Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Synthese van Thermogelling Poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat Composites met Alginaatmicrodeeltjes voor Tissue Engineering

11.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53704

⸱

26 oktober 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

In dit artikel

Samenvatting

Injecteerbare tissue engineering scaffold uit poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat (PNIPAAm-g-CS) bevattende alginaat microdeeltjes bereid. De hechtsterkte, zwelvermogen en in vitro biocompatibiliteit geanalyseerd in deze studie. De karakterisering technieken die hier ontwikkeld kan van toepassing zijn op andere thermogelling systemen.

Samenvatting

Injecteerbare biomaterialen worden gedefinieerd als implanteerbare materialen die in het lichaam als een vloeistof kan worden ingebracht en in situ stollen. Dergelijke materialen bieden klinische voordelen worden geïmplanteerd minimaal invasief en gemakkelijk vorming ruimtevullende vaste deeltjes onregelmatig gevormde defecten. Injecteerbare biomaterialen zijn op grote schaal onderzocht als scaffolds voor tissue engineering. Voor het herstel van bepaalde dragende gebieden van het lichaam, zoals de tussenwervelschijf, steigers moeten hechtende eigenschappen bezitten. Dit zal de kans op dislocatie te minimaliseren tijdens beweging en ervoor innig contact met het omringende weefsel, die voldoende krachtoverdracht. Hier beschrijven we de bereiding en karakterisering van een steiger bestaande uit thermisch gevoelige poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat (PNIPAAm-g-CS) en alginaat microdeeltjes. De PNIPAAm-g-CS copolymeer vormt een viskeuze oplossing in water bij kamertemperatuur, waarin alginate deeltjes gesuspendeerd om de hechting te verbeteren. Boven de onderste kritische oplostemperatuur (LCST), ongeveer 30 ° C, het copolymeer vormt een vaste gel rond de microdeeltjes. We hebben standaard biomaterialen karakterisering procedures aangepast om rekening te houden met de omkeerbare faseovergang van PNIPAAm-G-CS. Resultaten geven aan dat de opname van 50 of 75 mg / ml alginaat deeltjes in 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS oplossingen verviervoudigen de hechtkracht van PNIPAAm-GCS alleen (p <0,05). De opname van alginaatmicrodeeltjes significante toename zwelvermogen van PNIPAAm-G-CS (p <0,05), waardoor een ruimtevullende gel binnen weefseldefecten handhaven. Tenslotte resultaten van de in vitro toxicologie testkit, 2,3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) en Live / Dead levensvatbaarheid-assay duiden dat de kleefstof ingezet worden in de overleving en proliferatie van ingekapselde humane embryonale nier (HEK) 293 cells over 5 dagen.

Inleiding

Injecteerbare biomaterialen zijn die gemakkelijk in het lichaam kan worden afgeleverd als een vloeistof en vast in situ. Dergelijke materialen zijn uitgebreid toegepast in de regeneratieve geneeskunde, waar zij worden gebruikt om ingekapselde cellen afleveren op het terrein 1-4 en fungeren als een driedimensionale tijdelijke extracellulaire matrix voor de cellen 5. Voor de patiënt, injecteerbare biomaterialen zijn voordelig omdat de chirurgische procedures voor implantatie zijn minimaal invasieve en de vaste fase kan vullen onregelmatig gevormde weefsel gebreken, waardoor de noodzaak voor aangepast formaat implantaten.

Injecteerbaarheid kan worden bereikt door een verscheidenheid van mechanismen. Externe factoren, zoals pH, werden onderzocht als een trigger voor de vorming van gels die cellen en biologisch actieve moleculen 6-8 kapselen. Evenwel pH niet de meest geschikte trekker te gebruiken in alle fysiologische omgevingen. Een ander traditioneel Alternatief voor het bereiken injecteerbaar is door in situ chemische polymerisatie of verknoping. Een groep ontwikkelde een in water oplosbare redox systeem bestaande uit ammoniumpersulfaat en N, N, N ', N'-tetramethylethyleendiamine en gebruikt voor het laten reageren macromeren bestaat uit polyethyleenglycol en poly (propyleen) glycol 9,10. Zan et al. 11 ontwikkelde injecteerbare chitosan netwerken polyvinylalcohol verknoopt met glutaaraldehyd. Bij dergelijke systemen moet de cytotoxiciteit van reactieve componenten worden gehouden, vooral voor toepassingen in celinkapselende. Ook zou exotherme polymerisatie- temperaturen hoog genoeg produceren omringende weefsel, dat is beschreven voor polymeer botcement 12,13 compromitteren.

Nog andere injecteerbare polymere systemen ontwikkeld die een overgang van vloeibare naar vaste toestand met de temperatuur als de trigger vertonen. Bekend als thermogelling systemen, zijn aqueoons polymeeroplossingen die niet behoeft chemische stimulus, monomeren, verknopingsmiddelen of bereiken in situ vorming 14. Eerder een faseovergang zich doorgaans dichtbij fysiologische temperatuur induceert de vorming van een fysisch verknoopt driedimensionaal netwerk. Poloxameren zoals Pluronic F127 behoren tot de meest bestudeerde polymeren voor geneesmiddelafgifte thermogelling 15-17 en celinkapselende 18,19. Het is echter algemeen geaccepteerd dat deze gelen in aan stabiliteit fysiologische omstandigheden. Studies hebben een verhoogde stabiliteit aangetoond met behulp van ketenverlengers 20 of chemische crosslinkers 21,22. Niettemin kan het gebruik van deze reagentia de mogelijkheden van het materiaal voor celinkapselende beperken.

Poly (N-isopropylacrylamide) is een synthetisch polymeer thermogelling dat veel aandacht heeft gekregen in tissue engineering en drug delivery 14. Waterige oplossingen van poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) vertonen een lagere kritische temperatuur-oplossing (LCST), typisch optredende rond 32-34 ° C 23,24. Onder de LCST, water hydrateert PNIPAAm ketens. Boven de overgangstemperatuur, wordt het polymeer hydrofobe, wat resulteert in een dramatische fasescheiding 25-27 en de vorming van een vaste gel zonder het gebruik van toxische monomeren en verknopingsmiddelen. Echter, PNIPAAm homopolymeren vertonen slechte elastische eigenschappen en houden weinig water bij fysiologische temperatuur te wijten aan hydrofobiciteit 28. In dit werk, kiezen we chondroïtinesulfaat covalent nemen in de PNIPAAm netwerk, dat het potentieel voor enzymatische afbraak 29, anti-ontstekingsactiviteit 30,31 en verhoogde water- en voedingsopname 32 biedt. PNIPAAm copolymeren CS werden in ons laboratorium bereid door polymeriseren van het monomeer NIPAAm in aanwezigheid van methacrylaat-gefunctionaliseerde CS entcopolymeer (PNIPAAm-g-CS) te vormen. BecAGebruik de lage verknopingsdichtheid van het copolymeer, PNIPAAm-G-CS vormt een viskeuze oplossing in water bij kamertemperatuur en een elastische gel bij fysiologische temperatuur dankzij het LCST 29. De polymeeroplossingen worden vloeiend weer na afkoeling onder de LCST als gevolg van de omkeerbaarheid van de overgang.

