervlakte-eiwitten cel. Hoge kwaliteit lymfeklier stromale cel voorbereidingen zijn bereikt met protocollen die kortere enzymincubaties, Ca ²⁺ en Mg ²⁺ vrije media te gebruiken, en trypsine te vermijden en Dispase ^18. Echter protocollen van dit type niet vastgesteld voor de dissociatie van hele muizenhuid.

Hier wordt een protocol beschreven te distantiëren, te isoleren en te verrijken huid-infiltrerende leukocyten uit-allergeen uitgedaagd muis flank huid. In het kort uitgesneden huid gepreïncubeerd in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met 10% foetaal runderserum gedurende 1 uur aan het weefsel voor de spijsvertering te verzachten en verwijderen van overtollige dode huid en vetweefsel. Dit wordt gevolgd door een 30 min enzymatische digestie stap met 0,7 mg / ml collagenase D. collagenase D heeft minimale effecten op de dichtheid van celoppervlak markers, en geen effect op T-celproliferatie in vitro ^16,18, waardoor hetzeer geschikt voor toepassingen in de karakterisering van oppervlakte-eiwitten. Na enzymatische digestie, werd discontinue dichtheidsgradiënt centrifugatie gebruikt epitheelcellen en vuil van de eencellige suspensie te verwijderen en te verrijken voor hematopoïetische cellen. Belangrijk is dat deze procedure vermijdt dure kolommen gebaseerde magnetische celscheiding reagentia en weefsels dissociatie machines ^11/08, en kan worden uitgevoerd met apparatuur en materialen die in een fundamenteel biomedisch onderzoekslaboratorium. Hier werd dit protocol dat wordt gebruikt om leukocyten te isoleren van de flank huid uitgedaagd drie keer met het hapteen oxazolon (Ox) in eerder gevoelig ND4 Zwitserse muizen (aangepast van 19). Cellen werden geanalyseerd met behulp van multi-parametrische flowcytometrie. Deze techniek leverde een celsuspensie met minimale puin en> 95% levensvatbaarheid van de geïsoleerde lymfocyten die werden geanalyseerd door multi-parametrische flowcytometrie om de infiltratie van T-lymfocyten en neutrofielen te meten in de getroffen skin.

Protocol

Let op: 8-12 weken oude vrouwelijke ND4 Zwitserse Webster muizen conventioneel gehuisvest met vrije toegang tot voedsel en water, werden gebruikt voor deze studies Het experimentele protocol gebruikt (B13S1) werd goedgekeurd door Macalester College IACUC..

1. Sensibilisering en Challenge met Oxazolon

1. Dag 0
   1. Bereid anesthesie kamer door toevoeging van 3 ml isofluraan absorberende handdoeken geplaatst onder maas onderaan een 4 L deksel glazen pot. Voor de ND4 vrouwelijke muizen die hier gebruikt, de tijd in de kamer is 30-60 seconden totdat het onderwerp voldoende wordt verdoofd; optimaliseren verdoving administratie van de muizenstam gebruikt.
   2. Shave terug elke verdoofde muis en flankeren met een dier tondeuse.
2. Dag 1
   1. Voeg een oplossing van 4-ethoxymethyleen-2-fenyl-2-oxazolin-5-on (Ox) in absolute ethanol 2% en incubeer bij 50 ° C gedurende 15 min op een roterende plaat in een incubator.
   2. Kort verdovenmuizen, waarbij isofluraan anesthesie zoals beschreven in 1.1.1 en 100 gl 2% Ox toepassing op de geschoren rug in verschillende standaard toepassingen van ongeveer 20 pl elk. Wacht 5-10 seconden tussen seriële applicaties voor de oplossing te drogen.
   3. Zorg om te voorkomen dat het morsen van de 2% Ox oplossing anders dan de rug regio, en wacht tot de oplossing te drogen tussen applicaties.
3. Dagen 5-7
   1. Voeg een oplossing van 1% (Ox) in absolute ethanol en incubeer bij 50 ° C gedurende 15 min op een roterende plaat in een incubator.
   2. Voorzichtig maar stevig immobiliseren van de muis op het nekvel en staartbasis met buik omhoog en hals enigszins naar beneden gekanteld (vergelijkbaar met een greep voor een intraperitoneale injectie) en 100 gl 1% Ox toepassing op de geschoren flank in verschillende standaard toepassingen en de tijd om de huid daarna droog als hierboven beschreven.
   3. Bij controlemuizen Breng 100 pi absolute ethanol voertuig op de geschoren flank.

