Onderzoek van eiwitten gebonden aan ontluikende DNA in zoogdiercellen met behulp van BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek

Samenvatting

In dit protocol beschrijven we een nieuwe BrdU-ChIP-Slot-Western techniek om eiwitten en histonmodificaties te onderzoeken die geassocieerd zijn met nieuw gesynthetiseerd of nagenoeg DNA.

Samenvatting

Histondeacetylase 1 en 2 (HDAC1,2) lokaliseren op de plaatsen van DNA-replicatie. In het vorige onderzoek met behulp van een selectieve remmer en een genetisch knockdown systeem, toonden wij nieuwe functies HDAC1,2 in replicatievork progressie en ontluikende chromatine onderhoud in zoogdiercellen. Daarnaast gebruikten we een BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek die chromatine immunoprecipitatie (ChIP) van broom-deoxyuridine (BrdU) -gemerkte DNA combineert met slot blot en westerse analyses kwantitatief eiwitten of histonmodificatie geassocieerd met ontluikende DNA meten.

Actief delende cellen werden behandeld met HDAC1,2 selectieve remmer of getransfecteerd met siRNA tegen HDAC1 en HDAC2 en nieuw gesynthetiseerde DNA werd gemerkt met thymidine analoge broomdeoxyuridine (BrdU). De BrdU labeling werd uitgevoerd op een tijdstip waarop er geen significant celcyclus of apoptose door het verlies van HDAC1,2 functies. Volgende lAbeling van cellen met BrdU, chromatine immunoprecipitatie (ChIP) van histonacetylering merken of de chromatine-remodeler werd uitgevoerd met specifieke antilichamen. BrdU-gelabelde DNA ingang en immunogeprecipiteerd (of chiped) DNA werd vervolgens door aanstippen op een membraan met het slot blot-techniek en geïmmobiliseerd met UV. De hoeveelheid DNA in elke ontluikende slot werd vervolgens kwantitatief bepaald met behulp van Western-analyse met een anti-BrdU-antilichaam. Het effect van het verlies van HDAC1,2 functies op het niveau van nieuw gesynthetiseerde DNA-geassocieerde histonacetylering merken en chromatine remodeler werd vervolgens bepaald door het normaliseren van de BrdU-ChIP signaal afkomstig van behandelde monsters naar de controlemonsters.

Inleiding

Defecte DNA herstel en / of DNA-replicatie zijn een belangrijke oorzaak van instabiliteit van het genoom, die celdood kunnen veroorzaken. Een enkele unrepaired double strand break voldoende is om celdood te ¹ veroorzaken. Chromatine organisatie transient gewijzigd tijdens zowel de replicatie en reparatie ^2,3 en niet epigenetische informatie behouden tijdens deze processen leidt tot een bedreiging voor de integriteit genoom. Verlies van HDAC3 of HDAC1,2 functie belemmert de S-fase progressie, DNA-replicatie en reparatie leidt tot genotoxische stress (DNA schade) en celdood ^4-9. Daarom is een praktische strategie om selectieve HDAC inhibitoren replicatie, reparatie en chromatine verstoren kankercellen en DNA-schade veroorzaken, wat weer kan stoppen de groei en celdood selectief snel groeiende kankercellen.

Tijdens de DNA-replicatie, wordt chromatine snel gedemonteerd en daarna weer in elkaar gezet na DNA-duplicatie. Nieuw synthesized histon H4 wordt geacetyleerd op K5 en K12 residuen (H4K5K12ac) en na depositie op chromatine, zijn ze snel gedeacetyleerd door histondeacetylasen (HDAC) ^10,11. Niet-cellen ontluikende chromatine integriteit van histondeacetylering handhaven kan leiden tot splitsing instorten, wat weer kan leiden tot DNA-schade en celdood. We hebben onlangs bleek dat de selectieve remming van HDAC1,2 verhoogt histonacetylering (H4K5ac, H4K12ac en H4K16ac) en remt SMARCA5 chromatine remodeler activiteit op ontluikende chromatine, die correleert met verminderde progressie replicatievork, verhoogde vork instorting en verhoogde replicatie stress-geïnduceerde DNA-schade ⁶ . Aldus kunnen HDAC remmer ontluikende chromatinestructuur te veranderen op DNA-schade en de dood veroorzaken zeer snel in kankercellen, omdat deze cellen snel cyclus en langs vele malen via de S-fase. Daarom is het belangrijk om te begrijpen hoe HDACs functie om histonacetylering en eiwitten bindi regulerenng DNA replicatie in zoogdiercellen te handhaven.