We hebben aangetoond dat PNIPAAm-g-CS heeft de potentie om te functioneren als een scaffold tissue engineering, door mechanische eigenschappen die kunnen worden aangepast, afbreekbaarheid en cytocompatibility met menselijke embryonale nier (HEK) 293-cellen 29. In bepaalde dragende gebieden, zoals de tussenwervelschijf, tissue engineering scaffolds moet in staat zijn een aanzienlijke interface disc omringende weefsel te vormen om het risico van ontwrichting 33 te elimineren. Deze interface is ook noodzakelijk voor een adequate krachtoverbrenging over het grensvlak tussen het implantaat en het weefsel 33. In ons werk, hebben we een opgeschortlginate microdeeltjes in waterige oplossingen van PNIPAAm-G-CS en vond dat geleren lokaliseert de microdeeltjes, die de hechting met het omliggende weefsel 34. In dit artikel schetsen we de stappen voor de voorbereiding van de thermogelling, zelfklevende polymeer. Standaardtechnieken voor biomaterialen en karakterisatie, cell imaging en assays voor levensvatbaarheid werden aangepast om rekening te houden met de temperatuurgevoeligheid van het polymeer en de omkeerbaarheid van de faseovergang. De injecteerbare polymeer beschreven in dit document heeft ruime mogelijkheden voor drug delivery en tissue engineering-toepassingen buiten de in dit document beschreven. Bovendien kan de karakterisering werkwijzen beschreven voor andere thermogelling systemen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Poly (N-isopropylacrylamide) -g-chondroïtinesulfaat Synthese

  1. Voor de synthese van de biologisch hechtende hydrogel, zuiveren N-isopropylacrylamide (NIPAAm) methacrylaat monomeer en chondroïtinesulfaat (CS).
    1. Weeg ten minste 10 g NIPAAm en los het monomeer in 400 ml n-hexaan bij 60 ° C. Roer de container periodiek tot volledige oplossing. Herkristalliseer de oplossing in een -20 ° C vriezer gedurende 24 uur.
    2. Verwijder de gekristalliseerde monomeer uit de houder en vacuümfilter het n-hexaan onder toepassing van een Buchner trechter. Plaats het monomeer in een vacuümoven bij kamertemperatuur gedurende 24 uur om eventueel achtergebleven n-hexaan te verwijderen. Bewaar het monomeer in een -20 ° C vriezer voor later gebruik (zie stap 1.2).
    3. Weeg en los 2,0 g chondroïtinesulfaat in 8,0 ml gedeïoniseerd water. Verwarm de oplossing tot 60 ° C.
    4. Stel de pH van de oplossing tot 10 toepassing van ongeveer 10 tot 40 ui van 50% (w / w) NaOH.
    5. Voeg 0,298 ml methacrylzuuranhydride (MA). Reflux gedurende 24 uur onder roeren bij 60 ° C.
    6. Schenk 400 ml aceton oplossing in een pot en chill O / N in een -20 ° C vriezer.
    7. Na 24 uur zijn verstreken, giet langzaam de gehele oplossing methacrylbevattend CS (MCS) in 400 ml koude aceton onder roeren met een magnetische roerstaaf.
    8. Verwijder de MCS uit de aceton en breng het neerslag in een vacuümoven. Voer deze stap snel een intact en samenhangende staat voor mcs handhaven. Laat de residuele aceton verdampen onder vacuüm gedurende minimaal 24 uur.
  2. Co-op te lossen 10 g gezuiverd NIPAAm en 2,209 g MCS in 232 ml gedemineraliseerd water.
  3. Spoel de oplossing van zuurstof door het gebruik van inert stikstofgas. Zorg voor een krachtige, maar toch lage gasstroom om te voorkomen dat de oplossing uit borrelen meer dan 15 min.
  4. Ga door het spoelen van de oplossing met stikstofgas en voeg 0,976 ml tetramethylethylenediamine (TEMED).
  5. Vervolgens starten de polymerisatiereactie door het mengen van 97,6 mg ammoniumpersulfaat (APS).
  6. Meng de oplossing gedurende ongeveer 20 seconden en de oplossing snel om de lucht verhinderen het vat af te dichten. Laat de oplossing polymeriseren onder tl-licht gedurende 24 uur.
  7. Na 24 uur werd het reactievat plaats in een 37 ° C oven. Laat de hydrogel om de overgang van een vloeistof naar een gel-achtige toestand. Dompel de gepolymeriseerde hydrogel in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende een totaal van 7 dagen om diffusie van ongereageerd monomeer uit de hydrogel.
  8. Met behulp van een schaar, snijden de hydrogel in verschillende kleine stukjes, niet groter dan 5 cm in diameter. Om de hydrogel uit de overgang van een gel-achtige toestand naar een vloeistof te voorkomen, snijd het polymeer binnen de 37 ° C PBS-oplossing. Breng de porties in 50 ml conische buizen.
  9. Bereid de monsters voor vriesdrogen door het wikkelen van de toppen vande buizen met Kimwipes en elastiekjes. Bevries de buizen bij -70 ° C gedurende 1 tot 2 uur.
  10. Plaats de conische buizen op de vriesdroger om al het water uit de hydrogel te verwijderen. Voordat de vriesdroger moet een temperatuur en druk van ongeveer -40 ° C en 0,04 mbar bereikt, respectievelijk. Een minimum van 7 dagen is vereist voor volledige droging.
  11. Maal de gevriesdroogde polymeer tot een fijn poeder en op te slaan in een 4 ° C koelkast voor later gebruik (zie stap 3.1).

