Ontwikkeling van een Alpha-synucleïne Based ratmodel van de ziekte van Parkinson via stereotactische injectie van een recombinant adeno-geassocieerde virale vector

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft hoe virale vector-gemedieerde lokale gen-levering een aantrekkelijke manier biedt om transgenen in het centrale zenuwstelsel tot expressie te brengen. Het protocol schetst alle cruciale stappen om een injectie met een virologisch vector uit te voeren in de substantia nigra van de rat om een op een virologisch vector gebaseerd diermodel voor de ziekte van Parkinson te ontwikkelen.

Samenvatting

Om de moleculaire wegen van de ziekte van Parkinson (PD) onderzoeken en om nieuwe therapeutische strategieën, wetenschappelijke onderzoekers afhankelijk diermodellen. De identificatie van PD-geassocieerde genen heeft geleid tot de ontwikkeling van genetische PD modellen. De meeste transgene α-SYN muismodellen te ontwikkelen geleidelijke α-SYN pathologie, maar niet om duidelijke dopaminerge cel verlies en dopamine-afhankelijke behavioral tekorten weer te geven. Deze hindernis werd overwonnen door directe targeting van de substantia nigra met virale vectoren overexpressie-PD-geassocieerde genen. Lokale genafgifte via virale vectoren verschaft een aantrekkelijke manier om transgenen in het centrale zenuwstelsel tot expressie. Specifieke hersengebieden kan worden getarget (bijvoorbeeld de substantia nigra) kan expressie worden geïnduceerd in het volwassen omgeving en hoge expressieniveaus kunnen worden bereikt. Verder kunnen verschillende vector op basis van verschillende virussen worden gebruikt. Het protocol beschrijft alle cruciale stappen om een ​​virale vector uit te voereninjectie in de substantia nigra van de rat een virale vector gebaseerde alpha-synuclein diermodel voor de ziekte van Parkinson te ontwikkelen.

Inleiding

Om de pathofysiologie van PD te bestuderen en om nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen, is er een dringende behoefte aan diermodellen die sterk lijken op de neuropathologie, fysiologie en motorische symptomen van de menselijke PD. Hoe hoger de voorspellende waarde, hoe beter we nieuwe therapieën van diermodellen vertalen naar patiënten.

De ontdekking van alfa-synucleïne (α-SYN) als eerste PARK gen 1997 geleid tot de ontwikkeling van de eerste genetische PD modellen. Veel transgene muizen overexpressie menselijk wild-type (WT) of mutant (A30P, A53T) α-SYN zijn gegenereerd in het afgelopen decennium. De niveaus van α-SYN overexpressie hebben bewezen cruciaal in de ontwikkeling van de pathologie zijn. Ook de muizenstam, de aanwezigheid of afwezigheid van endogene α-SYN en of de volledige lengte of een afgeknotte vorm wordt uitgedrukt, speelt een rol (gedetailleerd overzicht van Magen en Chesselet ^1). Overexpressie van zowel WT en verscheidene klinische mutanten van humaan &# 945; -SYN in transgene muizen leidt tot pathologische accumulatie van α-SYN en neuronale dysfunctie ^2-6. Echter, tot nu toe de meeste transgene α-SYN muismodellen geen duidelijke dopaminerge cel verlies en dopamine-afhankelijke behavioral tekorten weer te geven.

Deze hindernis werd overwonnen door directe targeting van de substantia nigra (SN) met virale vectoren overexpressie α-SYN. Virale vectoren zijn afgeleid van virussen die gemakkelijk cellen kunnen infecteren, genetisch materiaal in hun gastheergenoom en dwingen de gastheercel het virale genoom repliceren om nieuwe virusdeeltjes produceren. Virussen kunnen worden gemanipuleerd om niet-replicerende virale vectoren op hun vermogen om in cellen en genen te introduceren behouden. Door schrapping delen van het virale genoom en te vervangen door de genen van belang, zal de toepassing van de vector tot een enkele ronde infectie zonder replicatie in de gastheercel, algemeen aangeduid als "transductie". Virale vectoren ceen worden gebruikt voor overexpressie en silencing. De expressie transgen kan een reporter proteïne (bv groen fluorescerend eiwit of vuurvlieg luciferase) ^7, een therapeutisch eiwit voor gentherapie toepassingen of ^8-10, zoals we zullen zich in dit papier, een ziekte gerelateerd eiwit dat voor ziektemodel ^{11 -14.}

Virale vector gemedieerde genafgifte verschaft een alternatieve manier om transgenen in het CNS tot expressie met een aantal voordelen. Met behulp van lokale transgene levering kunnen specifieke hersengebieden worden gericht. Verder kunnen transgene expressie worden geïnduceerd tijdens de volwassenheid minder kans op compensatiemechanismen tijdens de ontwikkeling. Ook kunnen modellen worden gemaakt in verschillende soorten en rassen. En ten slotte, verschillende transgenen kan gemakkelijk gecombineerd worden. Gebruik virale vectoren, kunnen hoge transgenexpressie niveaus worden bereikt, die cruciaal zou kunnen zijn aangezien het begin van de ziekte en de ernst vaak afhangen van de mate van OVEREXPression.

