Method Article

Ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode voor equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

DOI:

10.3791/53672

⸱

March 17th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1LABÉO Frank Duncombe, 2Unité de Risques Microbiens (U2RM, EA 4655), Normandy University, 3Hippolia Foundation

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis.

Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories.

This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Paardachtige herpesvirus-2 (EHV-2) is betrokken bij een respiratoir syndroom, met potentiële klinische manifestaties zoals loopneus, faryngitis en gezwollen lymfeknopen 1-3. Dit virus wordt ook vermoed wordt geassocieerd met slechte prestaties paarden, wat kan leiden tot een significante en negatieve economische gevolgen voor de paardenindustrie 2.

Tot nu toe de gouden standaard voor gamma-EHV (γ-EHV) detectie was celkweekwerkwijze. De eerste ongemak van deze procedure was het ontbreken van discriminatie tussen EHV-2 en andere γ-EHV's (bijvoorbeeld EHV-5). De tweede ongemak was de trage ontwikkeling van het cytopathische proces, dat duurt 12-28 dagen te manifesteren 4,5.

Ontwikkeling van een gevalideerd en genormaliseerd kwantitatieve Real-time PCR (qRT-PCR) methode helpt om snel detecteren virus, onderscheid maken tussen EHV-2 en EHV-5 en de relatie tussen het virale genoom belasting en de ziekte door de kwantificering aspect bestuderen.

Polymerase kettingreactie (PCR) werd beschreven voor het eerst in 1986 door Mullis 6 en gaat de nieuwe gouden standaard in de meeste gebieden van biologische diagnose (mens, milieu en dier) worden. Deze methode, die is gebaseerd op de amplificatie van een deel van het genoom van pathogenen, biedt vele voordelen: specificiteit, gevoeligheid en snelheid. Bovendien is het risico op besmetting amplicon verdween sinds de komst van qRT-PCR en kwaliteitsborging 7. Toch is de erkenning van PCR als een nieuwe gouden standaard methode noodzakelijk meer dan alleen betere prestaties gegevens, maar ook de demonstratie van de controle van de ontwikkeling en validatie stappen van de gehele methode zonder verslechtering van de prestaties in de tijd.

De eerste moleculaire instrumenten die worden gebruikt voor de detectie van EHV-2 waren tijd consuming en betrokken niet-specifieke amplificatie met geneste PCR, gevolgd door sequentiebepaling 8. De beoogde genen voor herpesvirussen waren desoxyribonucleïnezuur (DNA) polymerase en DNA verpakking 9. Echter, geneste PCR vormt een groot risico op besmetting door amplicons. Sindsdien zijn conventionele PCR proeven ontworpen om de interleukine 10-achtig gen of glycoproteïne-gen, herzien in 2009 2 amplificeren. Recenter werden real-time PCR beschreven kenmerken voor de kwantificering van EHV-2 10 maar geen gegevens meegedeeld betreffende de waarmerking van de gehele werkwijze de extractiewerkwijze.

In dit protocol wordt de ontwikkeling en validatie procedures beschreven voor een kwantitatieve PCR-methode voor de detectie en kwantificering van EHV-2 DNA in equine luchtwegen vloeistoffen volgens de Association française de normalisatie (AFNOR) norm NF U47-600 3,11,12, die de Franse vertegenwoordigerde internationale normalisatie commissie. Deze norm beschrijft de "Eisen en aanbevelingen voor de implementatie, ontwikkeling en validatie van de veterinaire PCR in diergezondheid analysemethode" 11,12, volgens de NF EN ISO / IEC 17025, 2005 13 en OIE (World Organisation for Animal Health) . aanbevelingen, 2010 14 het EHV-2 qRT-PCR valideringsprotocol omvat een driedelig procedure: (a) de ontwikkeling van de qRT-PCR assay, (b) karakterisering van qRT-PCR staan ​​(c) karakterisering van het gehele analysemethode (van extractie van nucleïnezuren uit het biologische monster aan PCR-analyse).

De karakterisering van de qRT-PCR-test en van de gehele analysemethode onder meer de definitie van twee limieten: de detectiegrens (LOD) en de bepaalbaarheidsgrens (LOQ). De LOD 95% PCR vertegenwoordigt het laagste aantal nucleïnezuur kopieën per volume-eenheid die in 95% van alle cas kan worden gedetecteerdes. De LOQ 95% PCR vertegenwoordigt het laagste hoeveelheid nucleïnezuur kopieën dat kan worden bepaald met inachtneming van de onzekerheden.

Dit qRT-PCR methode maakt de nauwkeurige detectie en snelle kwantificering van EHV-2 respiratoire vloeistoffen. Voorts kan de werkwijze in andere laboratoria worden toegepast op een standaardprocedure en als algemene model voor de ontwikkeling van andere nieuwe qRT-PCR assays waarborgen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Zie de verschillende stappen die zijn aangegeven in figuur 1.

1. Extractie van nucleïnezuren

Opmerking: Voer extractie onder een zuurkast aan de luchtwegen besmetting met nucleïnezuren te beperken. Hebben een negatieve controle extractie met DEPC behandeld water te garanderen dat geen van de reagentia zijn verontreinigd met ongewenste DNA.

  1. Extraheren van nucleïnezuren uit het biologische monster volgens een eerder beschreven protocol 15 en fabrikant protocol.
    1. Voeg 140 pl biologisch monster 560 ul lysis oplossing (AVL buffer) en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 560 ul ethanol. Breng de eerste 630 ul van deze oplossing (monster + + lysisoplossing ethanol) een silicakolom en centrifuge.
    2. Breng de resterende 630 pl van deze oplossing dezelfde silicakolom en centrifuge. De kolom wordt dan met 500 glvan 2 verschillende wassen buffers (AW1 en AW2).
  2. Elueer nucleïnezuur met 50 ui elutiebuffer (AVE buffer) en op kamertemperatuur. Sluit het deksel en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min. Centrifugeer bij 6000 g gedurende 1 min.