2. Calcium-alginaat verknoopte microdeeltjes Synthesis

  1. Bereid een 2% (w / v) alginaat oplossing door het oplossen van 400 mg in 20 ml gedeïoniseerd water. Verwarm de oplossing tot ongeveer 60 ° C om het oplossen te vergemakkelijken.
  2. Bereid een 2% (w / v) calciumchloride-oplossing door toevoeging van 400 mg tot 20 ml gedeïoniseerd water.
  3. Een olie in water mengsel door het combineren van 100 ml canolaolie, 1,0 ml Tween 20 en 20 mlvan 2% (w / v) alginaat. Emulgeren het mengsel gedurende 10 min met een homogenisator bij 15.000 rpm. Bovendien mengen met een magnetische roerstaaf bij 200 rpm en 2000 rpm te grote of kleine microdeeltjes maken, respectievelijk.
  4. Zuig het 2% (w / v) calciumchloride oplossing met een injectiespuit met een naald 18 G. Voeg langzaam calciumchloride druppelsgewijs in de emulsie.
  5. Zodra de 20 ml calciumchloride zijn uitgeput, kan de microdeeltjes in de emulsie te verknopen gedurende 10 min.
  6. Verdelen de partij microdeeltjes in capped 50 ml conische buizen en centrifugeer tot een kracht van 1400 g gedurende 2 minuten om de eerste laag canola olie te verwijderen.
  7. Achtereenvolgens wassen, vortex en gecentrifugeerd microdeeltjes met isopropanol in totaal drie keer bij 1400 g gedurende 2 minuten om eventuele canola olie te verwijderen. Gooi het isopropanol supernatant na elke stap centrifugeren en wassen met verse isopropanol.
  8. Zodra de oil is verwijderd, herhaalt u de wasprocedure drie extra keer met gedemineraliseerd water om eventueel achtergebleven isopropanol te verwijderen. Gooi het gedemineraliseerd water supernatant na elke stap centrifugeren en wassen met vers gedemineraliseerd water. Verwijder ongeveer 100 mg van natte microdeeltjes en op te slaan in een flacon. De natte microdeeltjes worden gebruikt om de gemiddelde diameter van de lading te meten met lichtmicroscopie.
    1. Middels lichtmicroscopie, dispergeren een klein monster van natte microdeeltjes in gedeïoniseerd water op een microscoopglaasje. Afhankelijk van de grootte van de microdeeltjes, gebruikt een 10x of 20x objectief, en stel de numerieke apertuur totdat de deeltjes scherp worden. Controleer of de microscoop wordt gekalibreerd voor juiste doelstelling en de helderheid van de lichtbron naar wens aanpassen. Gebruik een line tool om de langste diameter van 50 willekeurige alginaat microdeeltjes te meten en het verkrijgen van een gemiddelde grootte van de partij.
  9. Bereid de microdeeltjes voor vriesdrogen by het verpakken ze met Kimwipes en het veiligstellen van hen met elastiekjes. Bevries de microdeeltjes bij -70 ° C gedurende 1 uur.
  10. Plaats de microdeeltjes op de vriesdroger en laat het monster drogen gedurende ten minste 24 uur. Maal de gevriesdroogde microdeeltjes tot een fijn poeder met behulp van een vijzel en op te slaan in een 4 ° C koelkast voor later gebruik (zie stap 3.3).

3. Bereiding van de Adhesives

  1. Met het gevriesdroogde polymeerpoeder, voer een 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS oplossing door het oplossen van 50 mg hydrogel poeder in 1 ml 1X PBS.
  2. Meng de oplossing met behulp van een vortex en kou in een koelkast bij 4 ° C gedurende 24 uur.
  3. Zodra de viskeuze oplossing vormt, maakt een homogene samenstelling door het toevoegen van 25 of 50 mg gevriesdroogd alginaatmicrodeeltjes de hydrogel oplossing en vortex. Bewaar de composiet in de koelkast bij 4 ° C voor later gebruik (zie stap 4.3 en 4.8).

4. Bioadhesieve Mechnische trekproeven

  1. Voorafgaand aan het uitvoeren van trekproeven, extract kraakbeen substraat een varken oor.
    1. Ontdooi een varken oor in een warme 0,9% (w / v) NaCl-oplossing; dit zal helpen om het weefsel los te maken.
    2. Met behulp van een scalpel, isoleren en deel uit een vlak, rechthoekig gebied door verticaal te snijden terwijl de epidermale laag, onderhuids weefsel en kraakbeen. Vermijd het snijden van de gekromde ruggen van de varkens oor.
    3. Scheid de epidermale laag van de huid van het kraakbeen door parallelle snijden door het subcutane weefsel. Het kraakbeen is een hard, wit weefsel gevonden onder de varkens huid.
    4. Voorzichtig schrapen het subcutane weefsel dat voor het kraakbeen is verbonden met de zijde van de scalpel. Vermijd het snijden in het kraakbeenweefsel met de scalpel.
    5. Gewaarborgd dat slechts één zijde van het kraakbeen wordt blootgesteld en vlak tijdens trekproeven. Indien nodig, plat het kraakbeen van de ongelijke huid afsnijden aan de onderzijde.
    6. Snijd het kraakbeenweefsel in meerdere stukken met afmetingen van 1 cm x 1 cm. Bewaar de kraakbeenweefsel in conische buizen gevuld met 0,9% (w / v) NaCl oplossing in een -20 ° C vriezer.
  2. Bereid 2,0 L van 0,9% (w / v) NaCl oplossing. Verwarm de zoutoplossing tot 37 ° C. De temperatuur van deze oplossing moet gedurende het testen worden gehandhaafd.
  3. Ontdooi de bevroren kraakbeen. Houd zowel de varkens kraakbeen en de hydrogel monsters in een piepschuim container met ijs packs.
  4. Bevestig de krachtmeter aan de arm van de testbank. Plaats een kookplaat bovenop de kracht stand en de temperatuur op 50 ° C.
  5. Kleef een 1 cm x 1 cm stukje kraakbeen aan de roestvrij stalen blok met cyanoacrylaatlijm en een pincet. Lijm een ​​extra stukje kraakbeen aan de Delrin cilinder en bevestig de cilinder aan de krachtmeter. Het is zeer belangrijk dat zowel kraakbeen oppervlakken naar elkaar contact hydrogel.
  6. PlaatsPlexiglas waterbad boven op de hete plaat en steek de roestvrijstalen blok met het kraakbeen substraat in het bad.
  7. Laat de arm van de testbank en lijn beide kraakbeen substraten met elkaar. Breng de arm en laat voldoende ruimte om de hydrogel toe te passen.
  8. Met een verdringerpomp pipet afzien 200 gl van de bioadhesieve hydrogel onderaan stukje kraakbeen.
  9. Laat de arm van de kracht stand op 1 mm / min tot het hydrogel contact maakt met de bovenste stukje kraakbeen en oefent een voorspanning van 0.001 N.
  10. Giet de 37 ° C een zoutoplossing in het bad tot het volume de aangewezen water niveau bereikt. Controleer de temperatuur van de oplossing met een thermokoppel.
  11. Laat de hydrogel om in totaal 5 minuten. Zodra de gel gestold, til de arm met een snelheid van 2 mm / min. De test is voltooid wanneer de bioadhesieve los van het kraakbeen substraat of als een aanzienlijke daling van kracht optreedt,signalering falen.
  12. Verzamel de geregistreerde gegevens en de arm van de testbank te verhogen. Verwijder de Delrin cilinder uit de krachtmeter. Giet de zoutoplossing in de vorige houder en verwarm tot 37 ° C.
  13. Bereken benadrukt door het aftrekken van de kracht uitgeoefend door het polymeer uit de opwaartse kracht van een "blanco", de Delrin bevestiging zonder kleefmiddel of kraakbeen, verhoogd met dezelfde snelheid, en delen door de binding gebied.

