Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo's

Summary

Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.

Abstract

Dit protocol geeft een methode om kwantitatieve voeren, eencellige in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie bestuderen in de muis pre-implantatie embryo's. De voor het embryo, immunofluorescentie, imaging op een confocale microscoop, en het beeld segmentatie en analyse procedures worden beschreven. Deze werkwijze maakt kwantificering van de expressie van meerdere nucleaire markers en de ruimtelijke (XYZ) coördinaten van alle cellen in de embryo. Het maakt gebruik van MINS, een beeld segmentatie software tool speciaal ontwikkeld voor de analyse van confocale beelden van pre-implantatie embryo's en embryonale stamcellen (ESC) kolonies. MIN voert onbewaakte nucleaire segmentatie de X, Y en Z dimensies en verschaft informatie over de mobiele positie in de driedimensionale ruimte, en nucleaire fluorescentie niveaus voor alle kanalen met minimale gebruikersinvoer. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor de beeldanalysevan pre-implantatie fase muizenembryo's, kan het gemakkelijk worden aangepast aan de analyse van elke andere monsters vertonen een goede signaal-ruisverhouding en waar hoge nucleaire dichtheid vormt een hindernis voor beeldsegmentatie (bijv., expressie analyse van embryonale stamcel (ESC ) kolonies, differentiërende cellen in kweek, embryo's van andere species of trappen, etc.).

Introduction

De muis pre-implantatie embryo een paradigma voor het ontstaan ​​en behoud van pluripotentie in vivo, evenals als model voor de studie die het lot specificatie en de novo epithelialisatie bij zoogdieren te bestuderen. De pre-implantatie stadia van de ontwikkeling van zoogdieren zijn toegewijd aan de oprichting van de drie cellijnen die deel uitmaken van de blastocyst, namelijk de pluripotente epiblast - en twee extra-embryonale lijnen, de trophectoderm (TE) en de - die heeft geleid tot de meeste somatische weefsels en kiemcellen geeft primitieve endoderm (pre) (Figuur 1A) ^1,2. Dit protocol beschrijft de procedures om (1) de oogst en bevestig pre-implantatie stadium muizenembryo's, (2) het uitvoeren van immunofluorescentie om eiwitten van belang te labelen, (3) verrichten whole-mount beeldvorming met behulp van een confocale microscoop met-z snijden mogelijkheden en (4) het uitvoeren van nucleaire segmentatie van confocale beelden en de daarop volgende beeld kwantitatieve analyses. Deze leiding maakt tHij onpartijdige meting van eiwitniveaus voor toewijzing van cel identiteiten subpopulaties van cellen in situ karakteriseren. 4 dagen om de data-analyse (Figuur 1B) voor één nest (doorgaans tot 10 muizenembryo's), van embryo - Dit protocol kan in slechts 3 worden uitgevoerd. De gelijktijdige analyse van een aantal nesten zou de beeldvorming en data-analyse tijd last te verhogen, waardoor de totale lengte van het Protocol tot verlenging.

De pre-implantatie stadium muizenembryo is een experimenteel handelbaar systeem dat, gezien de geringe omvang en stereotiepe morfologie ^3, is zeer geschikt voor in toto beeldvorming van cellulaire processen met single-cell resolutie. Om een ​​onbevooroordeelde, systems-niveau analyse van een statistisch relevant aantal embryo's uit te voeren, een geautomatiseerde, kwantitatieve analyse pipeline is wenselijk. Echter, vanwege de hoge nucleaire dichtheid van de binnenste celmassa (ICM) van de blastocyst ( Figuur 1A, 2D), conventionele image segmentatie platforms niet aan voldoende nauwkeurigheid om een geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde workflow vestigen. Anderzijds, handmatige segmentatie nauwkeurig, maar niet de verwerking van grote cohorten van cellen en embryo toelaten, noch is het geschikt om reproduceerbare onpartijdige bepaling van cel identiteiten - wat vooral van belang bij de studie ontwikkelingsstadia waar het patroon van marker meningsuiting nog niet volledig opgelost (bijvoorbeeld, doe een binaire verdeling over een populatie vertonen). We hebben onlangs ontwikkeld en gevalideerd een beeld segmentatie methode op maat gemaakt voor de muis pre-implantatie embryo's en muis embryonale stamcellen (SER), die een hoge nauwkeurigheid bereikt, terwijl die een minimale input van de gebruiker ^4-8.

