Hier wordt een protocol gepresenteerd om primaire fibroblast/myofibroblast (MF) culturen te isoleren en te vestigen uit bevroren maag-, dunne darm- en colonweefsel, waardoor cellen met een MF-fenotype worden verkregen. Deze cellen expresseren CD90, α-SMA en vimentin. MF's kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan functionele assays, inclusief enzymatische activiteit en cytokineproductie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van CD 90+ Fibroblast / Myofibroblasten van Human Frozen Maag Monsters
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fibroblasten / myofibroblasten (MFS) is steeds meer aandacht voor hun rol in de pathogenese en hun bijdragen aan zowel de wondgenezing en de bevordering van de tumor micro-omgeving. Hoewel er momenteel vele technieken voor het isoleren van magnetische velden van gastrointestinale (GI) weefsels, dit protocol introduceert een nieuw element van isolatie van deze stromacellen uit bevroren weefsel. Bevriezing exemplaren GI weefsel niet alleen kan de onderzoeker om monsters uit de hele wereld collaborateurs, biobanken, en commerciële leveranciers te verwerven, maar maakt ook de vertraagde verwerking van verse monsters. De beschreven protocol zal consequent karakteristieke spoelvormige cellen opleveren met de MF fenotype dat de markers CD90, α-SMA en vimentine uiten. Omdat deze cellen zijn afgeleid van patiëntmonsters, het gebruik van primaire cellen verleent ook het voordeel nauw nabootsen magnetische velden van ziekten, namelijk kanker en inflammatoire darmziekten. Deze techniek heeft been gevalideerd in de maag, dunne darm en dikke MF primaire cultuur generatie. MF primaire kweken kan worden gebruikt in een breed scala van experimenten gedurende een aantal passage en hun zuiverheid beoordeeld door zowel immunocytochemie en flowcytometrie analyse.
Inleiding
Myofibroblasten / fibroblasten (MFS) vertegenwoordigen een rijke populatie van cellen in de gastro-intestinale (GI) slijmvlies. Deze stromacellen liggen net onder het epitheel en vormen een verbonden netwerk binnen mucosale lamina propria van de darm. Macrofagen zijn niet alleen verantwoordelijk voor de afzetting van extracellulaire matrix, maar door paracriene regulering kan elektrolytentransport, restitutie en barrièrefunctie van de aangrenzende epitheel 1, 2 beïnvloeden. Bovendien zijn MFS aangetoond dat het een belangrijke rol speelt bij ontstekingen en weefsel remodeling 3, 4. Myofibroblasten een kritiek deel van de tumor micro-omgeving, waarbij ze ook bekend als kanker geassocieerde fibroblasten, en bijdragen aan de tumorcelgroei en dienen als een niche voor kanker stamcellen 3. Opkomende gegevens suggereren dat magnetische velden ook kan dienen als lokale antigeen presenterende cellen. Bovendien, MFS functie als belangrijke regulatoren van aangeboren en adaptieve immuunreacties, producing diverse cytokines en groeifactoren 5.
Bij gezonde individuen wordt MFS cellen aangenomen differentiëren van mesenchymale stamcellen en expressie op hun celoppervlak, de mesenchymale marker, CD90 3, 5. Deze cellen zijn positief voor vimentine, maar negatief voor epitheel en hematopoietische cellen marker, EpCAM en CD45 respectievelijk. Myofibroblasten worden voorgesteld om een geactiveerde vorm van fibroblasten en kan worden onderscheiden van niet-geactiveerde fibroblasten door de expressie van α-SMA 5.
In het afgelopen decennium, verschillende benaderingen voor het isoleren van myofibroblasten uit humane colon mucosa gepubliceerd-grotendeels gebaseerd op de werkwijze die oorspronkelijk beschreven door Mahida et al. 5-8. Terwijl individuele studies rapporteren isolatieprocedures uit verschillende darmmucosa, geen algemeen protocol voor de isolatie van magnetische velden van meerdere gebieden van het maagdarmkanaal (bijv maag, kleine large darmslijmvlies) is gepubliceerd. De hierin gepresenteerde protocol getest en met succes gebruikt voor alle drie type weefsel hierboven vermeld. . Bovendien zijn procedures voor het isoleren Macrofagen uit bevroren GI slijmvlies niet gerapporteerd.
Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode, die is gebaseerd op enzymatische vertering en tegelijkertijd zorgt voor de isolatie van menselijke darm mucosale MF cultuur en flowcytometrie analyse vers geknipt eencellige mucosale preparaten. Deze techniek levert betrouwbare primaire kweken met een MF fenotype. Verder kunnen dezelfde methoden worden gebruikt voor het isoleren MF uit ingevroren specimens van maag en dunne darm weefsels ook. Isolatie van myofibroblasten verse GI weefsel is eerder beschreven; echter, het gebruik van bevroren monsters biedt veel voordelen. Namelijk, zouden de onderzoekers in staat om te verzamelen en op te slaan weefsels uit een aantal medewerkers over de hele wereld die de capabilijkheid om het schip ingevroren weefselmonsters. Bovendien kunnen onderzoekers de inzameling van afgedankte weefsel uit de operatiekamer en / of endoscopie suite en onmiddellijke verwerking van het weefsel voor isolatie tot conflicten met hun huidige experimenten schema te vinden. Ook, vanwege de onvoorspelbare aard van de operatie, weefsels kan laat op de dag optreden, waarbij de tijd voor bewerking weefsel beperken. Bevriezen van weefsel voor latere verwerking zal deze uitdagingen te verbeteren.
Tenslotte, deze werkwijzen zijn met succes toegepast bij het isoleren van colon, maag en dunne darm myofibroblasten bij ziektetoestanden zoals colorectaal carcinoom en inflammatoire darmziekten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het protocol voor het verkrijgen van weggegooid menselijk weefsel van chirurgische patiënten en de oprichting van primaire kweken werd goedgekeurd door de Universiteit van Texas Medical Branch en de Universiteit van New Mexico Institutional Review Boards. De algemene eisen voor het verkrijgen van menselijke weefselmonsters wordt hieronder beschreven. Merk op dat aangezien magnetische velden kunnen worden geïsoleerd uit ingevroren weefsel, biobanken en commerciële verkopers zijn ook haalbare opties.
1. Zorg voor Human Tissue
- Geef protocol voor de menselijke dikke darm weefsel om de institutionele Review Board goedkeuring te verkrijgen.
- Vestigen samenwerkingen met algemene chirurgen en / of colorectal chirurgen om menselijk weefsel te verkrijgen voor onderzoek. De samenwerking met de pathologie-afdeling is verplicht omdat zij bepalend het weefsel dat niet nodig is voor diagnose en kunnen worden aangewezen voor onderzoek.
- Adviseer de patholoog om weefsel te voorzien van de gezwellen en dan grossly normale mucosa minimaal 5 cm van de tumor. Direct plaatst de monsters in ijskoud wassen media en plaats op ijs. De patholoog de hoeveelheid weefsel die veilig kan worden gegeven voor onderzoek te bepalen. De minimale weefselreactie vereist MF isolatie 1,5 mm 2.
- Met het verkregen weefsel of onmiddellijk aan de primaire kweken of diepvriezer en plaats vast bij -80 ° C voor toekomstig isolatie.
- Wanneer invriezen voor later isoleren, snijd het weefsel in ongeveer 1 - 2 mm 2 stukken, te plaatsen in een cryogene buis met 1 ml vriesmedium (zie hieronder) en bewaar bij -80 ° C. Opmerking: Met behulp van dit protocol, is een succesvolle isolatie van magnetische velden van weefsel voor meer dan 4 jaar bevroren waargenomen.
2. Bereid reagentia
- Voor collagenaseoplossing: Bereid 100 U / ml collagenase I, II en IV in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met Ca2 + / Mg2 + (zie Materialen Tabel ). WAARSCHUWING: Collagenase actieve concentreringseenheid en zuiverheid kan afhankelijk van leverancier tot leverancier, die de efficiëntie van het weefsel vertering en / of handhaving van de epitoop op het mucosale celoppervlak kunnen belemmeren. Om deze valkuilen te vermijden, gebruiken collagenase met de hoogste graad van zuiverheid (≥95%) en de voorbereiding van de voorraad oplossing op basis van de actieve eenheden concentratie.