5. zwelling Studie van PNIPAAm-G-CS met Alginaatmicrodeeltjes

  1. Bereid schone glazen flesjes en label ze op de juiste wijze met een tijdstip, het type monster en steekproefomvang. De kleefstoffen kunnen ook worden gemaakt, zoals hiervoor beschreven. Bereid een totaal van vijf monsters (n = 5) voor elk type monster per tijdstip.
  2. Pre-wegen alle glazen flesjes en hun oorspronkelijke massa op te nemen bij RT.
  3. Met behulp van een injectiespuit, afzien ongeveer 0,4 ml van de bereide lijm monster in elk van de vijf flesjes.Herhaal deze stap voor elk type monster in alle geteste tijdstippen.
  4. Wegen en de massa van elk flesje met de klevende monstertype bij kamertemperatuur opnemen.
  5. Voorverwarmen een orbitale incubator 1 l 1x PBS oplossing tot 37 ° C.
  6. Organiseren van de flesjes op een rek en plaats het rek in de incubator. Laat de lijm om de overgang van een vloeistof naar een gel gedurende ongeveer 5-10 minuten.
  7. Voeg 5,0 ml 1x PBS aan elk flesje. Zorg ervoor dat de PBS-oplossing voorzichtig toe te voegen aan de zijkant van de flacon te voorkomen dat de hydrogel schijf uit elkaar te breken.
  8. Cap elke injectieflacon verdamping van de PBS-oplossing te voorkomen en de temperatuur van de incubator handhaven op 37 ° C. Elke set van hydrogel schijven zal moeten ondergedompeld blijven in PBS voor een aangegeven tijdsduur.
  9. Eén keer per 7 dagen de tijd punt is bereikt, Haal het beschermkapje van de set van flesjes en verwijder de PBS-oplossing uit elke flacon. Weeg elk flesje met de klevende monster weer bij RT.

