Methodenartikel

Initiëren Differentiatie in Onsterfelijk Multipotent Otic Progenitor Cellen

DOI:

10.3791/53692

⸱

2 januari 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cell Biology & Neuroscience, Rutgers University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige protocollen om geïmmortaliseerde multipotente otische voorlopercellen (iMOP) en otische differentiatie te onderhouden worden beschreven. Cultuurcondities en moleculaire markers die differentiatie naar sensorische epitheel en spiraalvormige ganglionneuronen (SGN) aangeven, worden benadrukt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) of embryonale stamcellen (ESC) voor celvervangende therapieën belooft veel. Verschillende beperkingen, waaronder lage opbrengsten en heterogene populaties van gedifferentieerde cellen, belemmeren de voortgang van stamceltherapieën. Een bestemd geïmmortaliseerde multipotente otische voorloperceellijn (iMOP) werd gegenereerd om de efficiënte differentiatie van grote aantallen functionele haarcellen en spiraalganglionneuronen (SGN) voor binnenoorcelvervangende therapieën te vergemakkelijken. Uitgaande van gedissocieerde culturen van enkele iMOP-cellen, werden protocollen beschreven die celcyclusexit en differentiatie bevorderen door terugtrekking van basic fibroblast growth factor (bFGF). Een significante afname van proliferende cellen na bFGF-terugtrekking werd bevestigd met behulp van een EdU-celproliferatie-assay. Tegelijkertijd met een afname in proliferatie, resulteerde succesvolle differentiatie in expressie van moleculaire markers en morfologische veranderingen. Immunokleuring van Cdkn1b (p27KIP) en Cdh1 (E-cadherine) in iMOP-afgeleide otospheren werd gebruikt als indicator voor differentiatie in binnenoorzintuiggebiedsepitheel, terwijl immunokleuring van Cdkn1b en Tubb3 (neuronaal β-tubuline) werd gebruikt om iMOP-afgeleide neuronen te identificeren. Het gebruik van iMOP-cellen biedt een belangrijk hulpmiddel voor het begrijpen van celbestemmingsbeslissingen gemaakt door binnenoorneurosensorische voorlopers en zal helpen bij het ontwikkelen van protocollen voor het genereren van grote aantallen iPSC- of ESC-afgeleide haarcellen en SGN's. Deze methoden zullen de inspanningen versnellen voor het genereren van otische cellen voor vervangende therapieën.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De organen van het binnenoor, de cochlea, utriculus, sacculus en drie halfcirkelvormige kanalen, bemiddelen het vermogen om te horen en te balanceren. In de cochlea zetten haarcellen geluiden om in elektrische signalen die worden doorgegeven aan de spiraalganglionneuronen (SGN). De SGN's genereren actiepotentialen om neurale signalen door het auditieve circuit te verspreiden. Genetische mutaties, ototoxische geneesmiddelen en blootstelling aan harde geluiden dragen bij aan het afsterven van haarcellen en SGN's, wat resulteert in gehoorverlies1-4. Eenmaal verloren, worden deze cellen niet vervangen. Het gebruik van iPSC en ESC om nieuwe haarcellen of SGN's te genereren, biedt grote belofte voor therapieën voor het vervangen van cellen in het binnenoor5-8. Een snelle vooruitgang heeft aangetoond dat pluripotente stamcellen en uit het binnenoor afgeleide voorlopers zich kunnen differentiëren in haarcellen en SGN's in verschillende rijpheidsstadia. Zoogdierlijke embryonale stamcellen (ESC) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) kunnen worden gebruikt om functionele haarcellen en SGN's te genereren9-11. Stamcellen en voorlopercellen afgeleid uit het zoogdierlijke binnenoor zijn ook aangetoond om haarcellen en neuronen te vormen met eigenschappen van hun in vivo cellulaire tegenhangers12-16.