2. Versterking Procedure

  1. Bereid 22,5 pi reactiemengsel voor elke reactie. Voeg 12,5 pi PCR Master Mix, x pi 20 pM forward primer, x pl 20 uM reverse primer, y pl 10 pM probe en z ui ultrazuiver water zoals vereist om 22,5 gl bereiken (x, y en z volumes verkregen na titratie, zie paragraaf 3.2.3 en 3.2.6).
  2. Aliquot 22,5 pl van de geschikte reactiemengsel op elke reactie putje in een 96-wells plaat.
    Noot: Neem negatieve controles voor extractie en PCR te verzekeren dat geen van de reagentia zijn verontreinigd met ongewenste DNA.
  3. Voeg 2,5 ul van het monster, 2,5 ui van extractie negative control, 2,5 ui PCR negatieve controle en 2,5 pl positief monster (referentiestam of plasmide) als aangegeven reactieputje. Na de uitkering, bedek de plaat met een klevende plaat afdichting. Centrifugeer de plaat gedurende 10 sec bij 6000 g.
  4. Plaats de plaat in een real-time PCR-systeem. Selecteer de sjabloon voor de test lay-out en start de run. Gebruik het PCR programma-instelling: 10 min bij 95 ° C gevolgd door 45 cycli van 15 sec bij 95 ° C en 1 minuut bij 60 ° C (Tabel 1).
  5. Breng de ruwe gegevens van de Real-Time PCR systeem naar een spreadsheet. Stel de drempel in de amplificatie plots boven de basislijn en onder de exponentiële groei gebied op de drempelcyclus voor elk monster te verkrijgen. Plot elk punt standaard ingesteld als een standaard bocht naar lineariteit te verkrijgen. Bereken het aantal kopieën van de verschillende monsters op basis van de standaardkromme.

3. Ontwikkeling van kwantitatieve RT-PCR

Opmerking: De ontwikkeling van een qRT-PCR test vereist referentiestammen, een specifieke getitreerd plasmide en verschillende controles en omvat de titratie van de primers en probe.

  1. inleidende Test
    1. Ontwerp primers en probes met specifieke software volgens eerdere aanbevelingen 16.
    2. Extract referentie stammen zoals beschreven in paragraaf 1.
    3. Amplificeren zoals beschreven in sectie 2 met 900 nM voor de uiteindelijke concentratie van primers en 250 nM voor de uiteindelijke concentratie van probe. Analyseer het signaal zoals beschreven in paragraaf 2.5.
    4. Tegelijkertijd voert amplificatie van referentiestammen DNA (zoals beschreven in paragraaf 3.1.3) zonder probes. Sequentie van de amplicons verkregen met de werkwijze Sanger 17,18. Analyseer de sequenties door het uitvoeren van een BLAST nucleotide 19.
  2. Titratie van Primers en Probe
    1. Bereid 3 verschillende mixen met 250 nM uiteindelijke concentratie van probe en met verschillende uiteindelijke concentraties van de voorwaartse en achterwaartse primers (50 nM / 50 nM, 300 nM / 300 nM, 900 nM / 900 nM) voor de 3 replicaten van het positieve monster en een negatieve controle. Voor elke mix, voeg de zelfde juiste volume van 20 pM forward primer en 20 uM reverse primer (0,25 ul tot de 50 nM uiteindelijke concentratie te verkrijgen, 1,5 ul aan de 300 nm uiteindelijke concentratie of 4,5 pi te verkrijgen om de 900 nM uiteindelijke concentratie te verkrijgen) , 50 pi PCR master mix, 2,5 pl 10 pM probe en ultrazuiver water zoals vereist om 90 pl te bereiken.
    2. Voer de versterking procedure zoals beschreven in hoofdstuk 2.
    3. Kies de beste conditie op het hoogste niveau van de amplificatie te verkrijgen, vroegste cyclus drempel (CT) en de beste herhaalbaarheid tussen de 3 voorwaarden. Bepaal de beste concentratie en het overeenkomstige x gl van de voorwaartse en achterwaartse primers.
    4. Bereid 5 verschillende mengsels van de 4 monsters (3 replicaten van het positieve monster en een negatieve controle)met 5 verschillende eindconcentraties van probe (50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM). Voor elke mix, voeg x ul van 20 uM forward primer en x pi van 20 uM reverse primer (vooraf bepaalde, in paragraaf 3.2.3), 50 pi PCR master mix, geschikt volume van 10 pM sonde (0,5 ul aan de te verkrijgen 50 nM concentratie, 1 ui tot de 100 nM concentratie te verkrijgen, 1,5 ul aan de 150 nm concentratie te verkrijgen, 2 pl aan de 200 nm concentratie te verkrijgen of 2,5 ul aan de 250 nm concentratie) en ultrapuur water te krijgen als nodig is om 90 ul te bereiken.
    5. Voer de versterking procedure zoals beschreven in hoofdstuk 2.
    6. Kies de beste conditie op het hoogste niveau van de amplificatie te verkrijgen, vroegste cyclus drempel (CT) en de beste herhaalbaarheid tussen de 5 voorwaarden. Bepaal de beste concentratie en het overeenkomstige y ul van de probe.

4. Karakterisering van Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR)

Let op: Na de ontwikkeling stap en het bepalen van de beste omstandigheden te gebruiken, de karakterisering stap van de PCR omvat de specificiteit, de detectielimiet, de lineariteit bereik en de grens van kwantificatie van qRT-PCR.