6. Kwalitatieve Cell levensvatbaarheid Met behulp van een Live / Dead Assay

  1. Voordat de Live / Dead test met PNIPAAm-G-CS, groei humane embryonale 293-niercellen (HEK-293) tot 80% confluentie.
    1. Quick-dooi bevroren HEK-293 celsuspensie door het plaatsen van de cryovial in een 37 ° C waterbad, centrifugeer de cellen bij 400 xg bij 4 ° C gedurende 5 min in een 15 ml conische buis.
    2. De eerste doorgang celkweekmedium te combineren in hoge glucose (4,5 g / l) Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) tot een eindconcentratie van 20% en 100x penicilline-streptomycine-oplossing ( pen-strep) tot een uiteindelijke concentratie van 100 IU / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Voor alle andere passages, overschakelen naar DMEM met 10% FBS en 1x pen-strep.
    3. Resuspendeer de celpellet in 10 ml groeimedium en breng de suspensie in een 100 mm petrischaal. gelijkmatig distribute de cellen door voorzichtig kantelen van de schaal van voor naar achter en van links naar een paar keer per richting rechts.
    4. De cellen te kweken in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2. Wijzig zo nodig het medium om de twee dagen.
    5. Wanneer cellen te bereiken 80% samenvloeiing, een kopie van de cultuur in meerdere gerechten. Verwijder het medium uit de plaat.
    6. Voeg 1 ml van 0,5% trypsine aan de plaat. Laat de platen geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Controleer om te zien of de cellen los te maken van het oppervlak onder voorzichtig schudden de plaat.
    7. Voor het splitsen van de kweek 01:10, voeg 9 ml normale groeimedium (DMEM met 10% FBS) aan de cellen getrypsiniseerd en meng door het kantelen van de schotel.
    8. Verdeel 1 ml van de verdunde celsuspensie in elk nieuw gerecht en voeg 9 ml kweekmedium. Meng door het kantelen van het gerecht.
    9. De cellen te kweken in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2. Wijzig zo nodig het medium ooity twee dagen tot cellen te bereiken 80% samenvloeiing.
  2. Verwijder de media uit twee kweekschalen gegroeid tot 80% confluentie.
  3. Voeg 1 ml van 0,5% trypsine aan elke plaat. Laat de platen geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Controleer om te zien of de cellen los te maken van het oppervlak onder voorzichtig schudden de plaat.
  4. Was de HEK-293-cellen op de plaat met 3 ml groeimedium tweemaal en voegen zowel suspensies dezelfde 15 ml conische buis.
  5. Centrifugeer de 15 ml conische buis gedurende 10 minuten bij 400 xg bij 4 ° C.
  6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 3 ml medium door en neer te pipetteren.
  7. Pipetteer 10 ul van de celsuspensie in een hemocytometer en voer een celtelling de celdichtheid bepaald. Verhoog de suspensie volume medium als de initiële celconcentratie te hoog, en omgekeerd het volume te verlagen als de concentratie te laag is, om een ​​doel concent behoudenverhouding van 1 x 10 6 cellen / ml. Centrifugeer de HEK-293 cellen bij 400 xg en resuspendeer de celpellet in het gecorrigeerde hoeveelheid media dienovereenkomstig.
  8. Voorzichtig vortex de celsuspensie en verdelen de celmengsel in vier afzonderlijke 15 ml conische buis voor de volgende proefomstandigheden: positieve controle monolaag, negatieve gedood control in PNIPAAm-g-CS middels 70% (v / v) methanol, HEK-293 cellen ingekapseld in PNIPAAm-g-CS en HEK-293-cellen ingekapseld in PNIPAAm-g-CS met alginaatmicrodeeltjes.
  9. Maak positieve controle monolagen pipetteren meerdere 300 gl volumes van het celmengsel in een 24-well plaat 4-6 analysemonsters genereren.
  10. Verwijder de media uit de conische buizen met betrekking tot de gedode controle, PNIPAAm-G-CS en PNIPAAm-G-CS met alginaat microdeeltjes.
    1. Centrifugeer de conische buizen gedurende 5 minuten bij 400 xg en verwijder het supernatant.
    2. Handhaaf dezelfde cel concentratie door resuspenderen de cells in hetzelfde volume PNIPAAm-G-CS de media verwijderd. Pipet het polymeer cel mix op en neer met behulp van een serologische pipet tot homogeen.
      1. Als enten met alginaatmicrodeeltjes, dragen de PNIPAAm-g-CS-celsuspensie (verkregen zoals beschreven 6.10.2) in een 35 mm kweekschaal en de deeltjes te introduceren in de mix. Pipet de cel mix op en neer met behulp van een serologische pipet tot homogeen.
    3. 6 replicaatmonsters - gebruikt serologische pipet afzien meerdere 300 gl van het polymeer celmengsel in elk van de putjes gedood control, PNIPAAm-G-CS en PNIPAAm-G-CS met alginaatmicrodeeltjes tot 4 te genereren.
  11. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 10 tot 15 minuten en laat de PNIPAAm-G-CS om de overgang van een vloeistof naar een gel (polymeer vormt een ondoorzichtige, witte schijf).
  12. Plaats een dia warmer in de kap en de temperatuur op 37 ° C. Gebruik de dia warmer goed plaat te behoudentemperatuur en pipetteer 600 ul voorverwarmde media in elk putje. Om verder te voorkomen dat de overgang van het polymeer tot een vloeibare toestand achtereenvolgens een lamp met een fluorescerende lamp boven de schaal te warmen de lucht erboven.
  13. Incubeer de cellen gedurende 5 dagen bij 37 ° C met 5% CO2.
  14. Na vijf dagen zijn verstreken, de voorbereiding van de Live / Dead kleurstof mix met behulp van ethidiumhomodimeer (EthD-1) en calceïne AM. Beide stoffen zijn lichtgevoelig en bereid op de dag van gebruik.
    1. Ontdooi de calceïne AM en EthD-1 uit de set bij RT.
    2. Voeg 5 ml steriel 1x PBS tot een conische buis en wikkel het in aluminiumfolie.
    3. Voeg 6,67 ui 2 mM EthD-1 de conische buis. Vortex de oplossing mengsel goed.
    4. Voeg vervolgens 2,5 ul 4 mM calceïne AM de conische buis. Vortex het mengsel goed.
  15. Verwijder de media uit de putjes van de monolaag (positieve controle), PNIPAAm-G-CS en PNIPAAm-g-CS with alginaatmicrodeeltjes. Was alle van de putten grondig, maar voorzichtig, met PBS en verwijder de PBS.
  16. Laat de hydrogel schijven met alginaat microdeeltjes vloeibaar bij kamertemperatuur en voeg 2 ml 50 mM natriumcitraat aan elk van de putjes.
  17. Verwijder de media uit de gedode cel putten (negatieve controle). Laat de hydrogel schijven vloeibaar bij kamertemperatuur en voeg 300 pl 70% (v / v) methanol aan elk putje.
  18. Incubeer de plaat gedurende 45 min bij 37 ° C.
  19. Verwijder de natriumcitraat en methanol oplossingen van de putten en pipet elk van de hydrogel suspensies in afzonderlijke microcentrifugebuizen. Centrifugeer de buizen bij 2000 xg gedurende 10 minuten om de cellen te scheiden van de hydrogel suspensie.
  20. Verwijder de suspensie voorzichtig pipetteren de oplossing uit de conische buis en achterlating de celpellet. Resuspendeer de pellet in 300 pl PBS en transfer naar de oorspronkelijke putjesplaat.
  21. Voeg 300 gl thij leven / dood kleurstof mix aan elk van de putjes. Wikkel de wells plaat in aluminiumfolie en incubeer gedurende 45 minuten op een rocker bij RT.
  22. Afbeelding alle monsters onder een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop met een 10X objectief. Levende cellen en gedode cellen een groene en rode fluorescentie in, respectievelijk.