De analyse pipeline hier gepresenteerde draait om de MATLAB-gebaseerde beeld segmentatietool Modular Interactive Nuclear Segmentation (minuten) ^4. MINS performs onbewaakte nucleaire segmentatie op grote hoeveelheden confocale Z-stacks nadat de gebruiker zo min mogelijk beeld eigenschappen heeft vastgesteld met behulp van een grafische gebruikersinterface (GUI) (Tabel 1) ^4. Deze pijplijn is efficiënt gebleken voor het genereren van hoge doorvoer gegevens eiwitexpressie en cellen lokalisatie in zowel wildtype experimenteel behandelde en genetisch gemodificeerde embryo en SER ^5-7. In het huidige protocol beschrijven we de toepassing van minuten naar de segmentatie van pre-implantatie-embryo stadium beelden. Voor voorbeelden van MINS prestaties op sociaal-economische raden verwijzen wij u naar ^4,7. De geautomatiseerde nucleaire segmentatie stap vermindert de tijd last van de cel identificatieproces, terwijl de ruimtelijke en fluorescentie-intensiteit metingen laten een onbevooroordeelde bepaling van cel identiteiten en het genereren van driedimensionale kaarten van genexpressie domeinen en celpositie in het embryo (Figuur 1C ). Bovendien is de schaalbaarheid van deze werkstroom maakt het voor die analyse van afzonderlijke nesten door grote cohorten van experimenteel behandelde embryo of embryo's van verschillende genetische achtergronden ^5,6. MINS is vrij beschikbaar op http://katlab-tools.org (de software vereist een MATLAB-licentie).

Geen aanpak ontwikkeld tot op heden staat de vorming van dergelijke diepgaande gegevens over eiwit expressie en cel lokalisatie in de muis pre-implantatie embryo's. Alle pogingen tot nu toe bij het ​​kwantificeren van dit soort gegevens zijn beperkt tot het handmatig bepalen en kwantificering van de mobiele nummers voor verschillende populaties in het embryo (hetzij geheel handmatig of software-geassisteerde) ^9-19. Deze benadering (integratie van MINS software) is op maat gemaakt voor en getest op de muis pre-implantatie embryo's en SER; niettemin zijn prestaties op andere systemen met hoge dichtheid nucleaire, hoewel nog niet getest, wordt verwacht gelijkwaardig.

Protocol

Ethiek statement: Alle dierlijke werk, met inbegrip van veeteelt, het fokken en het offer werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite Memorial Sloan-Kettering Cancer Center's (IACUC), protocol # 03-12-017.

1. Embryo Collection

Opmerking: Alle dierlijke werkzaamheden moeten hebben van institutionele en lokale autoriteiten is goedgekeurd en voldoen aan de lokale en institutionele regels.