2. Flank Skin Harvest

1. Euthanaseren muizen met behulp van kooldioxide inademing, en zorgvuldig accijnzen het gewenste gebied van de flank huid (~ 25 mm x 25 mm van de huid) met 10 cm chirurgische schaar.
2. Met behulp van een schone, scherp chirurgisch mes, schraap het overtollige vet en bindweefsel van de flank huid.
3. Plaats 3 stukken flank huid 3 muizen in een 50 ml conische buis met 10 ml HBSS RT [met fenolrood, zonder calcium of magnesium, 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1- piperazineethaansulfonzuur (HEPES) en 10% foetaal runderserum (FBS)].

3. Pre-vergisting Tissue Wassen

1. Plaats buis met huidfragmenten op een roterende plaat voor 30 minuten in een droge niet-vergaste incubator gehandhaafd bij 37 ° C.
2. Vortex krachtig gedurende 10 seconden aan het einde van de incubatieperiode.
3. Zeef de inhoud van de buis door een 70 umzeef om de wasbuffer weggooien en het verzamelen van het weefsel. Eén zeef kan gedurende de gehele procedure opnieuw worden gebruikt bij een biologische behandelgroep.
4. Met behulp van een pincet, overdracht van de flank huid van de zeef in een nieuwe 50 ml conische buis met 10 ml vers, RT HBSS medium (bevattende EDTA, HEPES en FBS zoals hierboven beschreven).
5. Met een 12,5 cm paar chirurgische schaar ontleden ondergedompeld in de buis, blad voor elk stuk huid flank zodat de gemiddelde stukje weefsel is ongeveer 2,2 mm x 2,2 mm gebied.
6. Plaats buis met huidfragmenten op een roterende plaat voor 30 minuten in een droge niet-vergaste incubator gehandhaafd bij 37 ° C.
7. Vortex krachtig gedurende 10 seconden aan het einde van de incubatie

4. Collagenase Spijsvertering van de Huid

1. Zeef de inhoud van de buis door een 70 urn zeef, opnemen en overbrengen flank huid stukjes in een nieuwe 50 ml conische buis met 10 ml fresh, RT HBSS medium aangevuld met 0,7 mg / ml collagenase D.
2. Plaats buis met digestiemedium en huidfragmenten op een roterende plaat 30 minuten in een droge niet-vergaste incubator gehandhaafd bij 37 ° C.
3. Vortex inhoud van de buis krachtig gedurende 10 seconden aan het einde van de incubatie.
4. Inhoud filter van de buis door een 70 urn zeef in een nieuwe 50 ml conische buis; houdt de doorstroom met het gedigereerde weefsel en de zeef en gooi flankeren huid vuil.
5. Was de doorstroom in 50 ml HBSS media gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 350 g en decanteer het supernatant.