Gebruik van iPSC of ESC-afgeleide otische voorlopers om verloren haarcellen en SGN's te vervangen vereist efficiënte differentiatie. Onjuiste differentiatie of aanhoudende proliferatie van geënt stamcel-afgeleide voorlopers in het binnenoor kan de functie van het binnenoor verslechteren en een tumorgeen risico vormen, zoals teratoombevorming in het binnenoor17. Er is een duidelijke behoefte aan het ontwikkelen van kweekcondities en het begrijpen van de differentiatie van otische voorlopers. Een strategie bij het ontwikkelen van deze methoden is om celbestemmingsbeslissingen na te bootsen die worden gemaakt door neurosensorische voorlopers tijdens de ontwikkeling van het binnenoor. Protocollen die proliferatie voorkomen en otische voorlopers direct naar haarcellen of SGN's leiden, zullen helpen de veiligheid en effectiviteit van vervangingstherapieën te verbeteren.

Tijdens de ontwikkeling begint het binnenoor met het verdikken van het oppervlakte ectoderm in een beperkt gebied tussen rhombomeren 5 en 6 om de otische placode te worden. Terwijl de otische placode invagineert om een otische beker te vormen, geeft een verzameling cellen in het voorste gebied van de otische beker aanleiding tot het neural-sensorisch-competente domein (NSD), dat voorlopers bevat van haarcellen en neuronen van het binnenoor18. Bestmmingsonderzoek van muis, kip en zebravis ontwikkelende binnenoor suggereren meerdere populaties van neurosensorische voorlopers die aanleiding geven tot de sensorische haarcellen, omringende ondersteunende cellen en otische neuronen19-22. Het high mobility group transcriptiefactor, Sox2, is betrokken bij sensorische celspecificatie en wordt gebruikt als een marker voor binnenoor voorlopers23,24. Hypomorfe mutaties die de Sox2 expressieniveaus in het binnenoor verlagen, resulteren in het verlies van de haarcellen, ondersteunende cellen en SGN's in de cochlea25,26.

Om otische voorlopercellen te bestuderen die celbestemmingsbeslissingen ondergaan, werd eerder een bestemmingsbeperkte geïmmortaliseerde multipotente otische voorloper (iMOP) cellijn van Sox2-uitdrukkende cochleaire voorlopers gevestigd. iMOP cellen werden oorspronkelijk afgeleid van embryonale E12.5-13.5 cochlea en geïnfecteerd met een c-Myc retrovirus27. iMOP cellen kunnen continu prolifereren als kolonievormingscellen die bekend staan als otosferen en hebben de capaciteit om te differentiëren in haarcellen, ondersteunende cellen en SGN's27. Het begrijpen van de capaciteit van iMOP cellen om te differentiëren in verschillende otische lijnen, maakt de toepassing van deze bevindingen mogelijk om efficiënt iPSC of ESC-afgeleide haarcellen en SGN's te genereren. Efficiënte differentiatieprotocollen zullen nieuwe wegen openen voor celvervangingstherapieën van binnenoorziekten die ongevoelig zijn voor conventionele behandelingen. Een cruciale kwestie bij het genereren van otische cellen door in vitro celkweek is om differentiatiemarkeringen te hebben die helpen bepalen of cellen zich aan het differentiëren zijn. Cdkn1b (p27KIP) is uitgebreid gebruikt als een vroege marker voor differentiatie in het zich ontwikkelende binnenoor, echter, is de expressie van Cdkn1b in iMOP cellen en hoe het correleert met differentiatie niet behandeld. In deze studie worden de huidige kweekcondities en hoe Cdkn1b expressie correleert met andere markeringen van iMOP differentiatie beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Behoud van Self-vernieuwing in IMOP Cellen