1. Mate een maagd vrouwelijke muis met een vruchtbare hengst van het gewenste genotypes.
   Let op: Als het opzetten van natuurlijke dekkingen, het selecteren van vrouwen in de estrus fase van het Estral cyclus verhoogt de kans op copulatie op de gewenste datum. Als het induceren van superovulatie, verwijzen wij u naar het ⁱⁿ 20 beschreven protocollen.
2. Controleer de aanwezigheid van een vaginale plug op de ochtend met een stompe sonde. Idealiter, doe dit voor de middag (12:00), als copulatie pluggen verloren gaan gedurende de dag. Overweeg noon van de detectie van de vaginale plug embryonale dag (E) 0.5.
3. Op de gewenste dag en tijd van de embryonale ontwikkeling, opwarmen M2 of spoelen met medium (FHM) tot kamertemperatuur of bij voorkeur 37 ° C. Opmerking: Ofwel M2 of FHM kan worden gebruikt voor het spoelen en behandeling embryo. Wanneer niet in gebruik, bewaar deze media bij 4 ºC. Schat de toepassing van ~ 2 ml medium per baarmoeder.
4. Ontdooi bevroren 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of bereiden wat verse oplossing. Schat 500 ul van 4% PFA-oplossing per putje van een 4-wells plaat. Fix één nest op elk putje van een 4-wells plaat. Opmerking: Als alternatief kan een 96-well plaat gebruikt om vast en slaan embryo. Bij gebruik van een 96-putjesplaat Gebruik 100 ul PFA-oplossing per putje.
5. Trek een glazen Pasteur pipet met behulp van een open vlam om een ​​capillair uiteinde aan het uiteinde te trekken.
6. Offer vrouwelijke door cervicale dislocatie of CO ₂ inhalatie, of zoals vereist door de lokale en institutionele regelgeving. Het is vaak desirable om euthanasie van het dier te bevestigen door cervicale dislocatie.
7. Spray buik van het dier met 70% ethanol om haarverlies te minimaliseren en uitvoeren van een abdominale incisie, eerst door de huid en vervolgens door de lichaamswand (peritoneum) om de ingewanden bloot te leggen.
   Let op: De volgende stappen beschrijven de procedure blastocysten uit de baarmoeder van een zwangere vrouwelijke muis te verzamelen in elk stadium tussen E3.25 en E4.5 (Figuur 1A). Voor protocollen op de collectie van pre-implantatie embryo's eerder dan E3.25, verwijzen naar ^20.
8. Zoek de baarmoeder en uit het dier. Die het cervicale uiteinde van de baarmoeder met een pincet, dwars door de baarmoederhals en trek voorzichtig beide uterine hoorns rekken.
9. Het vet uit de baarmoeder, het verzorgen van de baarmoederwand niet te doorboren. Dit kan gemakkelijk worden gedaan op de uitslag, terwijl het lichaam van het dier aangesloten, de uterus kan worden uitgestrekt. Als alternatief iskan later worden gedaan, onder een dissectie microscoop, in RT PBS. Voor een meer gedetailleerde protocol op dissectie van de baarmoeder, zie Protocols 5 & 8 ²⁰
10. boven de eileiders te snijden, onder de eierstokken, om de gehele baarmoeder, plaats uitbrengen op een petrischaal en bedek met PBS.
    Opmerking: Deze stap maakt het ook mogelijk het wassen van overtollige bloed of ander vuil uit de baarmoeder, die de daaropvolgende blastocyst oogsten vergemakkelijkt.
11. Aparte beide uterine hoorns door snijden door het proximale uiteinde, aan beide zijden van de cervix en gooi de baarmoederhals. Scheid de eileider van de uterus door het snijden onder de isthmus die hen (Figuur 1A) verbindt. Transfer beide hoorns tot een daling van manipulatie medium (ofwel M2 of FHM) voor het embryo en manipulatie.
12. Onder een dissectie microscoop, spoelen blastocysten uit de baarmoeder en in het medium door het forceren van 0,5-1 ml M2 of FHM door elke baarmoeder hoorn van de cervicale opening. Gebruik een 1ml spuit met een onderhuidse naald. Opmerking: De naald kan worden afgerond met een depot steen te scheuren de baarmoeders, hoewel dit niet kritisch. Een gedetailleerd schema voor de baarmoeder spoelen kan worden gevonden ⁱⁿ 21.
13. Met behulp van de dissectie microscoop, zoek de blastocysten, die gedurende de druppel medium zal verspreid worden. Het kan tot 1-2 min gedurende blastocysten zinken naar de bodem van de schaal na het spoelen. Via de mond gecontroleerde, glazen Pasteur pipet met een capillairuiteinde, verzamel blastocysten en overbrengen naar een nieuwe druppel media.
14. Spoel blastocysten door ze te verplaatsen door middel van 2-3 druppels vers M2 of FHM. Bewegen embryo in groepen van 5-10 blastocysten per keer.
    Opmerking: Bewegende grotere groepen op een bepaald moment zal het proces versnellen, maar het zal ook de kans op per ongeluk een groot aantal embryo's te verliezen. Als ongetrainde in het gebruik van mond gecontroleerde pipetten, oefenen embryomanipulatie en overdragen vóór b worden overwogeneginning het experiment.
15. Verwijder de zona pellucida (ZP) van uitgekomen blastocysten (meestal
16. Wees voorzichtig bij het hanteren van blootgelegde blastocysten, omdat ze heel gemakkelijk hechten aan glas en kunststof oppervlakken. Manipulation medium bevat 4 mg / ml runderserumalbumine (BSA) om aanhechting te voorkomen, maar zuur Tyrode of PBS niet derhalve het risico van beschadiging of verlies van de embryo's te verminderen niet opneemt dan 2-5 ontdaan blastocysten op een tijdstip waarop het manipuleren ze in BSA-vrij of serum-vrij PBS of zuur Tyrode.
    Opmerking: Als alternatief, laag de glazen pipet met 1% BSA voor gebruik om hechting van de embryo verminderen het glasoppervlak.

Smeer de bodem van elk putjeeen 4-well weefselkweekplaat met een laagje 1% agar, 0,9% NaCl voorkomen embryo hechten aan de kunststof. Alternatief wordt 4 mg / ml BSA voor het PBS (PBS-BSA).

Vul een putje van de beklede 4-well weefselkweekplaat met 500 pl RT PBS (of PBS-BSA) en andere goed met 500 pi 4% PFA in PBS.