  1. Voorbereiding en titratie van plasmide
    1. Bestellen commerciële plasmide dat het relevante fragment van DNA doelgen gekozen voor de PCR (in dit protocol, nucleotiden 2081-2381 van EHV-2 glycoproteïne-gen, zie tabel 1).
      Opmerking: Om het risico van besmetting van de luchtwegen met synthetisch DNA te beperken, voert seriële verdunningen van plasmiden onder een zuurkast in een aparte ruimte en werken met verdunde DNA tijdens alle stappen van de ontwikkeling en validatie procedure.
    2. Resuspendeer het plasmide met ultrapuur water om een ​​voorraad te bereiden op 50 ng / ml. Vortex en centrifuge kort het plasmide voorraad oplossing.
      Opmerking: Bepaal de werkelijke concentratie van het plasmide stock oplossing na resuspensie om het kopiegetal van het plasmide te berekenen.
    3. Voeg 1 pl plasmide de spectrofotometer. Lees de optische dichtheid (OD) bij 230 nm, 260 nm en 280 nm. Lees de DNA-concentratie op de spectrofotometer software (OD, 260 nm).
    4. Bereken het aantal kopieën van het plasmide met behulp getal van Avogadro (N A) en de formule:
      Nummer kopiëren / ul = (N A [plasmide in ng / ul]) / (plasmide lengte x 10 9 x gemiddelde gewicht van een basenparen) = (6.022 x 10 23 x [plasmide]) / (plasmide lengte x 10 9 x 660)
  2. Het testen van de specificiteit (Inclusiviteit en Exclusiviteit) van qRT-PCR
    1. Test de inclusiviteit van het PCR systeem. Selecteer EHV-2 positieve DNA-monsters, die eerder gekenmerkt door sequencing (positieve status gevestigd).
    2. Voer de versterking procedure zoals beschreven in hoofdstuk 2.
    3. Analyseer dePCR data voor elk monster zoals beschreven in paragraaf 2.5. Controleer de aanwezigheid van een exponentiële curve voor alle gekozen in sectie 4.2.1 monsters en bevestig inclusiviteit van PCR.
    4. Test de exclusiviteit van de PCR-systeem met behulp van DNA-extracten van pathogenen genetische gelijkenissen met het doel (in dit geval andere equid herpesvirussen, zoals EHV-1, EHV-4, EHV-3, EHV-5 en ezels herpesvirus-5 zoals beschreven in tabel 2) en andere pathogenen betrokken bij respiratoire aandoeningen van de gastheer (in dit geval, equine arteritis virus, influenzavirus van paardachtigen, Coxiella burnetii, Rhodococcus equi, Streptococcus equi equi, Streptococcus equi zooepidemicus, Chlamydophila abortus en Klebsiella pneumoniae, zie tabel 2).
    5. Voer de versterking procedure zoals beschreven in hoofdstuk 2.
    6. Analyseer de PCR-gegevens voor elk monster zoals beschreven in paragraaf 2.5. Controleer op de afwezigheid van een exponentiële curve voor alle monsters gekozenparagraaf 4.2.4 aan de exclusiviteit van de PCR te bevestigen.
  3. Detectiegrens van qRT-PCR
    1. Verdeel 90 ul van ultrapuur water in 6 buizen.
    2. Voer 6 tienvoudige seriële verdunningen van het plasmide aan de bestrijding zone (verlies van Ct detectie) richten. Breng 10 pl van het plasmide werkverdunning de buis met 90 pl van ultrazuiver water. Vortex en centrifuge kort de buis. Herhaal stap 4.3.2 tot de laatste buis in de seriële verdunning heeft het plasmide ontvangen.
    3. Voer de amplificatie van de 6 tienvoudige seriële verdunningen van het plasmide zoals beschreven in hoofdstuk 2.
    4. Bepaal de korting zone: de zone tussen de laatste verdunning van plasmide die een positief signaal en de eerste verdunning zonder detectie (zie figuur 2).
    5. De 6 tweevoudige seriële verdunningen starten, kiest de laatste verdunning van plasmide dat een positief signaal (zie punt 4.3.4) geeft.
      Opmerking: Voer 3 onafhankelijke trials de detectiegrens van qRT-PCR (LOD 95% PCR) te bepalen
    6. Verdeel 25 ul van ultrapuur water in 6 buizen.
    7. Voer 6 tweevoudige seriële verdunningen van het plasmide. Overdracht 25 ul van het plasmide werken verdunning, zoals bepaald in artikel 4.3.5, aan de buis met 25 ul van ultrapuur water. Vortex en centrifuge kort de buis. Herhaal stap 4.3.7 tot de laatste buis in de seriële verdunning heeft het plasmide ontvangen.
    8. Voer de amplificatie van de 6 tweevoudige seriële verdunningen van het plasmide zoals beschreven in hoofdstuk 2. Herhaal stap 4.3.7 tweemaal 4.3.8 tot 3 proeven te verkrijgen met 8 herhalingen (24 replicaten) van elk van de 6 tienvoudige seriële verdunningen van het plasmide.
      Opmerking: De detectiegrens van qRT-PCR (LOD 95% PCR) wordt gedefinieerd als de laagste DNA kopieën nummer eenheidsvolume dat wordt gedetecteerd in 95% van de gevallen.
    9. Bereken het aantal positieve replica's van de 24 herhalingen voor elk niveau van plasmide Concentratie.
    10. Bepaal de LOD 95% PCR. De LOD 95% PCR is het niveau dat resulteert in de detectie van positieve 23 herhalingen van 24 duplo's.
  4. Lineariteit Range en kwantificeringslimiet van qRT-PCR
    Opmerking: Voer 4 onafhankelijke studies met 6 tienvoudige seriële verdunningen van het plasmide dat de laagste concentratie die in de reeks komt overeen met de 95% LOD PCR vooraf bepaald 4.3.10.
    1. Verdeel 45 ul van ultrapuur water in 6 tubes.
    2. Start de 6 tienvoudige seriële verdunningen van de concentratie van plasmide werkverdunning overeenkomt met 10 7 95% LOD PCR.
    3. Voer 6 tienvoudige seriële verdunningen van het plasmide. Transfer 5 ul van het plasmide werkverdunning (bepaald in paragraaf 4.4.2) aan de buis met 45 ul van ultrapuur water. Vortex en centrifuge kort de buis. Herhaal stap 4.4.3 tot de laatste buis in de seriële verdunning heeft p ontvangenlasmid.
    4. Versterken de 6 tienvoudige seriële verdunningen van het plasmide zoals beschreven in hoofdstuk 2.
    5. Trek de lineaire regressie y = ax + b met de helling en het snijpunt B (figuur 3).
    6. Bereken de amplificatie-efficiëntie (E) uit de helling van een standaardcurve (zie 4.4.5) met de formule:
      figure-protocol-1 .
      Herhaal de stappen 4.4.1 tot 4.4.6 driemaal.
      Opmerking: Amplificatie efficiëntie zou de hoeveelheid PCR product toename na elke cyclus. Een ideale reactie bereikt efficiëntie van bijna 100%. In de praktijk, E (%) lag tussen 75% en 125%. Hogere E kan amplificatie van niet-specifieke producten of pipetteerfout in seriële verdunning geven. Lagere E kan ook een pipetteren fout in de seriële verdunning, slechte primer ontwerp of niet-optimale reactie condities aan te geven.
    7. Bereken de bias (Tabel3). Controleer voor elk plasmide niveau de voorspanning absolute waarde kleiner is dan de kritische biaswaarde (0,25 log 10). Bepaal de gemiddelde voorspanning en de lineaire onzekerheden (U lini) voor elk plasmide (tabel 3) de uitvoering van lineaire regressie voor EHV-2 qPCR geëvalueerd (figuur 4). U lini de lineariteit onzekerheid die voor elke i plasmide berekende van de standaarddeviatie (SD'i) en de gemiddelde vooringenomenheid. Bepaal de gecombineerde lineariteit onzekerheid (U LIN) van EHV-2 qPCR gegeven door de formule:
      figure-protocol-2
      Opmerking: Acceptatie bias wordt gespecificeerd door het laboratorium (in het algemeen absolute voorspanning 0,25 log 10) en gelijk aan het verschil tussen de laagste waarde en de hoogste waarde van 0,5 log 10 (waarde gemeten in log 10 kopienummer). U LIN waarde zou kunnen helpen om te vergelijken prestaties van qPCR uit verschillende laboratoria.
    8. Bepaal de bepalingsgrens van de qRT-PCR (PCR LOQ): LOQ PCR is de laagste concentratie met een voorkeur 0,25 log 10 voor het lineair bereik (Tabel 3).