  1. Bereid iMOP cultuur media: DMEM / F12, 1X B27 supplement, 25 ug / ml carbenecillin en 20 ng / ml bFGF. Maak 50 ml iMOP voedingsbodems met steriele reagentia. Warmen 49 ml DMEM / F12 in een 50 ml conische in een 37 ° C waterbad.
    1. Ontdooi 50X B27 supplement en filter gesteriliseerd 100 mg / ml carbenecillin porties gedurende 5 min in een 37 ° C waterbad. Ontdooien 100 ug / ml bFGF portie bij kamertemperatuur. Voeg 1 ml 50X B27, 10 pi 100 pg / ml bFGF en 12,5 pl van 100 mg / ml carbenecillin in DMEM / F12.
  2. Gebruik 3 ml medium in een 60 mm weefselkweekplaat te kweken iMOP cellen. Voeg vers medium aan culturen om de andere dag verdubbeling van de omvang van de media. Zorg ervoor dat de concentratie van bFGF niet beneden 5 ng / ml.
    1. Culture iMOP cellen bij 37 ° C met 5% CO 2 Passage cellen na 5-7 dagen kweek zoals aangegeven in de onderstaande stappen. Transfer cultuur aan een 15ml conische met behulp van een 10 ml pipet tip.
  3. Voeg 1 mM EDTA in HBSS door verdunning van 0,1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 in 50 ml HBSS. Pre-warm 1 mM EDTA in HBSS in een 37 ° C waterbad.
  4. Oogst cellen door zwaartekracht sedimentatie of centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 min. bij kamertemperatuur. Zwaartekracht sedimentatie, plaats de 15 ml conische met de culturen in de 37 ° C incubator voor 5-10 min. Na die tijd acht de otospheres verzamelen op de bodem van de 15 ml conische.
    OPMERKING: Overmatig middelpuntvliedende kracht kan celschade veroorzaken.
  5. Zorgvuldig aspireren bracht media met een pipet 2 ml aspireren zonder de celpellet. Voeg 0,5 ml voorverwarmd 1 mM EDTA HBSS oplossing pellet cel. Met behulp van een pipet P1000, voorzichtig pipet op en neer 2-3 keer. Plaats conisch bij 37 ° C en incubeer gedurende <5 min tot dissociatie in afzonderlijke cellen vergemakkelijkt.
  6. Wervelen voorzichtig de cel oplossing om te bepalen of otospheres worden gescheiden. Als er geen otobollen sediment op de bodem van de conische worden de cellen gedissocieerd. De incubatietijd kan variëren.
    OPMERKING: Langdurige incubatie met EDTA leidt tot overmatige celdood.
  7. Verwijder cellen van 37 ° C, voeg 2 ml van de media om te neutraliseren en verdun de EDTA. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren out verdunde EDTA met een pipet 2 ml opzuigen en voeg 5 ml 1X PBS aan de cellen te wassen.
  8. Spin cellen neer op 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuigen uit 1X PBS met een pipet 2 ml opzuigen. Resuspendeer de cellen met behulp van een P1000 pipet 0,5 ml iMOP kweekmedium door zachtjes en neer te pipetteren 2 - 3 keer.
  9. Tellen cellen met behulp van een microfluïdische deeltje teller met de juiste cassettes 28. Een samenvloeiing plaat van iMOP cellen ~ 6 X10 bevatten 6 cellen. Verdun de cellen 1: 100 in media en voeg 75 ul celoplossing in de cassette voor het tellen. Plaat 1 x 10 6 cellen in een 6 cm schotel in iMOP Culture media (~ 1: 10 verdunning). Passage iMOPs elke 5-7 dagen.
    OPMERKING: Cellen die grote otospheres vorm of in de onderkant van de weefselkweekschaal zullen differentiëren. Cellen zullen ook sterven als de culturen zijn meer dan confluent.

2. invriezen en ontdooien IMOP Cellen

  1. Bereid synthetisch invriesmedium door ontdooien en equilibreren van de oplossing tot 4 ° C voor het invriezen cellen.
  2. Verzamel cellen uit confluente 6 cm schaaltje iMOP cellen. Gebruik een pipet 10 ml en overdracht cellen (~ 6 - 8 x 10 6 cellen) in een 15 ml conische.
  3. Oogst cellen door zwaartekracht sedimentatie of centrifugeren bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Als de otospheres klein zijn, zullen de cellen niet te regelen door de zwaartekracht sedimentatie. Optioneel: Tellen cellen met behulp van stap 1,9 tot totale aantal cellen te bepalen.
  4. Zuig bracht media met behulp van een 2 ml opzuigen pipet terwijl de losse cel pellet achter.
  5. Voeg 0,25 ml van synthetische bevriezing media ce mengenlls bij een dichtheid van 5 x 10 ~ 5 om 3 x 10 6 cellen / ml. Voorzichtig pipet cellen met een P1000 pipet. Breng de celsuspensie om cryogene flesjes met een P1000 pipet met 1 ml gefilterd tip.
  6. Plaats de flacons in een alcoholvrije bevriezing container en zet de container invriezen bij -80 ° C tot de temperatuur 1 ° C per minuut te verlagen tot de temperatuur bereikt -80 ° C.
  7. Voor langdurige opslag van cellen dragen de flesjes de dampfase van vloeibare stikstof opslagtank. Te ontdooien cellen voor cultuur, evenwicht cryogene flacon met bevroren cellen bij -80 ° C.
  8. Pre-warm iMOP cultuur media in een 37 ° C waterbad.
  9. Ontdooi de bevroren flacon snel door zwenken van de bodem van de flacon in een 37 ° C waterbad. Voeg 1 ml voorverwarmde iMOP cultuur media om ontdooide cellen eenmaal de laatste ijskristal verdwijnt. Overdracht cellen in een 15 ml conische en voeg een extra 4 ml iMOP cultuur media
  10. Spin de co 15 mlnische gedurende 5 min. bij 200 xg en zuig het verbruikte media. Resuspendeer de cellen in 2 ml kweekmedium iMOP en plaat cellen in een 6 cm schaaltje. Incubeer kweken bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende expansie.