5. dichtheidsgradiëntcentrifugatie

1. Met behulp van een serologische pipet 3 ml RT 67% dichtheidsgradiënt centrifugatie media in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een nieuwe 15 ml conische buis voor elk monster.
2. Resuspendeer de celpellet in 5 ml 44% RT dichtheidsgradiëntcentrifugatie media in HBSS met fenolrood.
3. Gently laag 5 ml van de 44% dichtheidsgradiënt centrifugatie medium dat de cellen bovenop de 67% dichtheidsgradiënt centrifugatie mediavoorbeeld behulp van een serologische pipet. Zorg ervoor dat u de pipet op de laagste snelheid in te stellen, en zet de pipet langs de wand van de conische buis. Wees voorzichtig niet te schudden, verstoren, of omkeren het verloop.
4. Stel versnelling naar de laagste stand, los van de rem, en centrifuge de helling bij 931 xg gedurende 20 min bij RT ervoor te zorgen dat de centrifuge in balans is.
5. Na het centrifugeren, verwijder voorzichtig de gradiënt van de centrifuge, en voorzichtig te vervoeren naar het lab bank houden de buis rechtop. Met behulp van een 5 ml plastic transferpipet, verwijder de cellaag op het grensvlak van de 44% en 67% dichtheidsgradiënt centrifugatie media overgebracht in een nieuwe 15 ml conische buis. Als de interface niet zichtbaar is, verwijdert u ongeveer 2 ml vloeistof bij de 67% -44% grens.
6. Vul het conische buis met cellen van de intece met 2% FBS in 1X ijskoude PBS, centrifuge cellen gedurende 5 min bij 350 xg en decanteer het supernatant.
   Opmerking: Dit is de eerste keer dat de cellen kunnen worden gekoeld / bewaard koud omdat digestie stappen bij 37 ° C en dichtheidgradiëntcentrifugatie media stappen bij KT. Cellen kunnen worden gesuspendeerd in een 1: 1 trypaanblauw verdunning en telt en de levensvatbaarheid van inlichtingen zijn te verkrijgen op dit punt.

6. blokkeren en kleuring voor Flowcytometrische Analyse

1. Blok FcyRII / III receptoren op cellen die niet-specifiek antilichaam kleuring te voorkomen. Voor de hier beschreven experimenten, maak mastermengsels antilichaam in PBS met 2% FBS met 1: 100 verdunning van het ongeconjugeerde antilichaam tegen CD16 / 32 (2.4G2) te binden en blokkeren FcyRII / III-receptoren.
2. Incubate geblokkeerd cellen met geschikte mastermengsels van antilichamen tegen CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14) en Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5) en Brilliant Violet 510 levende / dode vlek dode cellen te identificeren. Gebruik alle antilichamen, hetzij op de verdunning aanbevolen door de fabrikanten of eerder geoptimaliseerd door onderzoekers. Voor de hier beschreven experimenten, gebruik maken van alle antilichamen bij 1: 100 verdunning.
3. Was de cellen en resuspendeer in 50 pl 1X PBS kleuring buffer met 2% FBS. Houd op ijs tot fluorescentie gegevens kunnen worden verkregen op een flowcytometer.
   Opmerking: Het is belangrijk om schadevergoeding parameters vooraf geoptimaliseerd met een lymfoïde weefsels en een gemeenschappelijke celoppervlak antigen (zoals CD4 of CD8) vóór verkrijging van fluorescentiegegevens.
4. Om het aantal cellen te verhogen voor downstream flowcytometrieanalyse, data verwerven van volledige monsters van gekleurde cellen.

7. Analyseer Flowcytometrie gegevens met behulp van standaard methoden om de onderstaande stappen Accomplish

1. Ten eerste poort op de lymfocyt regio de voorwaartse verstrooiing(gebied) by side scatter (gebied) plot.
2. Selecteer vervolgens enkele cellen met behulp van de voorwaartse verstrooiing (breedte) by side scatter (breedte), om te voorkomen dat het analyseren van wambuizen. Dit kan ook worden bereikt met een voorwaartse verstrooiing hoogte by side scatter hoogte plot.
3. Vervolgens poort aan afstamming (CD 11 b, CD 11 c en CD45R / B220) -negatieve en CD3-positieve gebeurtenissen uit te sluiten macrofagen, dendritische cellen en B-cellen, respectievelijk, en confine analyses de T-cel compartiment, als het doel is, als hier te beoordelen infiltrerende T-cellen.
4. Vervolgens poort op levende cellen die de live / dead vlek te sluiten.
5. Tot slot, poort aan de cel bevolking van belang (zie representatieve resultaten sectie).