Spoel blastocysten in RT PBS en fixeer 4% PFA in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Transfer naar PBS (of PBS-BSA) na fixatie.

Wanneer embryo zullen direct worden verwerkt, omvatten de PBS met de embryo's met een laag minerale olie om verdamping te voorkomen (wat leidt tot uitdroging van het monster) en bewaar de plaat bij 4 ° C.
Opmerking: Verschillende bevestigingsmethoden en tijden kunnen worden gebruikt afhankelijk van het experiment, de epitopen van belang en de antilichamen te gebruiken. Ongeacht de gekozen werkwijze, zijn consistent gelijk experimenten latere vergelijking van de kleuringen te vergemakkelijken.
Let op: Pauzepoint: Embryo's kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C in PBS tot enkele weken alvorens naar de volgende stap. Zorgen steriel PBS en / of voeg 100 U / ml penicilline + 100 pg / ml streptomycine (Pen-Strep) bacteriële contaminatie of vooruit te lopen langdurige opslag te voorkomen (vooral bij gebruik van PBS-BSA).

2. Immunofluorescentie

1. Voer immunofluorescentie met behulp van een protocol dat eerder werd getest en bewezen robuuste voor de hele-mount immunofluorescentie te zijn. Opmerking: We raden die ⁱⁿ 22 ^en 11 beschreven. In dit artikel de voormalige zal worden beschreven. Ongeacht de gekozen werkwijze, zijn consistent gelijk experimenten aan vergelijking van de kleuringen te vergemakkelijken.
2. Gebruik van een flexibel, polyvinyl, heldere, U-bodem 96-well plaat de opeenvolgende stappen van de immunofluorescentie protocol uit te voeren. Vul elk putje met 50 - 100 pi oplossing en verplaatsen embryos uit één oplossingnaar het andere met een L-vormige mondpipet. Opmerking Deze benadering minimaliseert het gebruik van de reagentia en vergemakkelijkt het bijhouden stappen en de parallelle kleuring van verschillende experimentele groepen.
   1. Optioneel: Smeer de bodem van de putjes met een dun laagje 1% agar, 0,9% NaCl om de hechting van embryo aan de kunststof te voorkomen. Niet BSA om immunofluorescentie oplossingen toe te voegen.
3. Bereid PBX (0,1% Triton X-100 in PBS). Als anticiperen op de prestaties van de verschillende immunofluorescentie experimenten, voor te bereiden 50 ml van PBX en bewaar bij 4 ºC tussen experimenten.
4. Bereid permeabilisatie oplossing (0,5% Triton X-100, 100 mM glycine in PBS). Maak 1 ml (of welke hoeveelheid nodig) verse permeabilisatie oplossing voor elk experiment.
5. Bereid blokkeeroplossing (2% paardenserum (HS) of 20% foetaal runderserum (FBS) met Pen-Strep in PBS). Bereid 10 ml en bewaar bij 4 ºC tussen experimenten.
   1. Geen verschillen waargenomen tussen ofweltype serum evenwel consistent bij de keuze van de blokkerende oplossing voor Overeenkomstige experimenten.
6. Spoel vaste embryo gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in PBX (~ 100 pi).
7. Doorlaatbaar embryo gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in permeabilisatie oplossing (~ 100 pi).
8. Spoel embryo gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in PBX (~ 100 pi).
9. Blok embryo's 30 minuten tot 1 uur bij kamertemperatuur in -100 pl blokkeeroplossing. Bedek de oplossing met een laag minerale olie om verdamping te voorkomen of te houden in een bevochtigde kamer.
   Let op: Embryo's kunnen worden geblokkeerd tot O / N perioden bij 4 ºC zonder merkbare verbetering of nadeel in vergelijking met 30 min blokkeren stappen.
10. Incubeer embryo O / N bij 4 ºC in het primair antilichaam / antilichamen verdund in het blokkeren van oplossing (~ 100 pi). Bedek de oplossing met een laag minerale olie om verdamping te voorkomen of te houden in een bevochtigde kamer.
    1. Bepaal optimale verdunning voor elke primaire antilichaam vooraf. Zie discussion and Materials sectie voor geteste verdunningen van een aantal antilichamen.
11. Na O / N incubatie, spoelen embryo 3x gedurende 5 min elk bij kamertemperatuur in PBX (~ 100 pi).
12. Blok embryo's 30 minuten tot 1 uur bij kamertemperatuur in -100 pl blokkeeroplossing. Bedek de oplossing met een laag minerale olie om verdamping te voorkomen of te houden in een bevochtigde kamer.
13. Incubeer embryo gedurende 1-2 uur bij 4 ° C in secundair antilichaam / antilichamen verdund tot 4 ug / ml in ~ 100 ul van blokkeeroplossing. Bedek de oplossing met een laag minerale olie om verdamping te voorkomen of te houden in een bevochtigde kamer.
14. Spoel embryo 2x 5 min elk bij RT in PBX.
15. Verplaats embryo's de voorkeur DNA vlek. Bij gebruik van Hoechst 33342, verdund tot 5 ug / ml in PBS. Bedek de oplossing met een laag minerale olie om verdamping te voorkomen of te houden in een bevochtigde kamer.
    Let op: Pauze punt: Als embryo's worden niet direct in beeld wordt gebracht, kunnen ze voor u worden bewaardp tot enkele weken in nucleaire kleuroplossing. In dit geval zorgen steriel PBS en / of voeg Pen-Strep of natriumazide bacteriegroei en besmetting te voorkomen.