3. Differentiatie IMOP cellen in Sensory epitheel

  1. Bereid 50 ml iMOP sensorische epitheel differentiatie media: DMEM / F12, 1X B27 supplement, 25 ug / ml carbenecillin. Maak 50 ml iMOP sensorische epitheel differentiatie media. Warmen 49 ml DMEM / F12 in een 50 ml conische in een 37 ° C waterbad. Dooi 50X B27 supplement en 100 mg / ml carbenecillin monsters gedurende 5 min. in een 37 ° C waterbad. Voeg 1 ml 50X B27 en 12,5 pl van 100 mg / ml carbenecillin in DMEM / F12.
  2. Om te oogsten, distantiëren, resuspendeer en te tellen cellen herhaal stappen 1,4-1,9
  3. Plaat 1 x 10 6 cellen in een 6 cm schotel op dag -3 behulp iMOP cultuur media. Op dag 0, overdracht kweken met een pipet 10 ml in een 15 ml conische. Verzamel de otobollen door zwaartekracht sedimentatie zoals vermeld in stap 1,6. Aspireren out bracht media met een pipet 2 ml opzuigen en laat de otospheres aan de onderzijde van de conische.
  4. Add zachtjes in 2 ml van de zintuiglijke epitheel differentiatie media. Transfer otospheres een 6 cm schaaltje met een grote diameter 10 ml pipet.
    OPMERKING: Mechanische scheren van harde pipetteren kunnen cellen distantiëren van de otospheres.
  5. Voeg 2 ml vers sensorische epitheel differentiatie media culturen om de andere dag. Eventueel kunnen de cellen worden verzameld door zwaartekracht sedimentatie en media vervangen.
  6. Verzamel otospheres op dag 10 door de overdracht aan een 15 ml conische en waardoor de otospheres om sediment, zoals vermeld in stap 1.6.Aspirate de media bracht met een 2 ml opzuigen pipet en laat de otospheres ongestoord.
  7. Fix otospheres door incubatie in 4% formaldehyde in 1X PBS gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Verwijderen formaldehyde-oplossing, wassen otospheres met wasbuffer (1X PBS met 0,1% Triton-100) vóór incuberen in blokkerende buffer (1X PBS dat 10% normaal geit serum en 0,1% Triton X-100) gedurende 1 uur.
    1. Vervang de buffer en incubeer monsters in het blokkeren van buffer met verdunde antilichaam. Incubeer bij 4 ° C. Spoelmonsters met 1 x PBS bevattende 0,1% Triton X-100 onder de otosphere aan immunokleuring 27. Transfer otospheres in 1X PBS en plaats otospheres in montage media op een glasplaatje met een P1000 pipet. Doe een dekglaasje over het monster en laat fixeermiddelen drogen bij 4 ° C.
  8. Verwerven epifluorescentie beelden met behulp van een omgekeerde microscoop setup uitgerust met een 16 bit CCD-camera en hetzij een 20X 0,75 lucht of een 40x 1,3 NA olie-immersie objectief. Verzamel fluorescentie van verschillende kleur kanalen met de vermelde (excitatie en emissie) golflengten: blauw (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), groen (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), rood (562 ± 20nm / en 625 ± 20nm) en infrarood (628 ± 20nm / en 692 ± 20nm).

