Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beeldvorming Serotonerge vezels in de muis Spinal Cord Met behulp van de DUIDELIJKHEID / CUBIC Techniek

10.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53673

⸱

26 februari 2016

 ,  , 
1Brain Structure and Function Group, Neuroscience Research Australia, 2School of Medical Sciences, The University of New South Wales

In dit artikel

Samenvatting

Supraspinale projecties zijn belangrijk voor pijnperceptie en andere gedragingen, en serotonerge vezels zijn een van deze vezelsystemen. De huidige studie richtte zich op de toepassing van het gecombineerde CLARITY/CUBIC protocol op het muizenruggenmerg om de terminatie van deze serotonerge vezels te onderzoeken.

Samenvatting

Aflopend lange vezels aan het ruggenmerg essentieel voor vervoer, pijnperceptie en andere gedragingen. De vezelafwerking patroon in het ruggenmerg van de meerderheid van deze vezels systemen niet grondig onderzocht bij soorten. Serotonerge vezels, die uitsteken in het ruggenmerg, zijn onderzocht bij ratten en buidelratten op histologische secties en hun functionele betekenis is afgeleid op basis van hun vezelafwerking patroon in het ruggenmerg. Met de ontwikkeling van de duidelijkheid en vierkante technieken is het mogelijk dit vezelsysteem en de verdeling ervan in het ruggenmerg, die waarschijnlijk eerder onbekende eigenschappen van serotonerge supraspinale wegen onthullen onderzoeken. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het afbeelden van de serotonerge vezels in de muis ruggenmerg met behulp van de gecombineerde DUIDELIJKHEID en CUBIC technieken. Bij deze methode wordt perfusie van een muis met een hydrogel oplossing en verduidelijking van het weefsel met een combinatie van clearing reagentia. Ruggenmerg werd ontruimd in iets minder dan twee weken, en de daaropvolgende immunofluorescentiekleuring tegen serotonine werd in minder dan tien dagen afgerond. Met een multi-foton fluorescentiemicroscoop, werd het weefsel afgetast en een 3D beeld gereconstrueerd met behulp Osirix software.

Inleiding

Supraspinale projecties zijn verantwoordelijk voor de modulatie van diverse gedragingen zoals pijnperceptie. Een van de projecties die nociceptieve informatie vervoert, bevat serotoninerge vezels, die ontspringen uit de raphe en aangrenzende reticulaire kernen van de hersenstam1,2. Fysiologische en farmacologische studies hebben een verhoogde afgifte van serotonine aangetoond in de dorsale hoorn van het ruggenmerg na elektrische stimulatie van de raphe-kernen in de hersenstam3-5. Bij ratten en opossums hebben serotoninerge raphespinale vezels dichte terminalen, niet alleen in de dorsale hoorn6-8, maar ook in de intermediaire zone7,9,10, de ventrale hoorn7,11 en zelfs lamina 1012,13. Er zijn geen vergelijkbare studies bij muizen. De huidige studie had tot doel het terminatiepatroon van serotoninerge vezels afkomstig van de raphe-kernen en aangrenzende reticulaire kernen van de hersenstam in het muizenruggenmerg in kaart te brengen met behulp van de recent gepubliceerde CLARITY14 -methode en de modificatie ervan - CUBIC15.

Conventionele fluorescentie of peroxidase-immunohistochemie van het ruggenmerg toont duidelijk de verdeling van serotoninerge vezels in de grijze stof van het ruggenmerg in dwarsdoorsneden van 30-40 µm dik. Deze benadering laat echter de continuïteit van de serotoninerge vezelbanen in de witte stof en hun zijtakken in de grijze stof niet zien. Hoewel de 3D-reconstructie van histologische secties onze kennis van vezelbanen heeft vergroot, blijft het een uitdaging voor histologen en anatomen om een enkele baan te volgen vanwege kleine vervormingen in het weefsel veroorzaakt door het snijden. Om dit obstakel te omzeilen hebben een aantal onderzoekers verschillende protocollen ontwikkeld voor het maken van de hele weefselstructuur doorzichtig en het verzamelen van een afbeelding van onveranderd weefsel in een enkel videobestand17-21. Tot nu toe zijn de door Deisseroth's groep ontwikkelde clear, lipid-exchanged, acrylamide-hybridized rigid, imaging/immunostaining compatible, tissue hydrogel (CLARITY)-techniek14,15 en CUBIC, ontwikkeld door Susaki et al16, het meest succesvol. Sinds de publicatie van de protocollen zijn veel onderzoekers begonnen deze technieken te gebruiken om verschillende aspecten van biologische weefsels te onderzoeken, inclusief niet alleen de hersenen22-25, maar ook het hart, nieren, darmen en de longen26,27.