- Bereid op waterbasis DNase stockoplossing in 10 mg / ml (3,55 UA / mg).
- Bereid Wash media: (MEM: 89 ml, antibiotica-Antimycoticum, 100x: 1 ml; hitte-geïnactiveerd FCS: 10 ml)
- Bereid Fibroblast groeimedia: MEM: 500 ml fles; L-glutamine (200 mM): 5 ml; MEM niet-essentiële aminozuren, 100x oplossing: 5 ml; ciprofloxacine HCl (10 mg / ml): 570 pl; Antibiotica-Antimycoticum, 100x oplossing: 10 ml; natriumpyruvaat (100 mM): 5 ml; hitte-geïnactiveerd FCS: 50 ml
- Bereid Freeze media: fibroblast groeimedium (reagens 2,4) door toevoeging van 10% dimethylsulfoxide (DMSO), filtreer-sterilize met een 0,22 urn filter.
3. Enzymatisch Digest Human Tissue
- Als het weefsel in de vriezer media, plaats cryovial in warm (~ 37 ° C) water werd bevroren tot weefsel en de media wordt ontdooid.
- Voor 4-5 van 2 mm 2 stukjes weefsel, wassen weefsel tweemaal met 10 ml HBSS zonder Ca2 + / Mg2 +.
- Zodra het weefsel is geregeld door de zwaartekracht, voorzichtig de bovenstaande vloeistof zonder spinning monster.
- Voeg 10 ml collagenase oplossing van het monster en het weefsel-oplossing mengsel in een steriele, DNase / RNase-vrije buis met ingebouwde rotors voor monster dissociatie. Gebruik collagenase aan de extracellulaire matrix die de basale aspect van epitheliale cellen omgeeft en vormt de niet-cellulaire gedeelte van het mucosale lamina propria dissociëren.
- Strak dicht buis en zet hem ondersteboven op de mouw van de dissociator (bijv gentleMACS). Als het lab het geen toegang heeft tot thij voornoemd apparatuur, verhoging van de tijd van elke spijsvertering stap om vergelijkbare resultaten te verkrijgen.
- Start het programma h_tumor_01, een vooraf ingestelde profiel meegeleverd met de machine (totale duur van 36 sec, met intermitterende pulsen variërend van 1.000 - 4.000 tpm, met 268 rondes per run).
- Na afloop van het programma, los van de buis dissociator.
- Incubeer monster gedurende 45 min bij 37 ° C onder continue rotatie op schudinrichting bij 140 rpm. Opmerking: Voor verschillende hoeveelheden weefselmonsters, kan de tijd van de spijsvertering proportioneel worden verlaagd of verhoogd (dwz grotere hoeveelheden weefsel wellicht meer tijd nodig).
- Hechten buis ondersteboven op de mouw van de dissociator.
- Kies en start het programma h_tumor_02 (totale duur van 37 sec, met intermitterende pulsen variërend van 1.000 - 4.000 tpm, met 235 rondes per run).
- Na afloop van het programma, los van de buis dissociator.
- Voeg 50 ul DNase voorraadoplossing. Gebruik DNAse te distantiëren / verwijderen van dode cellen en DNA-fractie van cellulaire puin dat leidt tot klonteren cel.
- Incubeer monster gedurende 30 min bij 37 ° C onder continue rotatie op schudinrichting bij 60 tpm.
- Hechten buis ondersteboven op de mouw van de dissociator opnieuw.
- Kies en start het programma h_tumor_03 (totale duur van 37 sec, met intermitterende pulsen variërend van 1.000 - 4.000 tpm, met 168 rondes per run).