3. Confocale Imaging

Opmerking: Individuele confocale microscoop configuraties specifieke opnameparameters moeten worden aangepast voor het systeem en software plaats. Echter, de volgende sectie bevat een aantal algemene regels te volgen die van toepassing zijn op een bepaalde installatie zou moeten zijn.

1. Met behulp van een fijne mond pipet, maken microdruppels PBS of nucleaire oplossing vlek op het glazen oppervlak van een 35mm glazen bodem schaal en bedek met minerale olie. Als alternatief, gebruik dan een gewone dekglaasje met silicone separatoren om beschadiging van de embryo's en dek af met een glas microscoopglaasje. Opmerking: Bij gebruik van een gewone dekglaasje, embryo's kunnen niet worden vervolgens geherpositioneerd of teruggewonnen voor genotypering, daarom raden wij het gebruik van glas-bottomgerechten.
2. Plaats embryo in de microdruppels en regelen op een consistente wijze, bij voorkeur met de ICM-holte evenwijdig aan het glasoppervlak. Opgericht schotel op de microscoop houder. Opmerking: Beelden verkregen op laser scanning confocale microscoop last hebben van een Z-as-geassocieerde verlies van fluorescentie-intensiteit. Daarom is de samenhang van de regeling is van belang voor het vergelijken van intensiteiten tussen gelijkwaardige gebieden op verschillende embryo's.
3. Opzetten verwijzing parameters met behulp van wild-type embryo's die niet onderworpen zijn aan enige vorm van behandeling die genexpressie kunnen veranderen zijn geweest.
   1. Afbeeldingen ophalen met een sterke vergroting doelstelling (dwz 40X of hoger) om gegevens die nauwkeurige segmentatie met het gereedschap MIN ⁴ vergemakkelijkt verkrijgen.
      Opmerking: Het gebruik van de digitale zoom op een 20x doelstelling zal geen afbeeldingen van voldoende resolutie voor segmentatie gebruik MINS opleveren. Men moet er ook rekening mee de werkafstand (WD) van de doelstelling, zoals het hoortvoldoende om de verwerving van een Z-stack die een hele blastocyst omspant, dus een lange WD toestaan ​​(~ 130-150 pm) doel is meestal niet nodig. De in de figuren 2 images - 4 werden verkregen onder toepassing van een 40X / NA 1,30 olie-immersie objectief met een werkafstand van 210 urn.
   2. Met de laagste laseruitvoer dat een sterk signaal-ruisverhouding verschaft zonder bleken van de fluoroforen.
   3. Stel de gain en offset om een ​​zo breed dynamisch bereik te verkrijgen zonder overbelichting het monster. Blootstellen van de afbeeldingen om het grootste deel van, of overspannen de gehele, grijswaardegebied zal het opsporen van kleine verschillen in intensiteit tussen de beelden te vergemakkelijken.
   4. Gebruik een klein (1 micrometer) Z-stap, aangezien de Z-as resolutie is van cruciaal belang voor een nauwkeurige segmentatie met minuten.
      Opmerking: XY afmetingen hebben geen invloed op de nucleaire segmentatie proces, alleen de grootte van het beeldbestand. In het algemeen, 512 x 512 pixels is voldoende XY resolutie voor publicatie-kwaliteit foto's zonder compromizingen harde schijf ruimte.
   5. Kritische stap: Laat beeldvormingsparameters consistenter en tussen beeldvorming zittingen van hetzelfde experiment om monsters te kunnen vergelijken.
4. Beeldvorming batches van embryo's:
   1. Afbeelding samenhangende groepen (nesten, experimenten) in één sessie waar mogelijk.
   2. Houd parameters consistente binnen en tussen de beeldvorming sessies voor herhalingen van hetzelfde experiment.
   3. Afbeelding embryo gedurende (gehele Z-as) voor elke cel vangen.
      Opmerking: Indien gewenst kunnen embryo genotypering worden uitgevoerd na beeldvorming zoals beschreven in ^23. De noodzaak van geneste PCR moet empirisch worden bepaald en hangt af van de locus te analyseren en de primers.
5. Zorg ervoor dat u in staat zijn om embryo's met terugwerkende kracht aan te passen aan beelden.