4. Het testen van EDU Incorporation

  1. Op dag -3, plaat 1 x 10 6 iMOP cellen in een 6 cm schaaltje. Drie dagen later op dag 0, oogst, dissociëren, resuspendeer tellen cellen door stap 1,4-1,9.
  2. Plaat 2,5 x 10 5 cellen in iMOP cultuur media en 5 x10 5 cellen in de sensorische epitheel differentiatie media in verschillende putjes van een 6 goed gerecht.
  3. Bepaal het percentage cellen in S-fase van Edu opname op dag 3 met een EDU incorporatie assay
    1. Voeg EDU stock direct naar iMOP kweken tot een uiteindelijke concentratie van 1 uM EDU verkrijgen in het kweekmedium.
    2. Incubeer edu in iMOP culturen 2 uur en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2. Oogst, scheiden en het verzamelen van cellen herhaal stappen 1,4-1,9. In de 4% formaldehyde in 1X PBS gedurende 15 min. bij RT om cellen te repareren. Oogst de cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijderen formaldehyde-oplossing en properly beschikken.
    3. Etiket kernen van cellen met Hoechst en opgenomen Edu met groene fluorescentie kleurstof-azide volgens het protocol van de fabrikant.
      Opmerking: Alle wassingen worden uitgevoerd met 1X PBS, 3% BSA en 0,1% Tween 20. Was de cellen tweemaal met 1X PBS.
    4. Mount cellen op een dia met antifade reagens en plaats een 1,5 deksel glas over het monster. Acquire fluorescentiebeelden van gelabelde cellen met behulp van een epifluorescentie microscopie.

5. Differentiatie-IMOP Afgeleid Neuronen

  1. Maak 50 ml van neuronale differentiatie media: Neurobasal media, 1X B27 supplement, 2 mM L-glutamine. Ontdooi fles 50X B27 en 200 mM L-glutamine bij 37 ° C waterbad gedurende 5 min. Voeg 1 ml 50X B27 en 0,5 ml 200 mM L-glutamine tot 48,5 ml Neurobasal medium.
  2. Coat dekglaasje door het plaatsen van 12 mm rond 1,5 dekglaasjes in een steriele 10 cm plaat en voeg 70% EtOH om de plaat te steriliseren en reinigen van de dekglaasjes.
  3. Voorzichtig schudden de baairslips te zorgen dat ze worden behandeld in ethanol. Laat de plaat gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Spoel de dekglaasjes 3 keer met steriele 1X PBS te spoelen de resterende ethanol. Spoel de dekglaasje eenmaal met steriele H 2 0 te spoelen resterende 1X PBS.
  4. Zuig het H 2 0 met een pipet 2 ml opzuigen en laat de dekglaasjes drogen. Maak de dekglaasjes aan UV-licht in de weefselkweek kap voor 15 min. Bewaren coverslips in een steriele omgeving als het niet onmiddellijk wordt gebruikt.
  5. Plaats een 12 mm rond dekglaasje in elk putje van een 24 goed gerecht. Schud voorzichtig plaat zodat de dekglaasjes plat op de bodem van de put.
  6. Ontdooien 2 mg / ml poly-D-lysine voorraadoplossing bij kamertemperatuur en verdun tot een 10 ug / ml poly-D-lysine-concentratie in 1X PBS. Voeg 0,25 ml van 10 ug / ml poly-D-lysine aan de putjes. Laat de plaat in de 37 ° C incubator gedurende 1 uur.
  7. Was de putjes 3 keer met steriel 1X PBS. Dooi 10 mg / ml laminine voorraad oplossing bij kamertemperatuur en verdund tot 10 ug / ml in 1X PBS. Voeg 0,25 ml van 10 ug / ml laminine werkoplossing in een enkel putje van een 24 meerdere putjes. Incubeer de plaat bij 37 ° C incubator. Zuigen de laminine oplossing om met een 2 ml opzuigen pipet.
  8. Was het dekglaasje 3 keer met 1X PBS door toevoegen van 1 ml 1X PBS met een P1000 pipet en de 1X PBS verwijderd door opzuigen met een pipet 2 ml opzuigen. Vertrekken 1X PBS van de laatste wasbeurt in het goed totdat cellen zijn klaar om te worden verzilverd. Initiëren neuronale differentiatie door het oogsten, dissociatie en het tellen van cellen in stappen 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 cellen in een 6 cm schotel op dag -3.
  9. Op dag 0, oogsten, dissociëren en tel cellen door het herhalen van 1,4-1,9. Zaad 1 x 10 5-1,5 x 10 5 iMOP cellen in 0,5 ml voorverwarmde neuronale differentiatie media per putje in een 24 multi-well schotel. Aspireren en voeg voorverwarmd neuronale differentiatie media culturen om de andere dag.
  10. Fix iMOP afgeleide neuronen in 4% formaldehyde gedurende 15 min. eent RT op dag 7. Verwijder formaldehyde oplossing, wassen iMOP-afgeleide neuronen met wasbuffer (1 x PBS bevattende 0,1% Triton X-100) vóór incuberen in blokkerende buffer (1X PBS dat 10% normaal geit serum en 0,1% Triton X-100) gedurende 1 uur.
    1. Vervang de buffer en incubeer monsters in het blokkeren van buffer met verdunde antilichaam. Incubeer bij 4 ° C. Spoelmonsters met 1 x PBS bevattende 0,1% Triton X-100 onderworpen cellen immunokleuring 27. Was de dekglaasje met 1X PBS voordat u op de montage media. Laat de fixeermiddelen gedroogd bij 4 ° C voor het verkrijgen epifluorescentie beelden als genoemd in stap 3,8.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