5. Karakterisering van het Geheel Analytical Method (van DNA Extraction naar de qRT-PCR resultaat)

Opmerking: De karakterisering van de gehele werkwijze is de validatie van alle noodzakelijke stappen qRT-PCR data (bijvoorbeeld te verkrijgen bij de winning van DNA uit het respiratoire monster (zie punt 1) tot de amplificatie en kwantificatie van het doel (zie punt 2 )).

  1. Vaststellen correspondentie tussen de exemplaren nummer in de PCR reactie en de kopieën nummer aanwezig in het biologische monster met de formule:
    figure-protocol-3 .
    De figure-protocol-4 Het aantal plasmide exemplaar in de PCR reactie, figure-protocol-5 is het volume van het monster toegevoegd aan de PCR mix voor amplificatie figure-protocol-6 is het volume van buffer AVE gebruikt om nucleïnezuren elueren en figure-protocol-7 het volume van het geëxtraheerde monster.
  2. Test de gevoeligheid en specificiteit van het Geheel Analytical Method
    Opmerking: Alleen bekende EHV-2-positieve (of negatieve) monsters worden in deze sectie.
    1. Test de "gevoeligheid" van de qRT-PCR-werkwijze door het analyseren positieve monsters voor het doel (EHV-2).
      1. Selecteer EHV-2 positieve DNA-monsters, die eerder gekarakteriseerd (positieve status).
      2. Pak het nucleïnezuur zoals beschreven in hoofdstuk 1. Voer een versterking procedure zoals beschreven in hoofdstuk 2.
      3. Bepaal het aantal echte positieven (positieve monstersdie positief deze RT-PCR) en het aantal valse negatieven (bekende positieve monsters die negatief zijn met deze RT-PCR) zijn.
    2. Test de "specifieke karakter" van de qRT-PCR-methode door het analyseren van negatieve monsters
      1. Selecteer EHV-2 negatieve DNA-monsters (negatieve status).
      2. Pak het nucleïnezuur zoals beschreven in hoofdstuk 1. Voer een versterking procedure zoals beschreven in hoofdstuk 2.
      3. Bepaal het aantal echte nadelen (negatieve monsters die bekend zijn negatief met dit RT-PCR te zijn) en het aantal false positives (bekende negatieve monsters die positief zijn met deze RT-PCR).
    3. Bereken de "diagnostische gevoeligheid" (Se) en "diagnostische specificiteit" (Sp) van de gehele werkwijze (Tabel 4) als volgt: Se = aantal echte positieven / (aantal ware positieven + valse negatieven) en Sp = aantal real negatieven / (aantal echte negatieves + false positives) (zie tabel 4).
    4. Bereken het 95% betrouwbaarheidsinterval voor gevoeligheid en specificiteit van de gehele werkwijze met de formule Greiner en Gardner verhouding 12,20:
      figure-protocol-8
      waarin e de geschatte fout, θ is de Se (of Sp) en n het aantal monsters geanalyseerd.
      Opmerking: Voor een klein aantal monsters, gebruik Schwartz tabel volgens norm AFNOR 12 tot de 95% betrouwbaarheidsinterval voor gevoeligheid en specificiteit van de gehele werkwijze te berekenen.
  3. Voorbereiding van de Negatieve Resource Materiaal voor de karakterisering van het Geheel Analytical Method
    VOORZICHTIG: De detectiegrenzen en kwantificatie van de gehele werkwijze (LOD methode en LOQ Method) bepalen, voeg bekende concentraties van de plasmide biologische monsters waarvan bekend is vrij te zijnvan het doel (EHV-2 in dit geval). Deze monsters, samen met de gekwantificeerde plasmide verbintenissen positieve standaarden waarmee de methode LOD en LOQ methode bepalen.
    1. Bevestigen de afwezigheid van doelwit (EHV-2) in biologische monsters gebruikt om positieve standaarden construeren.
      1. Kies verschillende bekende negatieve biologische monsters.
      2. Extract biologische monsters zoals beschreven in hoofdstuk 1. Voer de versterking procedure zoals beschreven in hoofdstuk 2.
      3. Bevestigen de afwezigheid van het doel door de afwezigheid van PCR signaal in deze monsters.
        Let op: Gebruik dezelfde negatieve bron materiaal voor alle stappen tussen 5.4 en 5.5.
    2. de verschillende negatieve monsters te bundelen tot 15 ml van de negatieve resource materiaal (een volume nodig is voor de volledige validatie) te verkrijgen. Verdeel 135 ul van deze negatieve bron materiaal in 100 buizen. Houd buizen bij 4 ° C of bij -80 ° C voor langere opslag.
  4. Limit van Opsporing van het Geheel Analytical Method
    1. Bepaal de vermindering zone van de hele methode.
      1. Verdeel 45 ul van ultrapuur water in 6 tubes.
      2. Voer 6 tienvoudige seriële verdunningen van het plasmide. Transfer 5 ul van het plasmide werkverdunning overeenkomt met 10 7 LOD 95% PCR (zoals bepaald in paragraaf 4.3.10) op de buis met 45 ul van ultrapuur water. Vortex en centrifuge kort de buis. Herhaal stap 5.4.1.2 tot de laatste buis in de seriële verdunning heeft plasmide ontvangen.
      3. Breng 5 ul van elke verdunning van plasmide 2 buizen met 135 ul van de negatieve bronmateriaal te verkrijgen 2 repliceert de 6 positieve standaarden. Vortex en kort centrifuge.
      4. Voer extractie van de 2 replica's voor de 6 positieve normen zoals beschreven in hoofdstuk 1. Voer de versterking procedure zoals beschreven in hoofdstuk 2.
      5. Bepaal de vermindering zone: het gebied tussen de laatste concentration van plasmide geven een positief signaal en de eerste concentratie die geen signaal geeft.
    2. Detectielimiet van de methode (LOD Method) Bepaald door 2 Independent Trials
      Opmerking: Voer 2 onafhankelijke studies naar de detectiegrens van de hele methode (LOD Method) te bepalen.
      1. Start de 6 tweevoudige seriële verdunningen met het plasmide werkverdunning die 4 keer zo sterk dat de laatste concentratie van het plasmide die een positief signaal gaven (zie paragraaf 5.4.1.5).
      2. Verdeel 25 ul van ultrapuur water in 6 tubes.