4. Beeldanalyse en Data voorverwerking

1. Download en MINS ⁴ installeren vanaf http: // Katlab-tools.org (MATLAB licentie vereist).
2. Voer image segmentatie:
   1. Volg de grafische gebruikersinterface (GUI) van minuten om een ​​confocale afbeelding te laden of te stapelen van de harde schijf, op te sporen de kernen en het segment van de afbeelding. Laad de gehele Z-stack ruwe gegevens die door de microscoop (.lsm, .lif, .oif, etc.). Zie tabel 2 voor meer informatie over elke stap en instructies vinden op http://katlab-tools.org ^en 4. Eenmaal voltooid, zien de uitkomst van elke stap door te klikken op de bijbehorende knop 'Beeld'. Een gele markering boven de knop geeft operatie in proces, een groene markering geeft aan operatie voltooid.
      Opmerking: MINS ondersteunt momenteel geen .czi bestanden, .tiff sequenties of multi-positie files - elke Z-stack nodig heeft om een ​​onafhankelijk bestand.
   2. Na bevredigende segmentatie, sparen de pijpleiding gemaakt, zodat deze direct voor de andere embryo's of nesten worden gebruikt.
3. Batch-modus segmentatie:
   Opmerking: Single bestanden kunnen individueel worden gesegmenteerd. Aangezien embryo binnen een strooisel of experiment zijn algemeen vergelijkbaar stadium kan mins De segmentering pijpleiding gemaakt voor één opname toepassen op een groep daarvan zonder toezicht.
   1. Vanuit het menu Batch-modus uit te voeren, klikt u op 'Add files' en laad alle bestanden moeten worden verwerkt in een keer. Opmerking: Bestanden van verschillende bronnen kunnen worden toegevoegd aan de wachtrij segmentatie.
   2. Klik op 'Start Batch-modus Run' en laat het tijd voor de software om de bestanden te verwerken. Opmerking: Segmentatie output zal in dezelfde map waar de originele bestanden, waar gevestigd worden opgeslagen.
4. Segmentatie evaluatie en handmatige correctie
   Opmerking: MINS segmenten beelden met zeer hoge nauwkeurigheid (> 85%), maar de kwaliteit van de kleuring en beeldvorming, en het stadium van het embryo, kunnen MIN prestaties beïnvloeden. In het algemeen, hoe hoger de nucleaire densiteit binnen het embryo, hoe waarschijnlijker segmentatie fouten nemen place (figuur 2D, 3). Daarom moet de nauwkeurigheid segmentatie worden geëvalueerd voor elk monster en handmatig gecorrigeerd indien nodig. Twee soorten fouten typisch voorkomen: over-segmentatie en onder-segmentatie.
   1. Het oplossen van over-segmentatie:
      1. Identificeer valse positieven - apoptotische vesicles (figuur 3A a, b, d, sterretjes) of andere elementen die geen intacte kernen maar die kunnen zijn gekenmerkt met MIN.
         Opmerking: In het algemeen zulke valse positieven hebben een kleinere afmeting dan echte kernen en kunnen in de meeste gevallen gemakkelijk worden geïdentificeerd en gesorteerd op het werkblad. Echter visueel onderzoek sterk aanbevolen, vaak kernen slechts gedeeltelijk gesegmenteerd, wat resulteert in een kleinere, maar geldige gesegmenteerde volume (figuur 3A b, pijlpunt).
      2. Verwijder de overeenkomstige records voor valse positieven uit het * statistics.csv bestand. Het behoud van de oorspronkelijke * statistiekenCSV-bestand voor toekomstig gebruik en bewerken van slechts een kopie ervan.
      3. Als een kern is al meer dan-gesegmenteerd en gepresenteerd als 2 of meer kernen (figuur 3A c, pijl en pijlpunten), ofwel het samenvoegen van de platen door het gemiddelde van de intensiteit niveau of, indien soortgelijke, houdt één van de records voor die cel en gooi de rest.
   2. Het oplossen van under-segmentatie:
      1. Gebeurtenissen identificeren wanneer MINS heeft nagelaten de grens te detecteren tussen twee of meer kernen en derhalve gesegmenteerd ze als één nucleus (figuur 3A d, pijl en 3B). Opmerking: Dit vormt een probleem voor een nauwkeurig celtelling, maar nog belangrijker, voor het kwantificeren eiwitniveaus als de gemeten gemiddelde van de cellen die foutief zijn samengevoegd wordt, en die kunnen behoren tot verschillende geslachten.
      2. Identificeer evenementen waar MINS heeft nagelaten een kern helemaal op te sporen.
      3. In deze gevallen (4.4.2.1 en 4.4.2.2), meet de gemiddelde grijze niveau fof elk kanaal in de onder- of niet-gesegmenteerde cel (s) met behulp van een alternatieve tool, zoals ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), en vervang de verkeerde record met de juiste niveaus. Het behoud van de oorspronkelijke * statistics.csv bestand voor toekomstig gebruik en slechts een kopie van het te bewerken. Om dit te doen met behulp van ImageJ als volgt te werk:
         1. Open de relevante multi-channel-stack op ImageJ en importeer de bijbehorende * overlaid.tiff bestand gegenereerd door MINS als een virtuele stack ( 'Bestand'> 'Import'> 'TIFF virtuele stack ...').
         2. Vind een mediale deel van de onder- of niet-gesegmenteerde kern.