Opmerking: Als het weefsel niet volledig verteerd, centrifuge bij 250 x g gedurende 10 min bij 20 ° C, gooi supernatant, resuspendeer in 2 ml cel dissociatie oplossing en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. - Passeren de celsuspensie door steriele 70 micrometer cel zeef.
- Centrifugeer celsuspensie bij 250 xg gedurende 10 min bij 20 ° C. Zuig supernatant volledig.
- Was celpellet tweemaal met 25 ml HBSS zonder Ca2 + / Mg2 + en de bovenstaande vloeistof.
- Vóór de laatste wash, tel het aantal cellen met behulp van een geautomatiseerde cel telsysteem beschikbaar in het laboratorium of handmatig met behulp van hemocytometer. Voor MF primaire kweek generatie overgaan voor stap 3.19.1, voor de analyse of sorteren van magnetische velden met flowcytometrie te gaan voor stap 3.19.2.
- Voor isolatie en groei van zuivere MF kweek (figuur 1), gooi het supernatans van laatste centrifugatie, resuspendeer celpellet in de juiste hoeveelheid fibroblast isolatiemedia nodig zaad tot 4 x 10 6 cellen in 3 ml van het medium per putje in 6 goed, celcultuur-behandelde platen. Ga verder met stap 3.20.
- Voor de analyse of sorteren van magnetische velden met flowcytometrie Plaats maximaal 2 x 10 6 in 2 ml fibroblast isolatiemedia in 24 goed, low-verbindingsplaat en incubeer O / N bij 37 ° C met 5% CO2. Dit is het celoppervlak epitopen die beïnvloed kunnen worden door de enzymatische procedure te herstellen. Verzamel dan celsuspensie en tel teruggewonnen cellen en ga verdervoor immunokleuring en flowcytometrie analyse 8.
- Kweek cellen bij 37 ° C met 5% CO2. Veranderen media elke 2-3 dagen tot de vorming van ~ 80% confluent MF monolaag (figuur 1D-E).
- Passage cellen in T25 kolven met van 6 puts plaat bij verhouding 1: 1 en groeien ~ 10 - 100% confluentie - 14 dagen in fibroblast groeimedium te 80 bereiken.
- Expand incubeer passage cellen van T25 tot T75 cellen bij verhouding 1: 2. Zodra de cellen confluentie bereiken één kolf gebruikt voor de analyse van geïsoleerde MF zuiverheid behulp van doorstroomcytometrie zoals hierboven 5 beschreven. Bevriezen of passage andere T75 kolf van MF cultuur in verhouding 1: 3.
Opmerking: Bij analyse door doorstroomcytometrie, wordt verwacht dat GI slijmvlies stromale MF van mesenchymale oorsprong die groeien in cultuur na fenotype: EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentine +, α-SMA +, CD90 +.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met deze enzymatische digestie protocol, hebben we consistent kunnen isoleren en kweken MF populatie gut CD90 + mucosale stromacellen van GI chirurgische monsters en biopsies (Figuur 1). Zichtbare MF kolonie proliferatie worden waargenomen op dag 2-5 na zaaien mononucleaire celsuspensies in 6 well platen (Figuur 1A-B). De MF primaire culturen te bereiken ~ 50-70% samenvloeiing van dag 7-11 (figuur 1C-D).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel dit protocol is ontwikkeld voor het onderzoek verzoek slechts in het licht van toenemende cruciale belang van stromale cellen als een kankervaccin prognostische biomarkers en therapeutisch doel, de mogelijkheid om "functionele" biospecimens om later invriezen biedt een aanzienlijk voordeel. Dit vertegenwoordigt een uniek voordeel voor het creëren van klinische biorepository, die als extra instrumenten kunnen serving de ontwikkeling van geneeskunde 10, 11 te bevorderen. Vergelijkbaar met de be...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) en het Institute for Translational Sciences aan de University of Texas Medical Branch, en een Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70 µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
Referenties
- Yamaguchi, H., et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485(2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- Roncoroni, L., et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7 (40), (2009).
- Pinchuk, I. V., et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798(2013).
- Pinchuk, I. V., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215(2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611(2013).
- Schiller, J. H., Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