Door het muizenruggenmerg te fixeren met de hydrogeloplossing (CLARITY) en het helder te maken met de CUBIC-reagentia (wat een veel snellere methode is dan die beschreven in het oorspronkelijke CLARITY-protocol14,15), werd een ruggenmergtweegblok van 2-3 mm lang binnen twee weken helder gemaakt en immunofluorescentiekleuring voor serotonine voltooid in acht dagen. Met slechts een combinatie van chemische agentia kan conventionele immunohistochemie worden gebruikt om een afbeelding van individuele vezelbanen in een 3D-videobestand te creëren in ongeveer een maand.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Ethiek Verklaring: Alle procedures waarbij proefdieren volgen de richtlijnen van de Animal Care en Ethische Commissie (ACEC) aan de Universiteit van New South Wales (de goedgekeurde ACEC nummer 14 / 94A).

1. Voorbereiding van de Transparent Mouse Spinal Cord

  1. Bereiding van Ice Cold Hydrogel Solution
    1. Bereiding van 16% paraformaldehyde oplossing (PFA)
      1. Voeg 16 g paraformaldehyde poeder in 70 ml voorverwarmd gedistilleerd water (50-55 ° C) en roeren op een verhitte magnetische roerder totdat paraformaldehyd opgelost. Opmerking: Zorg ervoor dat de oplossing tot meer dan 55 ° C te verwarmen en te beseffen dat paraformaldehyde is giftig.
      2. Breng de paraformaldehyde oplossing voor een cilinder en gedestilleerd water tot 100 ml. Koel het paraformaldehyde oplossing met een 4 ° C koelkast.
    2. Oplossen 125 mg VA-044 initiator in 26,25 ml gedestilleerd water en laat de oplossing in een 4° C koelkast.
    3. Koel 5 ml acrylamide-oplossing (40%), 1,25 ml Bis-oplossing (2%) (NB: Bis en acrylamide oplossingen toxisch, kan genetische schade veroorzaken of kanker), 5 ml 10 x PBS, 12,5 ml 16% PFA oplossing en de VA-044 initiator oplossing op het ijs.
    4. Meng de bovenstaande oplossingen op ijs.
      Let op: het totale volume is 50 ml.
  2. Perfusie en Collectie van de Muis Spinal Cord
    1. Verdoven een muis met een intraperitoneale injectie van ketamine (80 mg / kg) en xyzaline (5 mg / kg) verdund in 0,9% fysiologische zoutoplossing. De dosering voor muis lager dan die van ratten.
    2. Op een geschikte kunststof oppervlak in een zuurkast, bevestig de ledematen van de muis van het lichaam (plakband voldoende) zodra de muis niet reageert op een snuifje haar huid van de voet.
    3. Snijd de muis huid over de borst en vervolgens het bot borstkas naar het hart bloot te leggen met een schaar.
    4. Met behulp van een peristaltische pomp, met een 25 G naald bevestigd aan The uiteinde van de buis, steek de naald in de linker ventrikel van het hart, knip de rechter atrium om een ​​uitgang voor het bloed te maken en dan beginnen wassen met 40 ml 0,9% fysiologische zoutoplossing een snelheid van ongeveer 10 ml / min.
    5. Als het klaar is, perfuseren de muis met 35 ml ijskoude hydrogel oplossing.
      Opmerking: perfuseren met een snelheid van 10 ml / min tot zwelling van het zenuwweefsel te voorkomen.
    6. Incise de huid over de rug met een mes en verwijder vervolgens de spieren naast de gewervelde. Na het snijden van de wervelbogen enerzijds en hen flipping aan de andere kant, neem het ruggenmerg van de wervelkolom met een fijne schaar.