Resultaten

Collagenase D behandelde miltcellen vertonen gelijkaardige niveaus van CD4 en CD8 α op T-cellen in vergelijking met media-behandelde controles
Ten eerste, de mogelijke gevolgen van collagenase D van de frequentie en oppervlakte overvloed aan afstamming en activatie merkers op T-cel subsets werden beoordeeld met behulp van secundaire lymfoïde weefsel als controle. Een suspensie van splenocyten verkregen uit ND4 muizen en gewassen 1...

Discussie

Het karakteriseren van veranderingen in de huid-ingezeten leukocyten in knaagdiermodellen van huidziekten, zoals atopische dermatitis of psoriasis is van belang voor het begrijpen van mechanistische verbindingen tussen inflammatoire cel instroom en de ziekte pathologie. Hier beschrijven we een voordelige techniek om leukocyten uit huidweefsel te isoleren met basisuitrusting gevonden in de meeste biomedisch onderzoek labs. Deze relatief snelle techniek vermijdt het gebruik van dure weefsel dissociatie machines en aangepa...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid	Sigma Aldrich	55021C	Bewaar steriel tot de dag van gebruik.
HEPES, ≥99.5% (titratiewaarde)	Sigma Aldrich	H3375
EDTA disodium zout oplossing	Sigma Aldrich	E7889	Bewaar steriel tot de dag van gebruik.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select	MidSci	S01520HI	Bewaar steriel tot de dag van gebruik.
Percoll, pH 8,5-9,5 (25°C)	Sigma Aldrich	P1644	Bewaar steriel. Percoll moet isotoniek worden gemaakt met steriele 10X PBS voor gebruik.
Trimmer Combo Kit	Kent Scientific	CL9990-1201	Gebruik de grotere trimmer voor het scheren van de flank en rug.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one	Sigma Aldrich	E0753-10G	Los op in 100% EtOH bij 50°C gedurende 15 minuten op een roterende plaat.
Gevlochten anti-muis CD16/CD32 (2.4G2)	Tonbo Biosciences	70-0161	Antilichaam gebruikt om niet-specifieke antilichaambinding te blokkeren tijdens antilichaamkleuring voor flowcytometrie
anti-CD3ε-BV650 (145-2C11)	Becton Dickinson	564378	Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)	eBioscience	47-0042-80	Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie
anti-CD8α-BV785 (53-6.7)	BioLegend	100749	Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)	eBioscience	48-0112-80	Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie
anti-CD11c-eFluor450 (N418)	eBioscience	48-0114-80	Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie
anti-CD44-BV711 (IM7)	Becton Dickinson	563971	Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie
anti-CD45-FITC (30-F11)	Tonbo Biosciences	35-0451-U025	Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)	eBioscience	48-0452-80	Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)	BioLegend	104431	Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)	BioLegend	108407	Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie
Ghost Dye-BV510	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Viabiliteitskleuring voor flowcytometrie
LSR Fortessa	Becton Dickinson	N/A	Celanalyzer (18 parameters)
Collagenase D van Clostridium histolyticum	Roche Applied Science	11088858001	Gebruik een lyofilisaat van het enzym in HBSS met phenol red, zonder calcium en zonder magnesium, opgelost tot 5 mg/ml, in porties van 1 ml.  Bewaar onmiddellijk bij -20°C gedurende maximaal zes maanden.
ND4 Zwitserse vrouwelijke muizen	Harlan	0-32	8-12 weken oud; conventioneel gehuisvest met vrije toegang tot voedsel en water en gebruikt volgens de IACUC-richtlijnen van Macalester College.