      3. Voer 5 tweevoudige seriële verdunningen van het plasmide. Overdracht 25 ul van het plasmide werkverdunning (zoals bepaald in paragraaf 5.4.2.1) aan de buis met 25 ul van ultrapuur water. Vortex en centrifuge kort de buis. Herhaal stap 5.4.2.3 tot de laatste buis in de seriële verdunning heeft plasmide ontvangen.
      4. Breng 5 ul van elke verdunning van plasmid tot 4 buizen met 135 ul van de negatieve bron materiaal om 4 replica van de 5 positieve normen te verkrijgen. Vortex en kort centrifuge de buizen.
      5. Voer extractie van de 4 herhalingen voor de 5 positieve normen zoals beschreven in hoofdstuk 1. Voer de versterking procedure zoals beschreven in hoofdstuk 2.
      6. Herhaal stap 5.4.2.1 eenmaal 5.4.2.5 tot 8 replica krijgen voor elk niveau van plasmide concentratie.
      7. Tel het aantal positieve replica's van de 8 herhalingen voor elk niveau van plasmide concentratie.
      8. Bepaal de LOD Method. De LOD Method is het laatste niveau waarop 8 repliceert van de 8 replica's zijn positief (zoals beschreven in paragraaf 5.4.2.7).
  5. Lineariteit Range en kwantificeringslimiet van het Geheel Analytical Method
    Opmerking: Als u de limiet van kwantificering van de hele methode (LOQ Method) te bepalen, voeg bekende concentraties van het plasmide aan biologischemonsters waarvan bekend is dat vrij van het doel (EHV-2 in dit geval) zijn. Deze monsters vormen positieve normen om de LOQ methode te bepalen.
    1. Verdeel 45 ul van ultrapuur water in 6 tubes.
    2. Voer 6 tienvoudige seriële verdunningen van het plasmide. Transfer 5 ul van het plasmide werkverdunning overeenkomt met 10 7 LOD Method (zoals bepaald in paragraaf 5.4.2.8) aan de buis met 45 ul van ultrapuur water. Vortex en centrifuge kort de buis. Herhaal stap 5.5.2 tot de laatste buis in de seriële verdunning heeft het plasmide ontvangen.
    3. Breng 5 ul van elke verdunning van het plasmide 2 buizen met 135 ul negatieve biologische bronmateriaal tot 2 herhalingen van de 6 positieve standaarden te verkrijgen. Vortex en kort centrifuge.
    4. Voer extractie van de 2 replica's voor de 6 positieve normen zoals beschreven in hoofdstuk 1. Voer de versterking procedure zoals beschreven in hoofdstuk 2. Herhaal stap 5.5.1naar 5.5.4 driemaal.
    5. Definieer een nauwkeurigheid Profiel om te evalueren en valideren van de kwantitatieve werking van de methode.
      1. Definieer de aanvaardbaarheidsgrenzen van de gehele werkwijze voor het laboratorium. In dit protocol worden de aanvaardbaarheidsgrenzen gedefinieerd als ± 0,75 Log 10 door de Labeo Frank Duncombe.
      2. Voor een proef sporen een eerste lineaire regressie y = ax + b (a de helling is en b het snijpunt) met een kopie van Ct-waarden die overeenkomen met elke waarde van de standaard curve. Met deze eerste lineaire regressie berekent de experimentele waarde van het kopieaantal van de replicaten van Ct-waarden voor deze eerste standaardcurve. Herhaal stap 5.5.5.2 tweede replicaten van Ct-waarden verkregen een tweede lineaire regressie en bereken de experimentele waarde van het kopieaantal van de tweede replicaten van Ct-waarden voor de tweede standaardcurve.
      3. Herhaal stap 5.5.5.2 met de tweede en derde trials.
      4. Bereken de precisie, juistheid en nauwkeurigheid limieten voor elk plasmide level volgens NF U47-600-2 12.
      5. Maak een spreadsheet om de informatie voor alle gangbare punten (5.5.5.4) samen te stellen en maak een nauwkeurigheid profiel met de eerder gedefinieerde aanvaardbaarheidsgrenzen in 5.5.5.1 en de juistheid van de gegevens, samen met de onderste en bovenste nauwkeurigheid limieten zoals berekend in 5.5 .5.4 (Figuur 5).
    6. Bepaal de LOQ Methode: stemt overeen met de laagste concentratie van een standaardcurve met juistheid 0,75 log 10 als voor de lineariteit bereik berekend 5.5.5.5.
  6. Evaluatie van de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid
    Let op: Controleer de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid door gebruik te maken van de verhouding tussen de standaarddeviatie en het gemiddelde van de herhaalde metingen (variatiecoëfficiënt, of CV = standaardafwijking /gemiddelde).
    1. Evalueer de herhaalbaarheid van de Whole Methode 1 Analist:
      1. Kies 3 biologische monsters met 3 verschillende virale genoom belastingen (voorheen getest PCR bijvoorbeeld).
      2. Extract 8 herhalingen van de 3 monsters zoals beschreven in hoofdstuk 1. Voer de versterking procedure zoals beschreven in hoofdstuk 2.
      3. Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie van de Ct-waarde verzameld voor elk monster.
      4. Bereken de intra-assay CV met behulp van de formule CV = standaarddeviatie / gemiddelde.
    2. Evalueer de reproduceerbaarheid van het Geheel Methode met 3 Analisten:
      1. Kies 3 biologische monsters met 3 verschillende virale genoom belastingen (voorheen getest in PCR bijvoorbeeld)
      2. Extract 2 herhalingen van de 3 monsters gekozen in 5.6.2.1 (zoals beschreven in paragraaf 1). Voer de versterking procedure zoals beschreven in hoofdstuk 2. Herhaal stap 5.6.2.2 door 2 onafhankelijke analisten.
      3. Bereken het gemiddelde en standaarddeviatievan de Ct waarde verzameld voor elk monster.
      4. Bereken de inter-assay CV met behulp van de formule CV = standaarddeviatie / gemiddelde.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kwantitatieve RT-PCR-werkwijze, zoals hierboven beschreven, werd toegepast voor het detecteren en kwantificeren paardachtige herpesvirus-2 respiratoire vloeistoffen. Figuur 1 illustreert een schematische workflow grafiek voor de ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve RT-PCR werkwijze volgens de AFNOR-norm NF U47-600. Specificiteit van de primers en probes gevalideerd gedurende de stap-voor-stap ontwikkeling van de PCR. Slechts EHV-2 stammen werden geamplificeerd in dit systeem. Vervolgens werd de prestatie van de qRT-PCR moesten worden gekarakteriseerd.