Om kwantitatief de hoeveelheid histonacetylering en SMARCA5 chromatine remodeler geassocieerd met ontluikende DNA tijdens de DNA-replicatie te meten, hebben we bedacht een aangepaste chip test genaamd de BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek. Na chromatine immunoprecipitatie (ChIP) van een gewenst proteïne of histonmodificatie de hoeveelheid ontluikende DNA (geëtiketteerd met thymidine analoog BrdU) in het ChIP monster kan worden gedetecteerd met Western analyse van BrdU gelabelde ChIP DNA overgebracht op een membraan met behulp van een Groef Blot apparaat. Met deze techniek hebben we aangetoond dat H4K16ac (een markering die deze chromatine verpakking) en ISWI familielid SMARCA5 (SWI / SNF gerelateerde matrix geassocieerde actine afhankelijke regulator van chromatine) chromatine remodeler geassocieerd met ontluikende DNA in S-fasecellen ^6. We vonden ook dat de ontluikende H4K16ac merk wordt gedeacetyleerd door HDAC1,2 tijdens de DNA-replicatie ^6. H4K16ac remtchromatine remodeler activiteit van het ISWI familielid SMARCA5 ^12. Vandaar dat het gebruik van de BrdU-CHIP-Slot-Westerse techniek konden we de functies voor HDAC1,2 bij het reguleren van chromatine remodeling tijdens de DNA-replicatie te sluiten. Vandaar dat de BrdU-ChIP-Slot-Western Blot techniek is een krachtige aanpak van de associatie en dissociatie dynamiek van eiwitten of hun post-translationele modificaties die zijn gebonden aan ontluikende DNA kwantitatief te meten.