         3. Met behulp van de vrije hand selectie gereedschap een overzicht van de perimeter van de onder- of niet-gesegmenteerde kern op het DNA vlek kanaal.
         4. Druk Crl + M (Cmd + M op een Macintosh) of ga naar het menu Analyseren en selecteer 'Measure'. Deze actie zal de gemiddelde grijswaarde voor de geschetste gebied opnemen en zal het weer te geven op een nieuw venster. Ga naar 'Analyze'>9; Set metingen ... 'en zorg ervoor dat' Mean grijswaarde 'is geselecteerd. Selecteer desgewenst nog andere parameters te meten.
         5. Met dezelfde zone beschreven in stap 4.4.2.3.3 moet de meting herhaald voor elk van de fluorescentie kanalen plaats. De resultaten zullen worden toegevoegd aan de vorige op het venster van de metingen 'Results'.
         6. Gebruik de verkregen metingen om de foutieve records in de * statistics.csv bestand te vervangen. Als de kern niet was gesegmenteerd, plaatst u een nieuwe rij, toewijzen van een nieuwe Cell ID en de waarden verkregen in ImageJ in het kader van de overeenkomstige kolom voor elk kanaal in te voeren. Deze cel zal geen ruimtelijke coördinaten (X, Y en Z-waarden). Als de kern was undersegmented, dupliceren de rij, verschillende Cell-ID's toe te wijzen aan elke nieuwe cel en de waarden verkregen in ImageJ in het kader van de overeenkomstige kolom te introduceren. In dit geval zullen beide cellen ruimtelijke coördinaten delen.
            Let op: Als de ruimtelijke verdeling te analyseren, we recommend exclusief de XYZ coördinaten van deze cellen, aangezien zij overlappen. Hiertoe wanneer u nieuwe records toewijzen cel IDs aan hen die gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van de oorspronkelijke (bijvoorbeeld niet-gehele getallen).
   3. Score delende cellen. Opmerking: MINS detecteert mitotische en interfase kernen, maar kan niet onderscheiden.
      1. Als mitotische kernen zijn afzonderlijk in de analyse worden beschouwd, met de hand van deze score en voeg deze informatie aan het gegevensbestand. Om mitotische cellen opnemen, voegt een nieuwe variabele (kolom) naar de * statistics.csv gegevensbestand en wijs verschillende waarden aan de mitose en de kernen.
5. Data voorverwerking.
   Let op: Zodra de spreadsheets zijn gecorrigeerd voor over- en onder-segmentatie zijn ze klaar om te worden geanalyseerd. Het analyseproces en presentatie van gegevens is afhankelijk van het specifieke experiment. Echter, hieronder zijn een aantal algemene gegevens transformatiesWe raden aan om voorafgaand aan de analyse:
   1. Transformeer de fluorescentie-intensiteit waarden in hun logaritme of vierkantswortel van de spreiding van de gegevens te verminderen. Dit helpt ook visualisatie, de ruwe data neiging zich te concentreren bij de assen van de grafiek (zie Figuur 4B, C).
   2. Corrigeer de Z-geassocieerde verzwakking van fluorescentie:
      Opmerking: Fluorescentie intensiteit laser scanning confocale microscopie beelden vermindert de dieper op de Z-as een segment ligt (figuur 4E, F).
      1. Als een van de gedetecteerde epitopen in de monsters is een alomtegenwoordig en homogeen uitgedrukt housekeeping nucleaire marker, normaliseren de fluorescentie-intensiteiten van de andere epitopen die door hun delen in elke cel door de overeenkomstige waarde van de huishouding marker.
      2. Bij het ontbreken van een dergelijke verwijzing marker, compensatie-Z geassocieerd verlies van fluorescentie op de volgende wijze:
         1. Zet de waarden van elke marker (Yplot samen de waarden voor alle controle, wildtype embryo's (Figuur 4F) - as van de grafiek) over de Z-positie (X-as van de grafiek) om de afname in intensiteit in Z visualiseren.
         2. Breng een lineair model (regressie curve) om het diagram verkregen in de voorgaande stap (intensiteitswaarden boven Z) voor elke markering (Figuur 4F).
         3. Corrigeer alle waarden voor elke merker volgens de volgende formule:
            log (oorspronkelijke waarde) + Z * hellingsgraad van het model (figuur 4D, G).
            Opmerking: De specifieke stappen om deze correctie is afhankelijk van de gebruikte analysesoftware (R, MATLAB) verlenen. Bij gebruik van R, voert u de volgende formule om een ​​lineair model om de gegevens te passen:
            > Lm (log (kanaal) ~ Z, data = dataframe)
            wanneer het kanaal fluorescentie kanaal te corrigeren, Z is de Z-coördinaat en dataframe is de tabel met de waarden voor de gewenste embryo (s) (de * statistics.csv bestand gegenereerd door minuten of een wijziging van het).
            Opmerking: De output van de bovenstaande formule de volgende format:
            (Intercept) Z
            4,76373 -0,01947
            wanneer de waarde Z is de helling van de regressielijn voor die gegevensreeks, welke absolute waarde moet worden gebruikt om de oorspronkelijke waarde van de formule in 4.5.2.2.3 wijzigen (zie Figuur 4G voor een voorbeeld).