Ten eerste de LOD PCR, een schatting 6 tienvoudige seriële verdunning werd uitgevoerd om de vermindering zone (figuur 2) vast. In dit voorbeeld werden 6 tienvoudige seriële verdunningen tussen 10 en 10 -5 -10 (tussen 26.000 en 0,26 kopieën / 2,5 gl monster) aan de LOD PCR schatten. Het abattement zone lies tussen verdunningen van 10 -9 tot 10 -10 (tussen 2,6 en 0,26 kopieën / 2,5 ul monster). De LOD PCR waarde in dit geval bepalen werden 6 tweevoudige seriële verdunningen van het plasmide in de bestrijding zone tussen 5,2 en 0,16 kopieën / 2,5 gl monster. De LOD PCR waarde was 2,6 kopieën / 2,5 pl monster.

De lineariteit bereik en LOQ PCR te bepalen werd de LOD PCR waarde gebruikt om het bereik van 6 tienvoudige seriële verdunningen starten tussen 2,6 (LOD PCR) en 260.000 kopieën / 2,5 gl monster. Figuur 3 illustreert een lineaire regressie voor EHV2 qRT-PCR van de ene proef. De prestaties van lineaire regressie (figuur 4) zijn bevestigd in viervoud volgens de in tabel 3 beschreven berekeningen. De berekeningen worden uitgevoerd om de lineariteit te definiëren volgens de criteria absolute Bias i value ≤0.25 log 10, ongeacht het niveau i van plasmide belasting. In dit geval, het bereik van de lineariteit lag tussen 2,6 en 260.000 kopieën / 2,5 pl monster. De LOQ PCR is de laagste concentratie van het lineaire bereik (dat wil zeggen, 2,6 kopieën / 2,5 gl monster in dit geval). U LIN werd bepaald 0,12 log 10 in het traject 2.6-260,000 kopieën / 2,5 pl DNA.

Na ontwikkeling (figuur 1, blauw) en karakterisering van de qRT-PCR (Figuur 1, geel), de AFNOR NF U47-600 norm beveelt karakterisering van de gehele analysemethode van DNA-extractie tot qRT-PCR (Figuur 1, oranje). De diagnostische gevoeligheid en specificiteit werden berekend zoals beschreven in Tabel 4. De kwantitatieve prestaties van de qRT-PCR geheel analysemethode geëvalueerd en gevalideerd met een nauwkeurigheid profiel ( Figuur 5).

Dit protocol, dat gebruikt state-of-the-art moleculaire technologie, konden we detecteren en kwantificeren van de EHV-2 virale genoom lading in 172 neusuitstrijk verkregen uit paarden met ademhalingsproblemen en / of klinisch vermoeden van infectie. De incidentie van EHV-2 uit veld (biologische) monsters was 50% (86/172) in deze populatie. De kwantitatieve analyses toonden dat virale genoom veel EHV-2 waren significant hoger bij jonge paarden en de verdeling van virale genoom lading af met de leeftijd (figuur 6). In deze studie, de hoogste EHV-2 virale genoom load (1,9 x 10 11 kopieën / ml) werd gedetecteerd in veulens (figuur 6).

figure-results-1
Figuur 1: Workflow grafiek voor de ontwikkeling (blauw), de karakterisering van de kwantitatieve RT-PCR(geel) en de karakterisering van de gehele analysemethode van DNA-extractie tot qRT-PCR (oranje) volgens de norm AFNOR NF U47-600-2. De workflow diagram hervat de verschillende stappen voor de ontwikkeling, de karakterisering van de kwantitatieve RT -PCR en de karakterisering van de gehele analysemethode van DNA-extractie tot qRT-PCR. Voor elke stap, de workflow grafiek geeft het aantal benodigde runs, verdunningen te voeren en het aantal benodigde analisten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Bepaling van de vermindering zone met representatieve resultaten van real-time PCR curves verkregen met 6 tienvoudige seriële verdunningen van plasmide. Om de bestrijding zone te schatten, 6 tienvoudige seriëleverdunningen worden uitgevoerd tussen 10 -5 (26.000 kopieën / 2,5 gl monster) en 10 -10 (0,26 exemplaren / 2,5 gl monster). Het abattement zone ligt tussen verdunningen van 10 -9 (2,6 kopieën / 2,5 ul monster) en 10 -10 (0,26 kopieën / 2,5 ul monster). In dit geval, 6 twee-voudige seriële verdunningen van plasmide werden gemaakt in deze vermindering zone aan de LOD 95% PCR te bepalen, tussen 5,2 en 0,16 kopieën / 2,5 pl monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3:. Lineaire regressie EHV2 qRT-PCR De lineariteit van kwantitatieve testen is het vermogen om resultaten die evenredig is met de concentratie van het doelwit aanwezig is in een bepaald bereik te genereren. Dit kan worden gemodelleerd doorlineaire regressie (y = ax + b) tussen de instrumentele respons (cyclus drempel of Ct) en de logaritme van de hoeveelheid van het doel (aantal doel kopieën / 2,5 ul monster). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .

figure-results-4
Figuur 4:. Uitvoering van lineaire regressie van EHV-2 qPCR gemiddelde voorspanning geven het gemiddelde verschil tussen de gemeten hoeveelheid plasmide ( figure-results-5 ) En de theoretische plasmide hoeveelheid (x 'i) voor elk plasmide niveau. Verticale balken geven de lineariteit onzekerheid (U Lini) gegeven door de formule
figure-results-6
waarbij SD'i is de standaarddeviatie o f gemeten plasmide hoeveelheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 5:. Accuracy profielen op basis van de validatie resultaten van het EHV-2 qRT-PCR-methode De groene lijn (cirkels) vertegenwoordigt de juistheid van de gegevens (systematische fout of bias). De aanvaardbaarheid grenzen worden bepaald op ± 0,75 Log 10 door het laboratorium (stippellijnen). De onderste en bovenste nauwkeurigheid limieten werden bepaald voor elk plasmide belasting niveau van de gemiddelde vertekening ± tweemaal de standaarddeviatie van de betrouwbaarheid van de gegevens (rode lijnen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1 "> figure-results-8
Figuur 6:. Kwantificering van de virale genoom veel EHV-2 naar leeftijd Het virale genoom lastverdeling EHV-2 gedetecteerd in neusuitstrijk monsters vertegenwoordigen bij verschillende leeftijdsgroepen. De horizontale lijnen geven de gemiddelde waarden voor de standaarddeviatie (m = maanden). * Significant verschillend van ANOVA met Newman-Keuls post-hoc-test (p <0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

target-gen Primers, probe en plasmide sequenties (5'-3 ') nucleotidepositie Grootte van het product (nucleotiden) Thermische fietsen voorwaarden Referenties
EHV2 gB
(HQ247755.1) 		Forward: GTGGCCAGCGGGGTGTTC 2113-2130 78 95 ° C 5 min 11
Keerzijde: CCCCCAAAGGGATTYTTGAA 2189-2170 95 ° C 15 sec 45 cycli
Probe: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB 2132-2157 60 ° C 1 min
Plasmid:
ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA
ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG
GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT
CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA
GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG
TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT
ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG
GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG
CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA
ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG 		2081-2381

Tabel 1:. Sequenties van primers, probes en positieve synthetische DNA-controles die in dit protocol De sequentie van plasmide (positieve synthetisch DNA) komt overeen met posities nucleotide 2081-2381 van EHV2gB sequentie (HQ247755.1). Het ontwerp van primers en probes die in dit protocol werd verkregen door specifieke software.