Protocol

1. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) na BrdU Labeling

1. Kweek NIH3T3-cellen in de aanwezigheid van ofwel DMSO of HDAC1,2-selectieve inhibitors zoals eerder ⁶ beschreven.
2. Na behandeling met DMSO of HDAC1,2 selectieve remmers, voeg BrdU aan de cellen in een steriele weefselkweek kap. Incubeer 2 x 10 ⁶ NIH3T3-cellen uitgeplaat in 10 ml NIH3T3 media met een 20 pM eindconcentratie van broomdeoxyuridine (BrdU) gedurende 60 min in een steriele 37 ° C weefselkweek incubator.
3. Crosslink intracellulaire eiwitten aan DNA door formaldehyde direct toevoegen aan het kweekmedium in een eindconcentratie van 1%. Incubeer 2 x 10 ⁶ NIH3T3 cellen met formaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten op een schudapparaat.
4. Blus de verknoping door toevoeging van glycine tot een uiteindelijke concentratie van 125 mM. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op een shaker.
5. Verwijder het medium en cellen in PBS te verzamelen in een 15 ml centrifugebuis. Spin CELls bij 956 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Was de celpellet tweemaal met ijskoude PBS. Verwijder PBS uit de tube. Bewaar de verknoopte celpellet zonder PBS (het supernatans) bij -80 ° C tot gebruik.
6. Bereid het lysaat van de verknoopte celpellet door toevoeging van 500 pi FA140 buffer (50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 en 0,1% natriumdeoxycholaat) aangevuld met protease inhibitor cocktail.
7. Shear het chromatine door sonicating de monsters vijf keer bij 35% vermogen en met een 15 sec puls, 0,9 seconde aan en 0,1 seconde uit-instelling. Houd de buisjes op ijs na elke ronde van sonicatie verwarming van de monsters te voorkomen.
   1. Controleer de afschuiving op een DNA gel de afschuiving efficiëntie varieert tussen verschillende sonicators. Om sonicatie controleren, reverse verknoping door het toevoegen van NaCl tot een concentratie van 0,16 M en stappen 1.17.1 voeren. - 1.22. Run geëlueerde 10 pl DNA op een 1,5% agarose gel om te controleren of de afschuiving istussen 300 - 700 bp met een gemiddelde intensiteit van 500 bp.
8. Na sonicatie, centrifuge monsters gedurende 10 min bij 17.949 xg bij 4 ° C en breng het supernatans naar een nieuwe buis.
   1. Voer eiwit schatting met de commerciële eiwit assay kit volgens protocol van de fabrikant. Gebruik gelijke hoeveelheid lysaat voor de chip van de controle en experimentele monsters. In het algemeen, gebruik 1 mg totaal lysaat per chip reactie.
9. Bereid 50% suspensie van proteïne A-agarose gebruikt FA140 buffer bevattende proteaseremmer cocktail. Voeg 1/10 volume van de proteaseremmer cocktail. Bereken het volume kralen nodig op basis van het aantal monsters in totaal.
   1. Wash Proteïne A-agarose kralen met FA140 buffer tweemaal de opslagbuffer verwijderen en een gelijk volume aan FA140 buffer om de kralen tot 50% slurry te maken.
   2. Eiwitten die niet-specifiek binden aan de kralen te verwijderen, voeg 50 ul van 50% suspensie van proteïne A-agarose en incubate de monsters bij 4 ° C onder constant end-over-end rotatie in een rotisserie menger gedurende 30 min.
10. Spin de monsters bij 956 xg bij 4 ° C gedurende een minuut. Verzamel de bovenstaande vloeistof en uitvoeren immunoprecipitatie door toevoeging ofwel 8 pl H4K16ac antilichaam of 5 ui (5 ug) van 1 mg / ml SMARCA5 antilichaam aan het supernatant. Incubeer bij 4 ° CO / N met een constante end-over-end rotatie in een rotisserie mixer.
11. Opslaan 1 / 10e van het extract voor 'input' controle en instellen als terzijde bij -20 ° C. De ingang heeft reverse verknoopt met de IP samples worden.
12. Met evenveel konijnen IgG (5 ui 1 mg / ml) als negatieve controle immunoprecipitatie monster.
13. De volgende dag, toevoegen van 50 pl 50% proteïne A-agarose slurrie aan het extract en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C met rotatie.
14. Pellet agarose korrels door centrifugatie bij 956 xg gedurende 2 min bij 4 ° C, verwijder het supernatant en wash de kralen met de volgende buffers sequentieel. In buffer preparaten voeg proteaseremmers vlak voor gebruik.
    1. Wassen met laag zout immuuncomplex Wash Buffer (FA140; eindconcentratie van 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 en 0,1% natrium deoxycholaat) voor 5 min bij 4 ° C met eind-over-eind rotatie.
    2. Wassen met High Salt immuuncomplex Wash Buffer (FA500; eindconcentratie van 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 en 0,1% natrium deoxycholaat) voor 5 min bij 4 ° C met eind-over-eind rotatie.
    3. Wassen met LiCl immuuncomplex Wash Buffer (eindconcentratie van 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 250 mM LiCl, 0,5% NP40 en 0,5% natrium deoxycholaat) gedurende 5 min bij 4 ° C met eind-over-eind rotatie.
15. Na wassen zoals hierboven beschreven, voeg 200 ul elutieoplossing (eindconcentratie van 1% SDS en 100 mM natriumbicarbonaat) en incubate bij KT gedurende 15 min met end-over-end rotatie bij kamertemperatuur.
16. Spin de monsters bij 956 xg bij kamertemperatuur en breng het eluaat om een ​​nieuwe 1,5 ml buis. Herhaal stap 1,15 bijkomende 200 pl elutieoplossing.
17. Aan 400 pl van het eluaat, voeg NaCl tot een concentratie van 0,16 M en meng.
    1. Bovendien, voeg 400 ul elutieoplossing tot 10 gl ingang die is vernietigd (stap 1,11) en voeg NaCl tot een concentratie van 0,16 M tot verknopen ingangsmonsters omgekeerde ook. Omgekeerde verknopen de monsters door incubatie bij 65 ° C waterbad gedurende 5 uur.
18. Voeg 1 ml 100% EtOH omgekeerd-verknoopte eluaat. Goed mengen en incuberen bij -80 ° C gedurende 2 - 3 uur of bij -20 ° CO / N. Spin de monsters bij 17.949 g gedurende 15 min en gooi ethanol.
19. Voeg 800 ui 70% ethanol om de pellet te wassen. Spin bij 17.949 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en werp ethanol. Spin kort om alle resterende ethanol te verwijderen. Lucht-drogen van de monsters bij 37 ° C gedurende 10 min om achtergebleven ethanol te verwijderen.
20. Los DNA in 90 pl RNase en DNase-vrij water en voeg 2 ul 10 mg / ml RNase in een 0,2 mg / ml eindconcentratie. Incubeer bij 37 ° C in een waterbad gedurende 30 min.
21. Voeg 10 ul 10x Proteinase K Buffer (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 5% SDS). Meng goed en voeg 1 pl proteïnase K. Incubeer bij 42 ° C gedurende 1 uur.
22. Zuiver ingang en ChIP DNA met commerciële PCR zuivering kit volgens het protocol van de fabrikant en elueer DNA in 50 pl water. WINKEL DNA bij -20 ° C tot verder gebruik.