  3. Wissen van de muis Spinal Cord
    1. Plaats het ruggenmerg in 15 ml hydrogel oplossing overnacht bij 4 ° C.
    2. Verwijder 10 ml van de hydrogel oplossing en giet de rest van de oplossing met de ruggenmergsegmenten een 5 ml buisje. Vul het 5 ml buis met de hydrogel oplossing tot het volledig vol.
    3. Stretch een klein stukje parafilm over de bovenkant van de 5 ml buis en wikkel parafilm rond de hals van de buis. Let op: Zorg ervoor dat de parafilm contact op met de hydrogel oplossing en er zijn geen luchtbellen tussen de hydrogel oplossing en de parafilm.
    4. Zet de buis 5 ml in een 37   ° C oven gedurende de nacht. Let op de hydrogel oplossing totdat het wordt een gel.
    5. Neem de 5 ml buis uit de oven en verwijder de gel uit de buis met een sleutel (zoals een geschept 1 ml pipet tip). Verwijder de gel uit het ruggenmerg weefsel door het steken van de grove weefsel aan de gel en neem dan de grove weefsel weg (de gel zal vasthouden aan het weefsel en zal daarom worden verwijderd door het weefsel).
    6. Na het verwijderen van de gel uit het ruggenmerg weefsel, was het ruggenmerg 4 maal met 1 x PBS (pH 7,4) gedurende 24 uur op een schudapparaat.
    7. Bereid de CUBIC clearingoplossing door het oplossen van 3,85 g ureum en 3,85 g N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine in 5,38 ml gedestilleerd water.
      Opmerking: Een hete roerder wordt gebruikt. Voeg 2,31 g polyethyleenglycol-mono-p-isooctylfenylether / Triton X-100 aan de oplossing zodra duidelijk is en afkoelt tot kamertemperatuur.
      Opmerking: 10 g van deze drie stoffen zijn voor één muis.
    8. Snijd de muis ruggenmerg coronaal in 2-3 mm lange segmenten met een scheermesje en ze in 5 ml van de bovenstaande CUBIC clearingoplossing. Plaats op een schudder in de oven op 37   ° C gedurende 3 dagen.
    9. Drie dagen later, verander de clearing oplossing voor een nieuwe. Noot: de bovenstaande oplossing wordt vóór gebruik bereid.
    10. Twee tot drie dagen later na het vernieuwen van de CUBIC clearing oplossing, controleert u de transparantie van het weefsel tegen een papier met lettertype 8 letters. Als het transparant, kan de brieven worden gezien door het gewiste weefsel. Verwijder de clearingoplossing en voeg 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) om het weefsel 4 maal per dag (om de 6 uur) was.

2. immunofluorescentiekleuring

  1. Incubeer het ruggemerg segmenten in de primaire antilichaamoplossing (anti-serotonine, opgewekt in konijnen, verdund 1: 100 in PBST) gedurende 3 dagen op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
  2. Verwijder de antilichaamoplossing en voeg 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) bij de ruggenmergsegmenten 4 maal per dag (om de 6 uur) in een 37 ° C oven te wassen.
  3. Verwijder de PBST-oplossing en voeg de secundaire antilichaamoplossing (594 geconjugeerd geit anti-konijn IgG, verdund 1: 100 in PBST) om het weefsel gedurende 3 dagen geïncubeerd op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
  4. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing en voeg 4 ml PBST de ruggenmergsegmenten 4 keer wassen per dag (om de 6 uur) op een schudinrichting in een 37 ° C oven. De volgende dag het weefsel gereed voor beeldvorming.

3. Imaging

  1. Verwijder de PBST-oplossing en voeg 4 ml 85% glycerol aan de brekingsindex van het weefsel zelfs.
  2. Controleer de helderheid van het weefsel. Zodra duidelijk is in ongeveer 1 uur, zet het weefsel op een grote, dunne glasplaatje waar het bedrijf kader van de multi-foto fluorescentiemicroscoop past.
  3. Doe een paar druppels 85% glycerol naast het ruggenmerg weefsel en dekglaasje met een 22 x 50 mm glazen dekglaasje 2.
    Opmerking: De oriëntatie van het ruggenmerg bepaalt hoe het beeld eruit ziet.
  4. Zet het glaasje op het bedrijf kader van de multi-foton fluorescentie microscoop en verplaatsen het weefsel in het licht pad.
  5. Kies het Helium Neon laser lijn 594 nm en de intensiteit van de laser om het optimale niveau van de helderheid van het positieve signaal in het live-beeld te controleren.
  6. Selecteer het scangebied van het ruggenmerg weefsel met de 20X objectief (in water, NA 0,7) en zet een z-stack maken, en de diepte van elke ingesteld op 3 pm stap.
  7. Scan het weefsel van de bovenkant naar de onderkant van de z-stack onder 20X bezwaartieve en dan 63x objectief (in olie, NA 1.4) (stap grootte was 1 micrometer), respectievelijk. Reconstrueren 3D-video's met behulp van een 3D-software 28.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit gedeelte toont de resultaten van serotonine antilichaam kleuring in de transparante muis ruggenmerg met behulp van een combinatie van duidelijkheid en CUBIC protocollen. We tonen aan dat serotonerge vezels in alle lagen van het ruggenmerg met een overwicht in het ventrale gedeelte van de ventrale hoorn zijn (figuur 1, zie ook Video 1). De controleweefsel geen positieve vezels (resultaat niet getoond). In de ventrale hoorn, dicht op elkaar gepakte ser...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol beschreven laat zien hoe je het serotonerge vezels in de muis ruggenmerg met de gecombineerde DUIDELIJKHEID en CUBIC technieken. Er wordt een snellere zuiveringsproces ten opzichte van de passieve clearing protocol ontwikkeld door Cheung et al. 14 en Tomer et al. 15 en maakt het ruggenmerg weefsel goed worden ondersteund door de hydrogel tijdens het wissen.

Een belangrijke stap bij vastlegging van de muis ruggenmerg, zoals gerapporteerd do...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Australian Research Council Centre of Excellence for Integrative Brain Function (ARC Centre Grant CE140100007), een NHMRC projectsubsidie (#1086643). Prof. George Paxinos wordt ondersteund door een Senior Principal Research Fellow NHMRC-subsidie (#1043626).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Photoinitiator VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% acrylamide oplossingBio Rad161-0140http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% Bis OplossingBio Rad161-0142http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-
879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldehydeSigma158127http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=nl®ion=NL
ureumMerck Millipore66612http://www.merckmillipore.com/NL/nl/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethyleendiamineMerck Millipore821940http://www.merckmillipore.com/NL/nl/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100Merck Millipore648462http://www.merckmillipore.com/NL/nl/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sucroseSigmaS0389http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=nl®ion=NL
serotonine antilichaamMerck MilliporeAB938http://www.merckmillipore.com/NL/nl/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
geit anti konijn IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor® 594 conjugaatLife TechnologiesA-11012https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
multi-foton microscoopLeicaLeica TCS SP5 MP STEDhttp://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/
```

Referenties

  1. Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways. J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).
  2. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  3. Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn. Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).
  4. Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection. Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).
  5. Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus. Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).
  6. Bullitt, E., Light, A. R. Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X. J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).
  7. Jones, S. L., Light, A. R. Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study. J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).
  8. Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study. J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).
  9. Morrison, S. F., Gebber, G. L. Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons. J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).
  10. Barman, S. M., Gebber, G. L. The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord. Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).
  11. Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. Jr Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity. J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).
  12. Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique. Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).
  13. Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels. Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).
  14. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  15. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  16. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  17. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  18. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  19. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  20. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  21. Ertürk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
  22. Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).
  23. Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. NeuroImage. 101, 625-632 (2014).
  24. Ando, K., et al. Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D. Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).
  25. Zhang, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
  26. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 781(2015).
  27. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  28. Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images. J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

CLARITY techniekweefselverhelderingimmunofluorescente kleuringmultifotonmicroscopie3D beeldreconstructiehydrogelperfusieantilichamenkleuring
Beeldvorming Serotonerge vezels in de muis Spinal Cord Met behulp van de DUIDELIJKHEID / CUBIC Techniek
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.