ZIEKTEVERWEKKERS Referentie (oorsprong) Aantal stammen RESULTATEN
EHV-2
EHV-2 VR701 (ATCC) 20 Positief
20 monsters (FDL collectie)
EHV-5 KD05 (DK) 20 Negatief
20 monsters (FDL collectie)
EHV-3 VR352 (ATCC) 2 Negatief
T934 WSV (DK)
EHV-1 Kentucky stam Ky A (ATCC) 3 Negatief
2 monsters (FDL collectie)
EHV-4 VR2230 (ATCC) 1 Negatief
Stompzinnige herpesvirus AHV5 FDL Collection 1 Negatief
Paardeninfluenza Virus A / equine / Jouars / 4/2006 (H3N8) 1 Negatief
(Accession Number JX091752)
Equine Arteritis Virus VR796 (ATCC) 2 Negatief
Rhodococcus equi FDL Collection 1 Negatief
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus FDL Collection 1 Negatief
Streptococcus equi subsp. equi FDL Collection 1 Negatief
Coxiella burnetii ADI-142-100 (Adiagene) 1 Negatief
Chlamydophila abortus ADI-211-50 (Adiagene) 1 Negatief
Klebsiella pneumoniae FDL Collection 1 Negatief

Tabel 2: Analytische specificiteit van qRT-PCR voor EHV-2.

figure-results-9
Tabel 3: Berekening van de vooringenomenheid en lineariteit onzekerheid (overgenomen van NF U47-600-2 12). Voor elke proef, de prestaties van lineaire regressie (y = ax + b) worden gevalideerd met de tafel waarbij y de cyclus drempelwaarde gelijk, a is verkregen de helling,. X het plasmide niveau en b het snijpunt i het plasmide level (i varieert van 1 tot k levels), k het aantal plasmide niveaus gebruikt (bijvoorbeeld k = 6 in tzijn tafel), j het ​​proces (j varieert van 1 tot I studies), I het aantal pogingen, die ligt tussen 3 en 6 onderzoeken (bijvoorbeeld I = 4 in deze tabel) x i de geschatte plasmide hoeveelheid van elk. i plasmide-niveau. x 'i is de theoretische hoeveelheid plasmide verkregen met vergelijking x' i = log 10 (x i) voor elke i plasmide niveau. Tijdens elke proef j, de cyclus drempelwaarde gelijk voor elke i plasmide level wordt berekend met de lineaire regressie y i, j = een j x i, j + b j. figure-results-10 is de gemeten hoeveelheid plasmide tijdens het proces j. Bias i sub> is het verschil waargenomen tussen de gemeten hoeveelheid plasmide en de theoretische plasmide hoeveelheid voor elke proef en elk plasmide niveau. figure-results-11 de gemiddelde waarde van figure-results-12 door elke i plasmide niveau; SD 'i is de standaarddeviatie van de gemeten hoeveelheid figure-results-13 voor elke i plasmide niveau Mean vertekening is het gemiddelde van Bias i; U Lini is de lineariteit onzekerheid die voor elke i plasmide niveau berekend op basis van SD'i en betekenen vooringenomenheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1 "fo: keep-together.within-page =" 1 "fo: keep-met-next.within-page =" always "> Real-status van het monster Positief Negatief Resultaten verkregen met gehele werkwijze Positief RP (echte positief) FP (vals positief) Negatief FN (vals negatief) RN (echte negatieve) Totaal RP + FN FP + RN Se = RP / (RP + FN) Sp = RN / (RN + FP)

Tabel 4:. Berekening van diagnostische gevoeligheid (Se) en specificiteit (Sp) van de gehele werkwijze A Schwartz tabel werd gebruikt voor de berekening confidlingen interval 95% gevoeligheid en specificiteit van de gehele werkwijze zoals beschreven in NF U47-600-2.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinds de jaren 2000, heeft real-time PCR werd vervangen gouden standaard technieken (celkweek en bacteriën cultuur methoden) in een toenemend aantal laboratoria. Uitvoering van de techniek is relatief eenvoudig. Echter validatie van laboratoriummethoden is essentieel voor moleculaire detectie en kwantificering van ziekteverwekkers voor nauwkeurige, reproduceerbare en betrouwbare gegevens.

Aangezien de extractiestap is de belangrijkste bron van verlies van een biologisch materiaal, kan worden beschouwd als de belangrijkste bron van onjuiste kwantificatie tussen één protocol en andere. Als zodanig is het creëren van een standaardcurve van plasmide DNA in qRT-PCR, vooral in de literatuur, geeft het virale genoom load maar geen rekening met de extractiestap.