2. Slot Blot analyse van ChIP DNA

1. Meet de opbrengst invoer- en ChIP DNA geëlueerd in 50 pi water zoals beschreven in stap 1,22 met behulp van een spectrofotometer bij 280 nm volgens het protocol van de fabrikant.
2. Neem gelijke volumes (50 pl) van ingang of immunologisch neergeslagen DNA die binnen het lineaire traject van detectie.
   1. Bijvoorbeeld, als ingangDNA-opbrengst is 1,5 ng / ul, vervolgens 30 ul (of 45 ng totaal DNA) en maak het volume tot 50 pi met water. Voor factor ChIP, neem de volledige 50 ul eluaat van stap 2.1 en ga verder met stap 2.3.
3. Denatureren 50 gl input of immunologisch neergeslagen DNA door het toevoegen van 2,5 volumina 0,4 N NaOH kort vortex en centrifugeer 956 xg gedurende 10 sec, en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
4. Neutraliseer het gedenatureerde DNA door het toevoegen van 175 ui 1 M Tris-HCl, pH 6,8, vortex, centrifugeer 956 xg gedurende 10 seconden en zet de monsters op ijs.
5. Bereid een seriële verdunning van input en immunologisch neergeslagen DNA voor de Slot Blot analyse zoals hieronder beschreven.
   1. Volg stap 2,3 - 2,4 op een totaal monstervolume van 350 pi te krijgen (dat wil zeggen 50 ul Input / ChIP DNA, 125 ui 0,4 N NaOH, 175 ui 1 M Tris-HCl, pH 6,8).
      Opmerking: Voor boven de instantie aangegeven, zal 45 ng ingang DNA uiteindelijk 0,129 ng / ul.
   2. Voor input DNA, label drie buiss en 100, 50 en 25 en voeg 100 ul, 50 ul en 25 ul van het gedenatureerde en geneutraliseerde DNA monster. Maak de uiteindelijke volume tot 100 ul met nuclease-vrij water. Voor ChIP DNA, label drie buizen 200, 100 en 50 en voeg 200 ul, 100 pi en 50 pi van het gedenatureerde en geneutraliseerde DNA-monster. Maak uiteindelijke volume tot 200 ul met nuclease gratis water.
6. Knip het membraan om de grootte van het Slot Blot inrichting. Pre-nat het membraan en blotting papers in 20x SSC vóór en voorafgaand aan het toevoegen DNA. Monteer ze in de sleuf Blot volgens protocol van de fabrikant.
7. Pipet DNA uit stap 2.5.2 in de juiste sleuven. Breng vacuüm langzaam aan het DNA op de zeta-probe membraan trekken. Stop vacuüm nadat alle monsters door de apparatuur geleid.
   1. Demonteer de inrichting onmiddellijk immobiliseren van het DNA op het membraan met UV crosslinker. Hebben de DNA-kant naar boven in het UV crosslinker en het gebruik van de autocrosslink instelling in het verknopingsmiddel. Volg protocol van de fabrikant.
8. Detecteren BrdU het slot blot door het uitvoeren van western blotting.
   1. Blokkeer het membraan met 5% vetvrije droge melk in PBS met 0,1% Tween-20 (PBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur werd het niet-specifieke binding van antilichamen aan het membraan voorkomen.
   2. Add primaire anti-BrdU-antilichaam (1: 500 verdunning) verdund in 1% niet-vette droge melk in PBST en incubeer de blot met het primaire antilichaam gedurende 3 uur bij kamertemperatuur op een shaker. Was het membraan met PBST driemaal na het primaire antilichaam incubatie.
   3. Add HRP-geconjugeerd anti-muis secundair antilichaam aan de blot (1: 5000 verdunning) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was het membraan met PBST driemaal na het secundaire antilichaam incubatie.
      OPMERKING: Gebruik voldoende volume van de antilichamen volledig te bedekken het membraan tijdens de primaire en secundaire antilichaam incubaties.
9. Bereid de ECL mix en voeg deze toe aan de vlek acgens het protocol van de fabrikant. Incubeer het membraan met ECL mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   1. Plaats het membraan in een röntgencassette, het membraan naar de röntgenfilm bloot te stellen en te ontwikkelen met behulp blot protocol van de fabrikant.
   2. Kwantificeren van het verkregen signaal voor invoer en chiped DNA na het scannen van de blots met de Image J software volgens het protocol van de fabrikant. Voor kwantificering gebruikt het signaal dat binnen het lineaire traject van detectie teneinde de nauwkeurigheid van de meting te waarborgen.