Results

Om data interpretatie en presentatie te vergemakkelijken, dient men de embryo's te beschadigen tijdens het verzamelen en manipuleren, zodat alle cellen en hun relatieve positie kan worden geanalyseerd Figuur 2A -. D toont voorbeelden van intacte blastocysten in verschillende fasen met een uitgezette holte. Mocht schade optreden, moet extra zorg worden genomen bij het analyseren en interpreteren van de resultaten.

Discussion

Het huidige protocol beschrijft een methode om een ​​kwantitatieve analyse van whole-mount immunofluorescentie voeren op pre-implantatie stadium muizenembryo's. Een robuuste immunofluorescentie protocol ²² wordt gevolgd door een hoge resolutie, whole-mount confocale imaging en image segmentatie met behulp van een op maat gesneden stukje software ^4. Terwijl de keuze van immunofluorescentie protocol is niet kritisch, vinden we de hier gepresenteerde ²² snel, betrouwbaar en stabiel sign...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Embryo collectie
Blunt sonde voor plug controle	Roboz	RS-9580
Pincet	Roboz	RS-4978
Operatie schaar	Roboz	RS-5910
Glass Pasteur pipetten	Fisher	13-678-20C
Voorassemblage aspiratorbuis & mondstuk	Sigma	A5177
Langer rubberen slang	Fisher	14-178-2AA
M2	Millipore	MR-015-D
FHM	Millipore	MR-024-D
Acid Tyrode's oplossing	Millipore	MR-004-D
Penicilline/Streptomycine	Gibco	15140
Bovine Serum Albumine	Sigma	A9647
4-well platen	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
Immunofluorescence
96-well U-bodem platen	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
Glycine	Sigma	G7403
Paarden serum	Sigma	H0146
Primaire antilichamen			Concentratie
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1:200
GATA6	R&D	AF1700	1:100
GATA4	Santa Cruz	sc-9053	1:100, 10 min fixatie
GATA4	Santa Cruz	sc-1237	1:100, O/N fixatie
SOX17	R&D	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4	Santa Cruz	sc-5279	1:100, 10 min tot O/N fixatie
DAB2	BD	BD-610464	1:200
Secundaire antilichamen	Life Technologies	Various	1:500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
Beeldvorming
35 mm glazen bodem schalen	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentatie
Computer met 64-bit Windows OS		n/a	Controleer minimale systeemvereisten op http://katlab-tools.org en in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports
MATLAB (software)	Mathworks	n/a
MINS (software)	Gratis	n/a	http://katlab-tools.org