Verschillende vectorsystemen basis van verschillende virussen ontwikkeld. De keuze van de vector is afhankelijk van de grootte van het gen van belang, de gewenste duur van de genexpressie, de doelcel en bioveiligheidsimplicaties. Voor stabiele genoverdracht in de hersenen, lentivirale (LV) en recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) vectoren worden nu beschouwd als de vectorsystemen gekozen aangezien ze de efficiënte en langdurige genexpressie in de hersenen van knaagdieren. Voor specifieke targeting van de dopaminerge neuronen (DN) van de SN, hebben rAAV vectoren geleidelijk weggeconcurreerd LV vectoren vanwege hun hogere titers en transductie efficiëntie van DN.

De beste α-SYN gebaseerde knaagdiermodellen momenteel beschikbaar zijn ontwikkeld vanuit een gecombineerde benadering, waarbij nieuwere AAV serotypes (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) en geoptimaliseerde vector constructen titers en zuiverheid ^15,16. De vector titer evenals de vector zuiverheid directe invloedde fenotypische uitkomst van het model. Overmatig vector titers of onvoldoende gezuiverd vector partijen kan leiden tot niet-specifieke toxiciteit. Daarom passende controlevectoren onontbeerlijk. Geruime tijd investeringen in de virale vector productie, opschaling en procedures zuivering hebben ook bewezen dat het essentieel om reproduceerbare en hoge kwaliteit vector batches te verkrijgen.

Protocol

Alle dierproeven worden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen richtlijn van de Raad van 24 november 1986 (86/609 / EEG) zijn goedgekeurd door de bio-ethische commissie van de Universiteit van Leuven (België).

1. Recombinant AAV productie en zuivering

Opmerking: rAAV vector productie en zuivering werd uitgevoerd door Leuven Viral Vector Core (LVVC) zoals eerder beschreven ^17.

1. In het kort transfecteren subconfluente laag (<50) doorgang hechtende HEK 293T cellen met een 25kD lineaire polyethyleenimine 150 nM NaCl transfectieoplossing en drie verschillende plasmiden in een verhouding van 1: 1: 1 in DMEM medium 2% foetaal runderserum. Na 24 uur incubatie bij 37 ° C in een 5% CO ₂ Vervang het medium met vers DMEM medium 2% foetaal runderserum.
   Noot: De plasmiden bevatten de constructen voor AAV7 serotype, de AAV transferplasmide codeert voor de menselijke mutant A53T α-SYN onder de controle van de versterkte CMVie synapsin1 promotor en de pAdvDeltaF6 adenovirale helper plasmide ^17.
2. Oogst de drager 5 dagen na transiënte transfectie en concentraat via tangentiële flow filtratie ^17.
3. Zuiver het rAAV vectordeeltjes in het geconcentreerde medium met behulp van een stapsgewijze gradiënt ¹⁷ iodixanol.
4. Gebruik standaard technieken van real-time PCR voor genomische kopie (GC) bepaling. In dit protocol, een vector titer van 3,0 E11 GC / ml werd gebruikt om een α-SYN gebaseerde rattenmodel ontwikkeld voor PD ^17.

2. stereotactische injectie van rAAV α-SYN vector in de SN van de rat (figuur 2)