bFGF Intrekking Verlaagt Proliferatie in IMOP Cellen

Om het proliferatieve vermogen van cellen iMOP verminderen en leiden iMOP differentiatie van cellen, werd bFGF uit de kweken genomen. Om te bevestigen dat groeifactor terugtrekking vermindert proliferatie, werd Edu incorporatie werkzaam als proliferatietest. Het percentage cellen die EDE overgenomen uit otospheres gekweekt met iMOP kweekmedia (bevattende bFG...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monitoring IMOP Cultures

Een protocol voor het handhaven zelfvernieuwing en differentiatie bevorderen van een nieuw iMOP cellijn wordt beschreven en aanvullende plating formaten worden opgenomen (tabel 1). Verschillende kritische stappen die helpen met routine expansie en differentiatie van iMOP cellen worden genoteerd. Vergelijkbaar met pluripotente stamcellen culturen, iMOP cellen hebben in theorie een onbeperkte levensduur. Opdat cellijnen goed worden ond...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund (K.Y.K.), Busch Biomedical Research Grant (K.Y.K.) en de Rutgers Faculty Development Grant (K.Y.K.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing ContainersBioCisionBCS-405
Cryogenic Vials (2 ml)Corning430654
1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm)Electron Microscopy Sciences72230-01
DMEM/F12Life Technologies11320-082
Neurobasal MediumLife Technologies21103
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4Life Technologies10010-023
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14025-092
B27 Supplement (50X) Serum FreeLife Technologies17504-044Opgeslagen als 1 ml aliquoten
L-Glutamine(200 mM)Life Technologies25030-081Opgeslagen als 5 ml aliquoten
Natural Mouse LamininLife Technologies23017-015Opgeslagen als 1 mg/ml aliquoten
Click-iT EdU Alexa Fluor 488Life TechnologiesC10337
Synth-A-Freeze Cryopreservation MediaLife TechnologiesA12542-01
Prolong Gold Antifade MountantLife Technologies47743-736Opgeslagen als 10 mg/ml 100 µl aliquoten
Moxi Z Mini Automated Cell CounterOrfloMXZ001
Moxi Z Cassette Type SOrfloMXC002
Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF)Peprotech450-33Opnieuw gesuspendeerd in 0,1% BSA in H20 en opgeslagen als 20 mg/ml aliquoten
Poly-D-LysineSigmaP7886Opnieuw gesuspendeerd in 1X PBS en opgeslagen als 10 mg/ml 100 µl aliquoten
Carbenicillin, Disodium SaltThermo Fisher ScientificBP2648-1Opnieuw gesuspendeerd in 10 mM Hepes pH 7.4 en opgeslagen als 100 mg/ml aliquoten
5 ml pipet individueel verpakt paperback (200/doos)Thermo Fisher Scientific1367811D
10 ml pipet individueel verpakt paperback (200/doos)Thermo Fisher Scientific1367811E
Tissue Culture Treated Biolite 24-Well PlateThermo Fisher Scientific130188
Tissue Culture Treated Biolite 6-Well PlateThermo Fisher Scientific130184
Tissue Culture Treated 6 cm DishThermo Fisher Scientific130181
EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 µmThermo Fisher ScientificSLGV033RS
TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 µl verlengde filtertipUSA Scientific1120-3810
TipOne filter pipet tips 1 - 20 µl filtertipUSA Scientific1120-1810
TipOne filter pipet tips 1 - 200 µl filtertipUSA Scientific1120-8810
TipOne filter pipet tips 101 - 1000 µl filtertipUSA Scientific1126-7810
15 ml conische buizen steriele 20 zakken van 25 buizen (500 buizen)USA Scientific1475-0511
50 ml conische buizen steriele 20 zakken van 25 buizen (500 buizen)USA Scientific1500-1211
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
  2. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
  5. Brigande, J. V., Heller, S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 12 (6), 679-685 (2009).
  6. Groves, A. K. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 235 (4), 434-446 (2010).
  7. Okano, T., Kelley, M. W. Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions. Trends Amplif. 16 (1), 4-18 (2012).
  8. Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why? Stem Cells. 30 (1), 69-74 (2012).