Beschrijving van een de novo strategie voor een hele werkwijze validatieproces in de AFNOR norm NF U47-600-2 betekent een aanzienlijke vooruitgang op dit gebied. Zoals weergegeven indit papier voor EHV-2 bij paarden, of anderen in bijen 21, verstrekking van duidelijke onderscheid tussen de ontwikkelingsstap en validatiestap met karakterisering van de PCR en karakterisering van de gehele werkwijze. Een beperking in dit interessante aanpak is dat elke verandering in het protocol zal resulteren in de verplichting om het volledige proces dat zeer kostbaar kunnen zijn opnieuw te valideren. Deze beperking is ook uit het feit dat de grenzen voor kwantificering afhankelijk van de bron waaruit het virus geëxtraheerd (bijvoorbeeld respiratoire vloeistoffen, organen, bloed of urine). In feite is elke matrix geeft verschillende specificiteiten in hun fysico-chemische eigenschappen en het is belangrijk om zelfstandig definiëren elke verschillende matrijs voor virale detectie en kwantificering door qRT-PCR. Aldus kan het virale genoom hoeveelheid van elk biologisch monster nauwkeuriger bij de winning worden gekwantificeerd. De kwalificatie wordt ook rekening gehouden met de thermocycler model en wanneer het gebruik van een reeds goed gekarakteriseerde methode (bijvoorbeeld de EHV-2 qPCR methode beschreven in dit document) vereist een nieuw type machine in de bovenliggende laboratorium of een ander laboratorium, moet men de prestaties van dat instrument bevestigen. De bevestiging van de prestaties van een qPCR assay is een voorwaarde voor alle tests te brengen in een laboratorium. Dit wordt normaliter bereikt door het analyseren van een monster met bekende eigenschappen. Een dergelijke controle is een voorwaarde en beschouwd verplicht op verzoek van de NF 47-600-1 AFNOR norm met het oog op de uitvoering van de qPCR (LOD, LOQ efficiency) en de robuustheid van de hele methode (LOD, LOQ) te valideren. Niet alleen tijdens de ontwikkeling en karakterisering stappen, maar ook bij gebruik in onderzoek of voor diagnostische doeleinden, kunnen de risicofactoren worden geïdentificeerd en goed gecontroleerd om standaardisatie van het protocol te waarborgen. Van bijzonder belang is een adequate opleiding van het personeel, hooggekwalificeerd personeel, de kwaliteitscontrole van de verbruiksgoederengebruikt en de opslag, de controle van de directe omgevingscondities en bewustzijn metrologische omstandigheden die de uitvoering van de wetenschappelijke instrumenten die bij de assay kunnen beïnvloeden. Gebruik van referentiemonsters voor vergelijkingen tussen laboratoria kan ook helpen bij de controle van de onzekerheden. Op deze wijze kan vergelijking van gegevens tussen laboratoria worden vergemakkelijkt. Inderdaad, tussen laboratoria ringonderzoeken zijn essentieel om te evalueren en te bevestigen de reproduceerbaarheid van de methode.

Virale genoom belasting resultaten worden uitgedrukt in internationale eenheden (IE) van de geanalyseerde biologische matrix (IU: kopieën / ml voor fluïda of kopieën / g weefsel) zijn gemakkelijker te gebruiken om de resultaten te vergelijken tussen verschillende laboratoria. Alle resultaten boven de LOQ worden uitgedrukt kopieën / ml en gevolg tussen de LOD en LOQ wordt genomen als een niet-kwantificeerbare positief resultaat. Presentatie kwantificationele gegevens van het genoom op deze wijze voldoet nauwkeuriger het process analyses (amplificatie van het genoom). In feite, in celcultuur experimenten expressie van de virale belasting met TCID50 (mediane weefselkweek infectieuze dosis) afhankelijk van de aard van de cellen en virusstammen. Elke stam lijn bezit zijn unieke infectie kinetiek en een aantal virussen zoals EHV-2 kan enkele dagen duren voordat de eerste cytopathogeen effect is duidelijk.

Tot slot moet deze nieuwe methode van karakterisering van qRT-PCR de harmonisatie van de presentatie van gegevens en interpretatie tussen laboratoria te vergemakkelijken. Dit zal zeer nuttig zijn voor potentiële toepassingen van qRT-PCR in de toekomst als de instelling van een drempelwaarde voor verklaring van de ziektestatus plaats van alleen de aanwezigheid of afwezigheid van het pathogeen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The authors would like to thank Sophie Castagnet and Nadia Doubli-Bounoua for their technical support. This work received financial support from the General Council of Calvados and the agreement of Region Basse-Normandie and French Government (CPER 2007-2013; project R25 p3). The authors would like to thank the experts of the AFNOR group and particularly Jean-Philippe Buffereau and Eric Dubois.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AB-1900 natural color ABgene 96 well plate Dutsher16924
Adhesive film qPCR Absolute Dutsher16629Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run
0.5 ml microtubes, skirted, capsDutsher039258
Ethanol 98%SodiproSAF322941000
PrimersEurofinsCustom order
ProbeLife TechnologiesCustom order
PlasmidEurofinsCustom order
QIAamp  RNA viral Mini Kit
(containing: QIAamp Mini column, AVL  buffer,  AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes) 		Qiagen52906AVL buffer: pre-warm 5 min at 72 °C
Sequencing by Sanger methodEurofinsCustom order
Taqman Universal PCR Master MixLife Technologies4364340
Tris-EDTA buffer solutionSanta Cruzsc-296653A
NanoDrop 2000c SpectrophotometerThermoscientificND-2000C
StepOnePlus Real-Time PCR systemsLife Technologies4376600pre-warm 15 min 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness. Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).">Brault, S. A., et al. The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness. Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).
  2. Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis. Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).">Fortier, G., Van Erck, E., Pronost, S., Lekeux, P., Thiry, E. Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis. Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).
  3. Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method. J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).">Hue, E. S., et al. Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method. J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).
  4. Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4). Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).">Diallo, I. S., et al. Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4). Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).
  5. Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease. Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).">Williams, K. J., et al. Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease. Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).
  6. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).">Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).
  7. EPA-815-B-04-001. Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples. , (2004).">EPA Office of Water (4607). EPA-815-B-04-001. Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples. , (2004).
  8. Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses. Virology. 195 (2), 492-499 (1993).">Telford, E. A., et al. Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses. Virology. 195 (2), 492-499 (1993).
  9. Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007. Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).">Fortier, G., et al. Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007. Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).
  10. Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals. Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).">Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals. Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).
  11. NFU 47-600-1. Animal health analysis methods-PCR-Part 1: Requirements and recommandations for the implementation of veterinary PCR. , (2015).">Association Francaise de Normalisation. NFU 47-600-1. Animal health analysis methods-PCR-Part 1: Requirements and recommandations for the implementation of veterinary PCR. , (2015).
  12. NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR. , (2015).">Association Francaise de Normalisation. NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR. , (2015).
  13. EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. , (2005).">ISO. EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. , (2005).
  14. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).">Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).
  15. Detection and genogrouping of noroviruses from children's stools by Taqman One-step RT-PCR. J Vis.Exp. (65), e3232(2012).">Apaza, S., et al. Detection and genogrouping of noroviruses from children's stools by Taqman One-step RT-PCR. J Vis.Exp. (65), e3232(2012).
  16. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis.Exp. (63), e3998(2012).">Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis.Exp. (63), e3998(2012).
  17. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).">Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).">Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  19. BLAST Homepage and Selected Search Pages. Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages. , (2015).">NCBI. BLAST Homepage and Selected Search Pages. Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages. , (2015).
  20. Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies. Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).">Greiner, M., Gardner, I. A. Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies. Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).
  21. Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method. J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).">Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method. J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Equid Herpesvirus 2Quantitative PCRRespiratory FluidsNucleic Acid ExtractionReal Time PCRSerial DilutionsLimit of DetectionViral Load QuantificationAFNOR NF U47 600Equine Respiratory Disease

Related Articles