Method Article

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo's

DOI:

10.3791/53654

⸱

February 22nd, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Developmental Biology Program, Sloan Kettering Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol geeft een methode om kwantitatieve voeren, eencellige in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie bestuderen in de muis pre-implantatie embryo's. De voor het embryo, immunofluorescentie, imaging op een confocale microscoop, en het beeld segmentatie en analyse procedures worden beschreven. Deze werkwijze maakt kwantificering van de expressie van meerdere nucleaire markers en de ruimtelijke (XYZ) coördinaten van alle cellen in de embryo. Het maakt gebruik van MINS, een beeld segmentatie software tool speciaal ontwikkeld voor de analyse van confocale beelden van pre-implantatie embryo's en embryonale stamcellen (ESC) kolonies. MIN voert onbewaakte nucleaire segmentatie de X, Y en Z dimensies en verschaft informatie over de mobiele positie in de driedimensionale ruimte, en nucleaire fluorescentie niveaus voor alle kanalen met minimale gebruikersinvoer. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor de beeldanalysevan pre-implantatie fase muizenembryo's, kan het gemakkelijk worden aangepast aan de analyse van elke andere monsters vertonen een goede signaal-ruisverhouding en waar hoge nucleaire dichtheid vormt een hindernis voor beeldsegmentatie (bijv., expressie analyse van embryonale stamcel (ESC ) kolonies, differentiërende cellen in kweek, embryo's van andere species of trappen, etc.).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De muis pre-implantatie embryo een paradigma voor het ontstaan ​​en behoud van pluripotentie in vivo, evenals als model voor de studie die het lot specificatie en de novo epithelialisatie bij zoogdieren te bestuderen. De pre-implantatie stadia van de ontwikkeling van zoogdieren zijn toegewijd aan de oprichting van de drie cellijnen die deel uitmaken van de blastocyst, namelijk de pluripotente epiblast - en twee extra-embryonale lijnen, de trophectoderm (TE) en de - die heeft geleid tot de meeste somatische weefsels en kiemcellen geeft primitieve endoderm (pre) (Figuur 1A) 1,2. Dit protocol beschrijft de procedures om (1) ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethiek statement: Alle dierlijke werk, met inbegrip van veeteelt, het fokken en het offer werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite Memorial Sloan-Kettering Cancer Center's (IACUC), protocol # 03-12-017.

1. Embryo Collection

Opmerking: Alle dierlijke werkzaamheden moeten hebben van institutionele en lokale autoriteiten is goedgekeurd en voldoen aan de lokale en institutionele regels.

  1. Mate een maagd vrouwelijke muis met een vruchtbare hengst van het gewenste genotypes.
    Let op: Als het opzetten van natuurlijke dekkingen, het selec....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om data interpretatie en presentatie te vergemakkelijken, dient men de embryo's te beschadigen tijdens het verzamelen en manipuleren, zodat alle cellen en hun relatieve positie kan worden geanalyseerd Figuur 2A -. D toont voorbeelden van intacte blastocysten in verschillende fasen met een uitgezette holte. Mocht schade optreden, moet extra zorg worden genomen bij het analyseren en interpreteren van de resultaten.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft een methode om een ​​kwantitatieve analyse van whole-mount immunofluorescentie voeren op pre-implantatie stadium muizenembryo's. Een robuuste immunofluorescentie protocol 22 wordt gevolgd door een hoge resolutie, whole-mount confocale imaging en image segmentatie met behulp van een op maat gesneden stukje software 4. Terwijl de keuze van immunofluorescentie protocol is niet kritisch, vinden we de hier gepresenteerde 22 snel, betrouwbaar en stabiel sign.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The authors declare no conflicts of interest.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Embryo collection
Blunt probe for plug checkingRobozRS-9580
ForcepsRobozRS-4978
Surgery scissorsRobozRS-5910
Glass Pasteur pipettesFisher13-678-20C
Pre-assembled aspirator tube & mouthpieceSigmaA5177
Longer rubber tubingFisher14-178-2AA   
M2MilliporeMR-015-D
FHMMilliporeMR-024-D
Acid Tyrode's solutionMilliporeMR-004-D
Penicillin/StreptomycinGibco15140
Bovine Serum Albumin SigmaA9647
4-well platesNunc/Thermo-Fisher12-566-300   
Immunofluorescence
96-well U-bottom platesFisher14-245-73
Triton X-100SigmaT8787
GlycineSigmaG7403
Horse serumSigmaH0146
Primary antibodiesConcentration
CDX2BiogenexAM392-5M1:200
GATA6R&DAF17001:100
GATA4Santa Cruzsc-90531:100, 10 min fixation
GATA4Santa Cruzsc-12371:100, O/N fixation
SOX17R&DAF19241:100
NanogReproCELLRCAB0002P-F1:500
OCT4Santa Cruzsc-52791:100, 10 min to O/N fixation
DAB2BDBD-6104641:200
Secondary antibodiesLife TechnologiesVarious1:500
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
Imaging
35 mm glass-bottom dishesMatTekP35G-1.5-14-C
Segmentation
Computer running 64-bit Windows OSn/aVerify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports
MATLAB (software)Mathworksn/a
MINS (software)Freen/ahttp://katlab-tools.org

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
  2. Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Expression AnalysisMouse Preimplantation EmbryosConfocal Microscopy ImagingImage Segmentation AnalysisMINS Software ToolNuclear Marker QuantificationImmunofluorescence ProtocolEmbryo Collection ProcedureBlastocyst Isolation MethodSingle Cell Resolution

Related Articles