7. Kwantitatieve levensvatbaarheid van de cellen met behulp van een XTT Assay

  1. Kweek HEK-293-cellen tot 80% confluentie. Verwijder de groeimedia van twee cultuur gerechten.
  2. Voeg 1 ml van 0,5% trypsine aan elke plaat. Laat de platen geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Controleer om te zien of de cellen los te maken van het oppervlak onder voorzichtig schudden de plaat.
  3. Was de HEK-293-cellen op de plaat met 3 ml medium tweemaal en voegen zowel suspensies dezelfde 15 ml conische buis.
  4. Centrifugeer de 15 ml conische buis gedurende 10 minuten bij 400 xg bij 4 ° C.
  5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 3 ml mediumdoor op en neer pipetteren.
  6. Pipetteer 10 ul van de celsuspensie in een hemocytometer en voer een celtelling de celdichtheid bepaald. Zoals eerder beschreven, behouden een doelconcentratie van 1 x 10 6 cellen / ml. Centrifugeer de HEK-293 cellen bij 400 xg en resuspendeer de celpellet in het gecorrigeerde hoeveelheid media dienovereenkomstig.
  7. Voorzichtig vortex de celsuspensie en verdelen de celmengsel in vier afzonderlijke 15 ml conische buis voor de volgende proefomstandigheden: positieve controle monolaag, negatieve gedood control in PNIPAAm-g-CS middels 70% (v / v) methanol, HEK-293 cellen ingekapseld in PNIPAAm-g-CS en HEK-293-cellen ingekapseld in PNIPAAm-g-CS met alginaatmicrodeeltjes.
  8. Maak positieve controle monolagen pipetteren 300 ul van de cel mengsel in een 24-well plaat 4 te genereren - 6 analysemonsters.
  9. Verwijder de media uit de conische buizen met betrekking tot de gedode controle, PNIPAAm-G-CS en PNIPAAm-g-CS met alginaatmicrodeeltjes.
    1. Centrifugeer de conische buizen gedurende 5 minuten bij 400 x g en de bovenstaande vloeistof.
    2. Handhaven dezelfde celconcentratie door resuspenderen van de cellen in dezelfde hoeveelheid PNIPAAm-G-CS de media verwijderd. Pipet de cel mix op en neer met behulp van een serologische pipet tot homogeen.
      1. Als enten met alginaatmicrodeeltjes, dragen de PNIPAAm-g-CS-celsuspensie in een 35 mm kweekschaal en de deeltjes te introduceren in de mix. Pipet de cel mix op en neer met behulp van een serologische pipet tot homogeen.
    3. 6 replicaatmonsters - gebruikt serologische pipet afzien 300 gl van het polymeer celmengsel in elk van de putjes gedood control, PNIPAAm-G-CS en PNIPAAm-G-CS met alginaatmicrodeeltjes tot 4 te genereren.
  10. Zodra alle celbevattende monsters werden toegevoegd aan de 24-well plaat, afzien meerdere 300 gl volumes PNIPAAm-G-CS en PNIPA6 analysemonsters - am-G-CS met alginaatmicrodeeltjes zonder cellen in naburige putten 4 te genereren.
  11. Incubeer de 24-well plaat bij 37 ° C gedurende 10 tot 15 minuten en laat de PNIPAAm-G-CS om de overgang van een vloeistof naar een gel (polymeer vormt een ondoorzichtige, witte schijf).
  12. Plaats een dia warmer in de kap en de temperatuur op 37 ° C. Gebruik de dia warmer goed plaat temperatuur en pipet 600 ul van voorverwarmde duidelijke DMEM te behouden in elk putje. Om verder te voorkomen dat de overgang van het polymeer tot een vloeibare toestand achtereenvolgens een lamp met een fluorescerende lamp boven de schaal te warmen de lucht erboven.
  13. Incubeer de cellen gedurende 5 dagen bij 37 ° C in 5% CO2.
  14. Na vijf dagen verstreken, bereidt de 2,3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) reagens van de fabrikant. De XTT reagens is lichtgevoelig en voorbereid op de dag van gebruik.
    1. Verwijder de amber fles bevattening de XTT poeder uit de koelkast. Met behulp van een steriele spuit en naald, injecteer 5 ml van duidelijke DMEM (zonder fenol rood) door het rubberen septum in de amberkleurige fles.
    2. Verwarm het reagens 56 ° C in een waterbad gedurende 10 minuten of totdat het is opgelost.
    3. Verdun de XTT-reagens tot 20% (v / v) in een 15 ml conische buis gewikkeld in aluminiumfolie. Aliquot de overmaat XTT reagens in microcentrifugebuizen en plaats ze in de -20 ° C vriezer voor langdurige opslag.
  15. Verwijder het medium uit de putjes gedode cellen (negatieve controle) en voeg 300 pl 70% (v / v) methanol aan elk putje. Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 ° C en verwijdert de methanol uit de putjes.
  16. Verwijder de media uit de resterende putjes van de monolaag (positieve controle), PNIPAAm-G-CS en PNIPAAm-G-CS met alginaat microdeeltjes. Was alle van de putten grondig, maar voorzichtig, met PBS en verwijder de PBS.
  17. Voeg 300 ul van de 20% XTT-reagens aan elk van de putjes. Wikkel de 24-well plaat in aluminiumfolie en incubeer gedurende 24 uur op een rocker bij RT.
  18. Na 24 uur, voeg 200 pl 50 mM natriumcitraat aan alle putjes en incubeer op wip voor een extra uur.
  19. Overdracht van al het polymeer suspensies te microcentrifugebuizen en centrifugeer bij 2000 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  20. Transfer 200 ul van de supernatant uit elke microcentrifugebuis een 96-wells plaat. Met behulp van een microtiter plaatlezer verkrijgen specifieke absorptiemetingen bij 450 nm en aspecifieke absorptiemetingen bij 690 nm.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een thermisch gevoelige geënte copolymeer werd met succes gesynthetiseerd en gekarakteriseerd op de bioadhesieve sterkte, zwelvermogen en in vitro cytocompatibility. We kozen ervoor om alginaat te onderzoeken vanwege de gerenommeerde slijmvlieshechtende eigenschappen. Alginaatmicrodeeltjes, met een gemiddelde diameter van 59,7 ± 14,9 urn, werden gemengd met 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS in concentraties van 25, 50 en 75 mg / ml. Deze concentraties waren gebaseerd op de helft, gelijk a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn verschillende kritische stappen in de synthese van de hydrogel micropartikels composiet en evalueren van de hechtsterkte, zwelling vermogen en cellulaire biocompatibiliteit. Vrije radicaalpolymerisatie van PNIPAAm-G-CS vereist een succesvolle methacrylation chondroïtinesulfaat, volledige oplossing van monomeercomponenten en zuurstofvrije reactiecondities. De verhouding van monomeer tot NIPAAm methacrylbevattend chondroitin sulfaat in het reactiemengsel werd gekozen omdat is aangetoond, in ons eerder werk copolym...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag de hulp van Dr. Jennifer Kadlowec dankbaar erkennen in de ontwikkeling van de lijm trekproef protocol.

Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door het Nationaal Instituut van artritis en spier-en huidziekten en het Nationaal Instituut voor Biomedische beeldvorming en Bioengineering van de National Institutes of Health onder Award Number 1R15 AR 063920-01. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilizedAcros Organics2210-25-5Refrigerate en verwijder stabilier met hexaan
Chondroitin sulfate A natriumzout (van runder trachea)Sigma-Aldrich39455-18-0Refrigerate
HexaansFisher ScientificH302-4Bewaar in een brandbare kast
50% (w/w) natriumhydroxideFisher ScientificSS254-1Causatief van aard
MethacrylzuuranhydrideSigma-Aldrich276685Sterk rook; gebruik in een afzuigingskast
AcetonFisher ScientificA18-4Koel voor gebruik in een koelkast
StikstofgasPraxair7727-37-9Artikelnummer: NI 4.8, cilinderstijl T, 99.998% zuiver stikstof (Argon kan worden gebruikt als alternatief inerte gas)
Tetramethylethyleendiamine, 99% extra puurAcros Organics110-18-9
AmmoniumpersulfaatSigma AldrichA3678Hygroscopisch en degradeert in de aanwezigheid van water
Fosfaat gebufferde zoutoplossing tablettenFisher ScientificBP2944Houd droog
Alginezuur, natriumzoutAcros Organics177775000Gebruik warmte om oplossen te vergemakkelijken
Calciumchloride dihydraatFisher ScientificC79
Canola olieLokale winkelKrijg van een lokale winkel
Tween 20Sigma-Aldrich93773
70% (v/v) IsopropoanolFisher ScientificA416-4
VarkensoorenHaine's Pork ShopKrijg van een lokale slager
NatriumchlorideFisher ScientificS271-3
Menselijke embryonale nier 293 cellenATCCATCC CRL-1573Bewaar in vloeibare stikstof voor langdurig gebruik
DMEM: 1x, hoge glucose, geen pyruvaatLife Technologies11965126Refrigerate
Fetaal bovien serumLife Technologies10082-147Refrigerate
Penn Strep: 10.000 U/mlLife Technologies15140-122Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0,5%, 10xLife Technologies15400-054Refrigerate
MethanolVWRAAA44571-K7
Live/Dead Cel vitaliteit kitLife TechnologiesL3224Licht gevoelig, bewaar ingevroren
XTT cel vitaliteit kitSigma AldrichTOX2-1KTLicht gevoelig, bewaar ingevroren
Clear DMEM: 1x, hoge glucose, geen fenolLife Technologies21063-029Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1xLife Technologies14190136Refrigerate
NatriumcitraatEMDSX0445-1
Positieve verplaatsing pipetteBrandTech Scientific, INC2702904Verdeelt 100 - 500 µl en wordt geleverd met aanhechtbare tips
Nr 3. Roestvrijstalen scalpel handvatSigma AldrichS2896
Miltex steriele chirurgische messenFisher Scientific12-460-440Maat 10
Power gem homogenisatorFisher Scientific08-451-660Model # 125
Porseleinen mortel en stamperSigma AldrichZ247464Houdt 50 ml
FreeZone 1 L tafelvriesdroog systeemLabconco7740020Vries monsters voor gebruik
Olafdichting draaisel pompEdwardsA65301906Model # RV5
Incuberende orbitale shakerVWR12620-946Model # 980153
Tafel gekoelde centrifugeForma Scientific, INCModel # 5682
Verwarmde ovensVWRModel # 1235PC
2 N krachtmeterShimpoFGV-0.5XYModel # FGV-0.5XY
E-kracht test standShimpoFGS-200PVModel # FGS-200PV
Weefselkweek slinger emmer centrifugeBeckman Coulter366830Model #6S-6KR
Weefselkweek microcentrifugeEppendorfModel #5415C
Hemacytometer setHausser Scientific3720Vereist vervangende dekglasjes
Glijplaatje warmerLab ScientificXH-2022Model # XH-2002
Draagbare verwarmingslampUnderwriters LaboratoriesHelpt om de polymeertemperatuur op 37 °C te houden
Omgekeerde fluorescentie microscoopZeissModel Axiovert 25 CFL
Verwarmd waterbadVWRModel # 1235PC
Slinger platformVWRSerie 100
Multiskan FC microtiter plaat lezerThermo ScientificType 357
Celcultuur incubatorVWRModel # 2350T
Zuiveringsklasse II bioveiligheidskastLabconcoDelta Serie