  9. Chen, W., et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature. 490 (7419), 278-282 (2012).
  10. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. , (2013).
  11. Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
  12. Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J Assoc Res Otolaryngol. 10 (2), 173-190 (2009).
  13. Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea. Brain Res. 1091 (1), 282-288 (2006).
  14. Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
  15. Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68 (5), 669-684 (2008).
  16. Oshima, K., Senn, P., Heller, S. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear. Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).
  17. Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae. Cell Transplant. 21 (4), 763-771 (2012).
  18. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409(2012).
  19. Jiang, H., et al. Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library. PLoS One. 8 (7), e69314(2013).
  20. Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle. J Neurosci. 32 (46), 16424-16434 (2012).
  21. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132 (7), 1687-1697 (2005).
  22. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134 (24), 4405-4415 (2007).
  23. Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification. Development. 138 (4), 735-744 (2011).
  24. Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development. Gene Expr Patterns. 9 (6), 444-453 (2009).
  25. Kiernan, A. E., et al. Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear. Nature. 434 (7036), 1031-1035 (2005).
  26. Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea. J Neurosci. 30 (2), 714-722 (2010).
  27. Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells. Stem Cell Reports. 4 (1), 47-60 (2015).
  28. Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter. J Vis Exp. (64), (2012).
  29. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
  30. Furue, M. K., et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (36), 13409-13414 (2008).
  31. Lotz, S., et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 8 (2), e56289(2013).
  32. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
  33. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  34. Ruben, R. J. Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. , Suppl 220. 1-44 (1967).
  35. Matei, V., et al. Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit. Dev Dyn. 234 (3), 633-650 (2005).
  36. Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development. Development. 133 (15), 2817-2826 (2006).
  37. Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. 126 (8), 1581-1590 (1999).
  38. Hasson, T., et al. Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia. J Cell Biol. 137 (6), 1287-1307 (1997).
  39. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, 33(2011).
  40. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
  41. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  42. Kim, W. Y., et al. NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development. Development. 128 (3), 417-426 (2001).
  43. Liu, M., et al. Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems. Genes Dev. 14 (22), 2839-2854 (2000).
  44. Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation. J Assoc Res Otolaryngol. 1 (2), 129-143 (2000).
  45. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  46. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  47. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  48. Blanchard, J. W., et al. Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons. Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

iMOP celdifferentiatiebFGF onttrekkingsprotocolEdU celproliferatieassayimmunovleuren van Cdkn1b Cdh1immunovleuring van Cdkn1b Tubb3otosfeer vorming door gravitatie sedimentatieneuronaal differentiatiemediumsensorische epitheliale differentiatiecelvervanging in het binnenoor

Gerelateerde artikelen