Resultaten

Om de specificiteit van HDAC1,2-selectieve remmers te bepalen, werden Hdac1,2 ^{FL / FL} en Hdac3 ^{FL / FL} fibrosarcoomcellen gebruikt. Adenovirus-bevattende Cre recombinase (Ad-Cre) werd gebruikt om Hdac1,2 en Hdac3 verwijderen in deze cellen. Volgende Ad-Cre infectie van Hdac1,2 ^{FL / FL} cellen, een robuuste toename H4K5ac waargenomen. Behandeling van Hdac1,2 knockout cellen met 233 ...

Discussie

De in dit manuscript beschreven protocol is een relatief snelle methode om de aanwezigheid van eiwitten of hun post-translationeel gemodificeerde vormen van nieuw gerepliceerd of ontluikende DNA tonen. Bovendien, deze techniek maakt het mogelijk een aan de vereniging-dissociatie kinetiek van een eiwit of zijn gemodificeerde vorm met ontluikende DNA meten. Deze techniek is een aanvulling op de elegante iPOND technologie ^13. In de iPOND technologie, is nieuw gesynthetiseerde DNA gelabeld met ethyl deoxyuridine ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-BrdU (westerns)	BD Biosciences	B555627
Anti-SMARCA5	Abcam	ab3749
Anti-H4K16ac	Active Motif	39167
Zeta-Probe GT Membrane	Bio-Rad	162-0197
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
Protein A agarose	Millipore	16-156
Rnase A	Qiagen	19101
Proteinase K	Sigma	P4850
PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Glycine	Sigma	G7403
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
Rabbit IgG	Millipore	12-370
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB Corporation	19628
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium bicarbonate	Sigma	S-4019
Ethanol	Decon Laboratories	04-355-222
DEPC-treated water	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
Sodium hydroxide	Mallinckrodt GenAR	MAL7772-06
20x SSC	Life Technologies	15557-036
Non-fat dry milk	Lab Scientific Inc	M0841
ECL	Thermo Fisher	80196
X-ray film	Genesee Sci	30-101
Developer	Konica Minolta	SRX-101A
UV Crosslinker	Stratagene	XLE-1000
Sonicator	Branson Sonifier  Digital Ultrasonic Cell Disruptor	Model: 450
Centrifuge	Eppendorf	Model: 5810R
Water bath	Fisher Scientific Isotemp	Model: 2322
NanoDrop 1000 spectrophotometer	ThermoScientific	Model: 1000
Slot Blot apparatus	Schleicher and Schuell Minifold II	44-27570
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators