Wisselend magneetveld-Responsive Hybrid Gelatine Microgels voor Controlled Drug release

Samenvatting

We presenteren een gemakkelijke methode om een ​​biologisch afbreekbare op gelatinebasis geneesmiddelafgifte platform dat magneto-thermisch gevoelige fabriceren. Dit werd bereikt door superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes en poly (N-isopropylacrylamide- co-acrylamide) in een bolvormig gelatine micro-netwerk verknoopt door genipin, samen met een wisselend magnetisch veld aanbrengsysteem.

Samenvatting

Magnetisch reagerende nano / micro-engineered biomaterialen die een strak gecontroleerde, on-demand drug delivery in staat zijn ontwikkeld als nieuwe vormen van slimme zachte apparaten voor biomedische toepassingen. Hoewel een aantal magnetisch reagerende geneesmiddelafgiftesystemen efficacies zowel via in vitro proof of concept studies en in vivo preklinische toepassingen gebleken, is het gebruik ervan in een klinische context nog steeds beperkt door hun ontoereikende biocompatibiliteit of biologische afbreekbaarheid. Bovendien zijn veel van andere perrons afhankelijk geavanceerde technieken voor hun constructies. We hebben onlangs aangetoond dat de vervaardiging van biologisch afbreekbare, gelatine gebaseerde warmte reagerende microgel door het fysisch invangen van poly (N-isopropylacrylamide- co acrylamide) ketens als een ondergeschikte component in een driedimensionaal gelatinenetwerk. In deze studie presenteren we een gemakkelijke methode om een ​​biologisch afbreekbare geneesmiddelafgifte platform waarmee een magneto-t fabricerenhermally geactiveerd drug release. Dit werd bereikt door superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes en warmte reagerende polymeren op gelatine gebaseerde colloïdale microgels, in combinatie met een alternerend magneetveld aanbrengsysteem.

Inleiding

Stimuli-responsieve drug delivery systemen die een strak gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen in reactie op ofwel endogene of exogene stimuli in te schakelen (bijv., Temperatuur of pH) zijn uitgebreid onderzocht als nieuwe vormen van slimme zachte apparaten voor drug delivery. Microschaal hydrogels zijn op grote schaal gebruikt als een drug delivery platform dat ze verlenen beheersbaar en duurzame drug afgifteprofielen evenals afstembare chemische en mechanische eigenschappen ^1-3. Met name de colloïdale microgels vertonen vele voordelen als drager voor geneesmiddelafgifte vanwege hun snelle respons op externe stimuli en geschikt injecteerbaar lokale weefsel in een minimaal invasieve wijze ^4. De poly (N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) of zijn copolymeren zijn algemeen het synthetiseren warmte reagerende microgels vastgesteld door enten pNIPAM met biologisch afbreekbare / biologisch verenigbare polymeren, gelatine, chitosan, alginaat zuur of hyaluronzuur ^5,6Waarbij een faseovergang kenmerkend pNIPAM aan zijn onderste kritische oplostemperatuur (LCST) kan worden gebruikt als een trigger van geneesmiddelafgifte ^7. We hebben recent een fabricage van biologisch afbreekbare, gelatine gebaseerde warmte reagerende microgel door het opnemen van poly (N-isopropylacrylamide- co-acrylamide) [p (NIPAM- co -AAm)] ketens als een ondergeschikte component in driedimensionale netwerken ⁸ gelatine. De gelatine / p (NIPAM- co -AAm) microgel vertoonde een afstembare ontzwelling aan temperatuurstijging, die positief gecorreleerd met de afgifte van runderserumalbumine (BSA).

Gedurende de laatste paar jaar zijn er toegenomen inspanningen om een magnetisch responsieve drug delivery platform dat de afgifte van geneesmiddel kan leiden in een on-demand mode ^9,10 ontwikkelen. Uitgangspunt voor de synthese van magnetisch reagerende medicijnafgifteplatform gebruikt de eigenschap van superparamagnetische nanodeeltjes (MNP's) warm worden wanneer zij een hoogfrequent magnetisch wisselveld (AMF), die een temperatuurgevoelig geneesmiddelafgifte triggers ontvangen. Dit houdt belofte voor toekomstige klinische toepassingen omdat dit systeem diep kan richten in het weefsel, zodat een niet-invasieve en op afstand gecontroleerde geneesmiddelafgifte en kan worden gecombineerd met hyperthermie behandeling en magnetische resonantie beeldvormend systeem ^10-12. Dergelijke platforms zijn onder meer: ​​(1) MNP / pNIPAM hybride microgeldeeltjes ^13-15 en (2) macroscopische hydrogel steigers incorporeren geïmmobiliseerd MNP ^16-18. De pNIPAM gebaseerde platforms microgel toonde een fijn afstembare volume faseovergang reactiviteit op magneto-thermische stimuli. Evenwel nog houden met ingewikkelde en geavanceerde technieken in de fabricage en het gebruik van pNIPAM polymeren met een hoog gehalte kan mogelijk zijn cytotoxisch voor cellen ^19, die hun in vivo toepassingen beperken. De macroscopische steigers vertonen een relatievely trage reactie op externe prikkels en vereisen een invasieve chirurgische transplantatie ten opzichte van colloïdaal microgels.

De water-in-olie-emulgering heeft de standaardmethode voor de productie submillimeter of micrometer-geldeeltjes ²⁰ geweest. Aan het water-olie grensvlak van de emulsie, microgeldeeltje vormt een bolvorm door de minimalisering van de oppervlakte-energie van de waterdruppel onder mechanisch dwarskracht. Deze werkwijze maakt de productie van een grote hoeveelheid waterige gel bolvormige druppels in een eenvoudige fabricage procedure en met succes voor het fabriceren van op gelatine gebaseerde microgels medicijnafgifte systemen toepassingen ^21-23 aangenomen.

Hier presenteren we een gemakkelijke methode om een ​​magnetothermally responsieve gelatine gebaseerde microgels voor geneesmiddelafgifte toepassing synthetiseren door gebruik van de water-in-olie emulgeermethode. Dit werd bereikt door het fysiek opnemen van ijzeroxide MNP's en p (NIPAM- co -AAm) ketens als een ondergeschikte component in een bolvormig microschaal gelatinenetwerk dat covalent is verknoopt door een natuurlijk verkregen verknopingsmiddel genipin, in combinatie met een hoogfrequent magnetisch wisselveld (AMF) aanbrengsysteem.

Protocol

Opmerking: Het totale proces van vervaardigen magneetveld reagerende gelatine microgels is geïllustreerd in figuur 1A.

1. Voorbereiding van oplossingen en suspensies

1. Bereid een crosslinker genipin (1% w / v) oplossing door het oplossen van 20 mg genipin in 2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS, pH 7,4). Vortex de oplossing en plaats in een 50 ^{° C} waterbad gedurende 2 uur om volledig de oplossing op te lossen.
2. Bereid een oplossing van oppervlakteactieve stof door het oplossen van 20 mg van poly (ethyleenglycol) -poly (propyleenglycol) poly (ethyleenglycol) _(Mw = 2900 Da, aangeduid als L64) in 200 ml PBS te zijn bij een concentratie van 100 ppm.
3. Bereid een 15% (w / v) gelatine-oplossing door het oplossen van 64,5 mg gelatine in 0,43 ml PBS. Vortex de oplossing en plaats het op een waterbad ^bij 37 ° C totdat een sol fase, waarbij de vloeibare oplossing wordt bereikt. Vervolgens worden geschud gelatineoplossing 2-3 keer te verzekeren the homogeniteit.
4. Bereiding van p (NIPAM- co -AAm) / MNP's oplossing met een modelgeneesmiddel (BSA):
   1. Disperse 10,75 mg hydrofiele MNP's in 0,43 ml PBS en los vervolgens 12,9 mg p (NIPAM- co -AAm) in MNP suspensie om de concentratie te maken bij 3% (w / v). De verhoogde concentratie van p (NIPAM- co -AAm) kan worden gebruikt om een verhoogde ontzwelling gedrag van microgels bereiken.
   2. Gebruik Texas-rood geconjugeerde runderserumalbumine (BSA-TR; M _w ~ 66 kDa) als een modelgeneesmiddel. Los op 0,5 mg TR-BSA in het mengsel van p (NIPAM- co -AAm) / MNP's.
5. Bereid mengsels van gelatine / p (NIPAM- co -AAm) / MNP / BSA-oplossing (0,86 ml) door toevoeging van mengsel van p (NIPAM- co -AAm) / MNP's (0,43 ml) in de gelatineoplossing (0,43 ml) en vervolgens grondig vortex ze een homogeen mengsel te maken. Zo is de concentratie van polymeren en MNP wordt de helft van de oorspronkelijke concentraties in het uiteindelijke mengsel.

2. emulsificatie

1. Giet 15 ml siliconenolie [polydimethylsiloxaan (viscositeit 350 cSt)] in een schone en steriele beker.
2. Meteen bij het ​​vooraf bereide waterige mengsels van gelatine / p (NIPAM- co -AAm) / MNP / BSA-oplossing (0,86 ml) in de siliconenolie en emulgeren het waterige mengsel in de oliefase door roeren met een magnetische roerstaaf 900 rpm bij 30 ^{° C} gedurende 30 minuten.

3. gelering en de overdracht van micro-druppeltjes aan een waterige oplossing

1. Breng de emulsie (~ 16 ml) in een bekerglas van 50 ml buis.
2. Koel de buis gedurende 10 minuten bij 4 ° C voor gelering van de microdruppels in de olie.
3. Vul de buis met de voorbereide L64-oplossing (bij 4 ^{° C)} tot 50 ml en schud de buis. Het is mogelijk dat een deel van L64 oppervlakteactieve binnen de microgels zou zijn.
4. Centrifugeer de buis gedurende 20 minuten bij 2300 xg bij ⁴ ° C
5. Regularly controleren op de aanwezigheid van de pellet geldeeltjes aan de zijde van de buis. Wanneer de deeltjes niet worden gezien, centrifugeer 20 minuten bij een gelijke snelheid en temperatuur. Overgaan tot supernatant voorzichtig verwijderen zonder de pellet gevormd op de binnenwand van de buis te verstoren.
6. Herhaal stap (3.3) tot (3.5) eens te meer. Telkens overbrengen van het monster naar een nieuwe buis aan het opnemen van een oliedruppeltjes in de microgel suspensie voorkomen. Na deze stap, controleert oppervlakteactieve stoffen of oliedruppeltjes niet aanwezig in het monster suspensie. Echter kan herhaalde scheidingsstappen leiden tot verlies uitgangsstoffen.

4. Covalente verknoping van de Microgels

1. Voeg 2 ml genipin oplossing (bereid in paragraaf 1) aan de pellet geldeeltjes en goed mengen door vortexen de oplossing.
2. Zo snel mogelijk de buis van de suspensie in een waterbad bij 23 ^o C een covalente verknopingsreactie initiëren tijdens des(bijv., 5-120 min) IRED verknopen van de tijd.
3. Na verknoping, onmiddellijk buitensporige crosslinkers verwijderen Werp het genipin oplossing resuspenderen de microgels in PBS, centrifugeren en de buis gedurende 20 minuten bij 2300 xg (4 ^{° C).} Indien nodig, voorzichtig uit elkaar breken gevormd pellet met een pipet tip. Deze wasstap kan herhaald worden 3 keer als de genipin wordt nog in de oplossing.
4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de microgelen in PBS bij een gewenste dichtheid (bijv., 5 x 10 ⁶ microgels / ml) aan het aantal met een hemocytometer.
5. Voor microscopische waarnemingen, laadt de microgel schorsing in de ruimte tussen een dia glas en een cover slip en sluit de grens van het deksel slip met epoxy hars.

5. Toepassing van wisselend magneetveld voor het activeren van geneesmiddelafgifte

1. De buis met de gewenste concentratie van microgels in waterige media inde kamer van magnetische spoelen. Indien nodig steekt een vezeloptische temperatuursonde in de buis temperatuurveranderingen van de media controleren tijdens het aanbrengen van AMF.
2. Toepassen hoge frequentie (> 100 kHz) AMF bij een bepaalde veldsterkte (> 5 kA / m) en een bepaalde tijd. Na het aanbrengen van AMF gecentrifugeerd monsterbuis gedurende 20 minuten bij 2273 xg (4 ^{° C)} en verzamel de bovenstaande vloeistof om de hoeveelheid TR-BSA afgegeven uit microgel naar de omringende media met behulp van spectrofotometrie te kwantificeren. De excitatie en emissie golflengten Texas Rood zijn 584 nm en 612 nm, respectievelijk.

Resultaten

Wanneer het protocol correct uitgevoerd, moet de gefabriceerde microgelen een goed gekarakteriseerd bolvormige morfologie en colloïdale dispersie met een diameter bezitten in het bereik van 5 urn tot 20 urn (Figuur 1B en C). MNP's hetzij fluorescerende of fluorescerend BSA kan worden gebruikt om te bevestigen of MNP's of geneesmiddelen (BSA in deze studie) correct zijn ingekapseld in de microgel (figuur 1D). De gefabriceerde microgels kunnen stab...

Discussie

De hier beschreven techniek toont een proof of concept voor het gebruik van nanodeeltjes microgel-hybriden voor magneto-thermisch getriggerde geneesmiddelafgifte. Dit werd bereikt door fysisch invangen MNP's en p (NIPAM- co -AAm) ketens op microschaal driedimensionale gelatinenetwerk verknoopt door genipin. Het magneetveld reagerende platform volstond om warmte in de microgel in reactie op een afstand aangebracht AMF, waardoor de vrijmaking van een model geneesmiddel, BSA geactiveerd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Gelatine	Sigma-Aldrich, MO, USA	G2500	Gelatine type A, varkenshuid
poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)	Sigma-Aldrich, MO, USA	738727	MW = 20.000, LCST = 34 - 38 °C
Silicone-olie	Sigma-Aldrich, MO, USA	378372	Viscositeit 350 cSt
Pluoronic L64	Sigma-Aldrich, MO, USA	435449	poly(ethyleenglycol)-blok-poly(propyleenglycol)-blok-poly(ethyleenglycol)
genipine	TimTec LLC, DE, USA	ST080860	MW = 226.23
Magnetische nanodeeltjes (MNP's)	Micromod Inc, Duitsland	79-00-102	nanomag-D-spio, 100 nm
TR-BSA	Life Technologies, NY, VS	A23017	Albumine uit runder serum (BSA), Texas Red-conjugaat