Referenties

  1. Bidarra, S. J., Barrias, C. C., Granja, P. L. Injectable alginate hydrogels for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomater. 10, 1646-1662 (2014).
  2. Choi, J., et al. Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering. J. Control. Release. 139, 2-7 (2009).
  3. Selvam, S., Pithapuram, M. V., Victor, S. P., Muthu, J. Injectable in situ. forming xylitol-PEG-based hydrogels for cell encapsulation and delivery. Colloid Surface B. 126, 35-43 (2015).
  4. Park, K. M., Lee, S. Y., Joung, Y. K., Na, J. S., Lee, M. C., Park, K. D. Thermosensitive chitosan-pluronic hydrogel as an injectable cell delivery carrier for cartilage regeneration. Acta Biomater. 5, 1956-1965 (2009).
  5. Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
  6. Chiu, Y. L., et al. pH-triggered injectable hydrogels prepared from aqueous N-palmitoyl chitosan: In vitro characteristics and in vivo biocompatibility. Biomaterials. 30, 4877-4888 (2009).
  7. Shim, W. S., et al. pH- and temperature-sensitive, injectable, biodegradable block copolymer hydrogels as carriers for paclitaxel. Int. J. Pharm. 331, 11-18 (2007).
  8. Singh, N. K., Insitu Lee, D. S. gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J. Control. Release. 193, 214-227 (2014).
  9. Wang, B., Zhu, W., Zhang, Y., Yang, Z., Ding, J. Synthesis of a chemically-crosslinked thermo-sensitive hydrogel film and in situ of model protein drugs. React. Funct. Polym. 66, 509-518 (2006).
  10. Zhu, W., Ding, J. Synthesis and characterization of a redox-initiated, injectable, biodegradable hydrogel. J. Appl. Polym. Sci. 99, 2375-2383 (2006).
  11. Zan, J., Chen, H., Jiang, G., Lin, Y., Ding, F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. J. Appl. Polym. Sci. 101, 1892-1898 (2006).
  12. Togawa, D., Bauer, T. W., Lieberman, I. H., Takikawa, S. Histologic evaluation of human vertebral bodies after vertebral augmentation with polymethyl methacrylate. Spine. 28, 1521-1527 (2003).
  13. Berman, A. T., Reid, J. S., Yanicko, D. R., Sih, G. C., Zimmerman, M. R. Thermally induced bone necrosis in rabbits: relation to implant failure in humans. Clin. Orthop. Relat. R. 186, 284-292 (1984).
  14. Kretlow, J. D., Klouda, L., Mikos, A. G. Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug. Deliver. Rev. 59, 263-273 (2007).
  15. Ye, F., Yaghmur, A., Jensen, H., Larsen, S. W., Larsen, C., Ostergaard, J. Real-time UV imaging of drug diffusion and release from Pluronic F127 hydrogels. Eur. J. Pharm. Sci. 43, 236-243 (2011).
  16. Akash, M. S., Rehman, K. Recent progress in biomedical applications of pluronic (PF127): Pharmaceutical perspectives. J. Control Release. 209, 120-138 (2015).
  17. Sellers, D. L., Kim, T. H., Mount, C. W., Pun, S. H., Horner, P. J. Poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres encapsulated in Pluronic F-127 prolong hirudin delivery and improve functional recovery from a demyelination lesion. Biomaterials. 35, 8895-8902 (2014).
  18. Jung, H., Park, K., Han, D. K. Preparation of TGF-β1-conjugated biodegradable pluronic F127 hydrogel and its application with adipose-derived stem cells. J. Control. Release. 147, 84-91 (2010).
  19. Lee, S. Y., Tae, G. Formulation and in vitro of an in situ photo-polymerizable pluronic hydrogel suitable for injection. J. Control. Release. 119, 313-319 (2007).
  20. Chen, Y. Y., Wu, H. C., Sun, J. S., Dong, G. C., Wang, T. W. Injectable and thermoresponsive self-assembled nanocomposite hydrogel for long-term anticancer drug delivery. Langmuir. 19, 3721-3729 (2013).
  21. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Materials for cell encapsulation via a new tandem approach combining reverse thermal gelation and covalent crosslinking. Macromol. Chem. Physic. 203, 1466-1472 (2002).
  22. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Towards a fully-synthetic substitute of alginate: development of a new process using thermal gelation and chemical cross-linking. Biomaterials. 25, 5115-5124 (2004).
  23. Hirokawa, Y., Tanaka, T. Volume phase transition in a nonionic gel. J. Chem. Phys. 81, 6379-6380 (1984).
  24. Freitas, R., Cussler, E. L. Temperature sensitive gels as extraction solvents. Chem. Eng. Sci. 42, 97-103 (1987).
  25. Schild, H., Tirrel, D. A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions. J. Chem. Phys. 94, 4352-4356 (1990).
  26. Yagi, Y., Inomata, H., Saito, S. Solubility parameter of an N-isopropylacrylamide gel. Macromol. 25, 2997-2998 (1992).
  27. Illmain, F., Tanaka, T., Kokufuta, E. Volume transition in a gel driven by hydrogen bonding. Nature. 349, 400-401 (1990).
  28. Vernengo, J., Fussell, G. W., Smith, N. G., Lowman, A. M. Evaluation of novel injectable hydrogels for nucleus pulposus replacement. J. Biomed. Mater. Res. B. 84, 64-69 (2008).
  29. Wiltsey, C., et al. Characterization of injectable hydrogels based on poly(N-isopropylacrylamide)-g-chondroitin sulfate with adhesive properties for nucleus pulposus tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 24, 837-847 (2013).
  30. Ronca, F., Palmieri, L., Panicucci, P., Ronca, G. Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthr. Cart. 6, 14-21 (1998).
  31. Pipitone, V. Chondroprotection with chondroitin sulfate. Drug. Exp. Clin. Res. 17, 3-7 (1991).
  32. Moss, M., Kruger, G. O., Reynolds, D. C. The effect of chondroitin sulfate on bone healing. Oral Surg. Oral Med. O. 20, 795-801 (1965).
  33. Nerurkar, N., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria fo intervertebral disc tissue engineering. J. Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
  34. Wiltsey, C., et al. Thermogelling bioadhesive scaffolds for intervertebral disk tissue engineering: Preliminary in vitro of aldehyde-based versus alginate microparticle-mediated adhesion. Acta Biomater. 16, 71-80 (2015).
  35. Xia, Y., Yin, X., Burke, N., Stover, H. Thermal response of narrow-disperse poly(N-isopropylacrylamide) prepared by atom transfer radical polymerization. Macromol. 38, 5937-5943 (2005).
  36. Liu, Q., Zhang, P., Qing, A., Lan, Y., Lu, M. Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with improved shrinking kinetics by RAFT polymerization. Polymer. 47, 2330-2336 (2006).
  37. Lemoine, D., Wauters, F., Bouchend'homme, S., Preat, V. Preparation and characterization of alginate microspheres containing a model antigen. Int. J. Pharm. 176, 9-19 (1998).
  38. Dang, T. D., Joo, S. W. Preparation of tadpole-shaped calcium alginate microparticles with sphericity control. Colloid. Surface. B. 102, 766-771 (2013).
  39. Moebus, K., Siepmann, J., Bodmeier, R. Novel preparation techniques for alginate-polaxamer microparticles controlling protein release on mucosal surfaces. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 358-366 (2012).
  40. Lih, E., Lee, J. S., Park, K. M., Park,, D, K. Rapidly curable chitosan-PEG hydrogels as tissue adhesives for hemostasis and wound healing. Acta Biomater. 8, 3261-3269 (2012).
  41. Urban, J., Maroudas, A. Swelling of the intervertebral disc in vitro. Connect. Tissue Res. 9, 1-10 (1981).
  42. Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64, 273-281 (2003).
  43. Leslie, S. K., et al. Controlled release of rat adipose-derived stem cells from alginate microbeads. Biomaterials. 34, 8172-8184 (2013).
  44. Peroglio, M., Eglin, D., Benneker, L. M., Alini, M., Grad, S. Thermoreversible hyaluronan-based hydrogel supports in vitro. and ex vivo. disc-like differentiation of human mesenchymal stem cells. Spine J. 13, 1627-1639 (2013).
  45. Chen, J. P., Cheng, T. H. Thermo-responsive chitosan-graft-poly(N-isopropylacrylamide) injectable hydrogel for cultivation of chondrocytes and meniscus cells. Macromol. Biosci. 6, 1026-1039 (2006).
  46. Schoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: an in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol. Bioeng. 50, 374-381 (1996).
  47. Dai, J., Wang, H., Liu, G., Xu, Z., Li, F., Fang, H. Dynamic compression and co-culture with nucleus pulposus cells promotes proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. J. Biomech. 47, 966-972 (2014).
  48. Feng, G., et al. Effects of hypoxias and scaffold architecture on rabbit mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype. Biomaterials. 32, 8182-8189 (2011).
  49. Feng, G., et al. Hypoxia differentially regulates human nucleus pulposus and annulus fibrosus cell extracellular matrix production in 3D scaffolds. Osteoarth. Cartilage. 21, 582-588 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Thermogelerende hydrogelPNIPAAm-g-CStreksterktecellulaire levensvatbaarheidinjecteerbaar biomateriaalnucleus pulposusLive/Dead-assayzwelcapaciteit
Synthese van Thermogelling Poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat Composites met Alginaatmicrodeeltjes voor Tissue Engineering
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.