1. House acht weken oud vrouwelijke Wistar-ratten met een gewicht van ongeveer 200-250 g onder een normale 12 uur licht / donker cyclus met vrije toegang tot gepelleteerde voedsel en water uit de kraan.
2. Verzend rat intraperitoneale (ip) anesthesie met een mengsel van ketamine (60 mg / kg) en medetomidine (0,4 mg / kg). Zodra de rat wordt verdoofd en reageert nietwanneer knijpen de verschillende poten, toedienen van een micro-transponder subcutaan op de rug van de rat voor verdere erkenning behulp van een micro-transponder implantaatinjector. Controleer of de micro-transponder juist gepositioneerd en kunnen door de leesinrichting worden gelezen.
3. Snijd het haar bovenop de hoofdhuid. Breng een plaatselijke verdoving zowel de hoofdhuid en oren. Voer de rest van de chirurgische procedure onder een laminaire stroming behulp van aseptische technieken.
4. Plaats de ratten in een stereotactische hoofd frame met behulp van twee oor bars, een mond en een neus bar. Bedek het lichaam van de rat met een papieren deken op een daling van de lichaamstemperatuur voorkomen. Pas een oculair smeermiddel om te voorkomen dat de ogen uitdrogen.
5. Ontsmet de hoofdhuid met jodium 1% in isopropanol 70% en een kleine incisie in de middellijn van de hoofdhuid. Voorzichtig schrapen weg de membranen op de schedel en spoel met een zoutoplossing. Laat de schedel drogen gedurende enkele minuten. Let op de schedelnaden en de twee referentiepunten: Bregma en Lambda.
6. Om de rAAV vector in de SN te injecteren, bepalen de coördinaten in de richting van Bregma (achterwaartse: 5,3 mm; mediolateral: 2,0 mm en dorsoventral: 7,2 mm berekend op basis van de dura).
   Opmerking: De driedimensionale coördinaten van elk gebied van belang kan worden berekend met een stereotaxische atlas van de rattenhersenen, toepassing Bregma met anatomisch referentiepunt.
7. Vul een 10 ul micro-injectie spuit (30 gauge 20 mm) met rAAV vector en plaats het in de stereotaxische instrument verbonden met een gemotoriseerde micro-injectie pomp. Regel het volume door het vrijgeven van een daling van de vector en te elimineren in een polyvalent schoonmaakmiddel pH 9 (bijv RBS).
8. Visueel controleren of de kop is bevestigd recht in het hoofd frame en evalueren van de links-rechts as. Zorgvuldig visueel bepalen de achterwaartse en mediolateral coördinaten voor Bregma en Lambda en meet de hoogte met behulp van een 30 gauge 20 mm naald in de dorsoventral arm van de stereotactische frame.
   1. laat amaximale van 0,3 mm verschil in hoogte tussen Bregma en Lambda. Plaats de naald terug op Bregma en de achterwaartse en mediolateral coördinaten toe te passen door het bewegen van de achterwaartse en de mediolateral arm van de stereotactische frame.
9. Op de plaats van de injectie, het meten van de hoogte van de schedel en ervoor zorgen dat het verschilt niet meer dan 0,3 mm van de hoogte van Bregma. Boor een gat in de schedel met een diameter van ongeveer 2 mm. Meet de hoogte van de dura, zal dit dienen als referentie gelden de dorsoventral coördineren. Als alternatief aftrekken vaste dikte van de schedel (0,9 mm).
10. Doordringen in de dura met behulp van een 26 gauge naald en te absorberen het bloed met een steriele. Wacht totdat alle bloeden is gestopt voordat u verder gaat.
11. Langzaam steek de micro-injectie 10 pl injectiespuit vooraf gevuld met vector oplossing in de hersenen naar de vooraf bepaalde diepte (dorsoventral coördinaat). Wacht 1 min met de naald op zijn plaats. Injecteer 3 ulvector oplossing (3,0 E11 genoom kopieën / ml (gemiddeld vector dosis) of 1,0 E12 GC / ml (hoog vector dosis) rAAV2 / 7 α-SYN of eGFP controlevector) met de gemotoriseerde micro-injectie pomp met een debiet van 0,25 pl / min.
12. Na injectie, houdt de naald op zijn plaats voor nog eens 5 minuten voordat langzaam te verwijderen. Steek de hoofdhuid met behulp van gecoate gevlochten polyester 3.0, desinfecteren met 1% jodium in 70% isopropanol en voorzichtig het dier uit het stereotactische instrument. draai eerst de neus en mond bar, waarna de twee oor bars.
13. De anesthesie keren injecteren ratten intraperitoneaal met 0,5 mg / kg atipamezol en plaats de rat in een schone kooi op een verwarmingsplaat van 38 ° C tot ontwaakt. Bedek de rat met een papieren deken op een daling van de lichaamstemperatuur voorkomen.
14. Zorg voor eenvoudige toegang tot voedsel en water voor de eerste uren. Bewaken van de rat voor de eerste paar dagen. Indien nodig passen analgesie.
    Opmerking: Het is niet nodig om de steken uit t verwijderenHij schedel. Na 1-2 weken de schedel volledig is hersteld en de steken komen los.

3. Beoordeling van rAAV2 / 7 α-SYN geïnjecteerde ratten met behulp van niet-invasieve PET Imaging, gedragstesten en immunohistochemische analyse

1. Om de opvolging van de kinetiek van nigrostriatale dopaminerge neurodegeneratie niet-invasief de loop der tijd bij individuele dieren, kwantificeren dopamine transporter (DAT) binding met behulp van kleine dieren positron emissie tomografie (PET) en een tracer van de DA Transporter bijvoorbeeld ^[18F] -FECT ¹⁶ .
2. Om te onderzoeken of het niveau van dopaminerge neurodegeneratie is voldoende om motorische stoornissen in de ratten te induceren, onder voorbehoud van de ratten naar de cilinder test om spontaan voorpoot gebruik te evalueren.
   1. Plaats de rat in een 20 cm breed heldere glazen cilinder en videotape het gedrag tijdens de verticale bewegingen langs de muur en de landing na een achterste. Score het aantal contacten die door elke voorpoot voor een totaal van 20contacten. Voor een gedetailleerde beschrijving van de scoring criteria zie Schallert et al. ¹⁸ Druk het aantal verminderde voorpoot contacten (bijv linker voorpoot) als een percentage van de totale voorpoot contacten (links plus rechts voorpoot).
      Let op: Niet-laesie controle ratten met beide poten in gelijke mate moet rond de 50% in deze test scoren.
3. Voer immunohistochemische analyse (IHC) om het niveau van transgenexpressie en dopaminerge celverlies beoordelen.
   1. Op verschillende eindfase, offeren de ratten met een overdosis van natriumpentobarbital (60 mg / kg, ip) en het uitvoeren van een intracardiale perfusie met koude zoutoplossing, gevolgd door 4% paraformaldehyde in PBS ^19. Fixeer de hersenen gedurende de nacht bij 4 ° C en gesneden 50 pm dikke coronale hersensecties met een trillende microtoom.
   2. Voer IHC vlekken op vrij zwevende delen met behulp van antilichamen tegen α-SYN en tyrosine hydroxylase tot α-SYN expressie niveaus en de le analyserenvel van neurodegeneratie ^16.

Resultaten

De opzet van het experiment is in Figuur 1

rAAV 07/02-gemedieerde overexpressie van A53T α-SYN induceert tekorten dopamine-afhankelijke motor.
Om te onderzoeken of het niveau van de α-SYN overexpressie is voldoende om motorische stoornissen in de ratten te induceren, we onderworpen de ratten naar de cilinder test om spontaan voorpoot gebruik (figuur 3A) te evalueren. Va...

Discussie

Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. De vector titer als de vector zuiverheid rechtstreeks welke fenotypische uitkomst van het model. Overmatig vector titers of onvoldoende gezuiverd vector partijen kan leiden tot niet-specifieke toxiciteit. Daarom is het gebruik van hoge kwaliteit vector series en geschikt controlevectoren onontbeerlijk. Verder is de exacte positionering van het hoofd van de rat in het stereotactische frame en de nauwkeurige bepaling van de coördinaten essentieel is gericht op de su...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Vrouwelijke 8 weken oude Wistar ratten	Janvier	/	200-250 g
Ketamine (Nimatek)	Eurovet animal health	804132
Medetomidine (Dormitor)	Orion-Pharma/ Janssen Animal Health	1070-499
Locaal anesthetisch middel voor hoofdhuid en oren: Xylocaïne 2% gel	Astrazeneca	0137-547
Terramycine	Pfizer	0132-472
Buprénorfine (Vetergesic)	Ecuphar	2623-627
Jodium 1% isopropanol	VWR	0484-0100
stereotactische hoofdframe	Stoeling	/
Hamilton-spuit (30 gauge -20 mm -pst 2)	Hamilton/ Filter Service	7803-07
atipamezole (Antisedan)	Orion-Pharma/Elanco	1300-185
rAAV A53T α-SYN vector	LVVC, KU Leuven	/	https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
natrium pentobarbital (Nembutal)	Ceva Santé	0059-444
microtoom	Microm	HM650
konijn polyklonaal synucleïne Ab	Chemicon	5038	1:5.000
konijn polyklonaal TH Ab	Chemicon	152	1:1.000
Lutetium oxyorthosilicaat detector-gebaseerde FOCUS 220 tomograph	Siemens/ Concorde Microsystems	/
radioligand: 18F-FECT	In house	/
L-dopa: Prolopa 125	Roche		6 mg/kg i.p.
DMEM, Glutamax	Life Technologies	N° 31331-093
Foetaal bovien serum	Life Technologies	N° 10270-106
25 kD lineaire polyethyleenimine (PEI)	Polysciences	/
OptiPrep Dichtheidsgradientmedium: Iodixanol	Sigma	D1556-250ML
Optimen	Life Technologies	N° 51985-026
Paxinos 1 watston steretactic atlas, vierde Editie	Elsevier	/