Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in Arabidopsis Roots aan Tissue-specifieke celwand Wijzigingen Monitor

Summary

Kristalline cellulose is een belangrijk bestanddeel van de plantencelwand. De kwantificering ervan op cellulair niveau is echter technisch uitdagend. Hier beschrijven we het gebruik van gepolariseerd lichttechnologie en worteldoorsneden om informatie te verkrijgen over de samenstelling van de celwand met een spatie-temporelle resolutie.

Abstract

Plantencellen zijn omgeven door een celwand, waarvan de samenstelling hun uiteindelijke grootte en vorm bepaalt. De celwand bestaat uit een complexe matrix die polysacchariden bevat, waaronder cellulose-microfibrillen die zowel kristallijne structuren vormen als celluloseketens met amorphe organisatie. De oriëntatie van de cellulosevezels en hun concentraties bepalen de mechanische eigenschappen van de cel. Er worden verschillende methoden gebruikt om de niveaus van kristallijne cellulose te bepalen, elk met voor- en nadelen. Sommige kunnen het aandeel van kristallijne gebieden binnen de totale cellulose onderscheiden. Ze zijn echter beperkt tot analyses van het hele orgaan die gebrekkig zijn in ruimtelijk-tijdelijke informatie. Andere, die afhankelijk zijn van live-beeldvorming, worden beperkt door het gebruik van onnauwkeurige kleurstoffen. Hier rapporteren we een gevoelig op gepolariseerd licht gebaseerd systeem voor specifieke kwantificering van relatieve lichtvertraging, die de accumulatie van kristallijne cellulose vertegenwoordigt in dwarsdoorsneden van Arabidopsis thaliana wortels. In deze methode worden de cellulaire resolutie en anatomische gegevens behouden, waardoor directe vergelijkingen mogelijk zijn tussen de verschillende weefsels die de groeiende wortel samenstellen. Deze aanpak opent een nieuw analytisch dimensie, waardoor licht wordt geworpen op de link tussen celwandsamenstelling, cellulair gedrag en groei van het hele orgaan.

Introduction

De plantencelwand is een dynamische structuur. Groeiende cellen zijn omgeven door een primaire celwand, de organisatie die het cellen groeien. Cellen die ophouden te groeien storting een meer rigide secundaire muur die de mechanische ondersteuning van de plant verbetert. Beide celwanden bestaan ​​uit cellulose microfibrillen ingebed in een matrix van polysacchariden van verschillende structuren (bijvoorbeeld hemicellulose en pectine) die uiteenlopen van ontwikkelingsstadium en weefsels ^1,2. Cellulose wordt gesynthetiseerd als ketens van (1,4) -β-D-glucan die nauw zijn afgestemd op de microfibril van een kristallijne structuur. Amorfe cellulose verwijst naar de regio's waar de glucan ketens minder worden besteld. De verhouding tussen de kristallijne en de amorfe domeinen één parameter aangenomen dat de mechanische eigenschappen van de celwand beïnvloeden door mechanische sterkte en viscoelastische karakteristieke respectievelijk ^3. Er zijn verschillende methodenontwikkeld voor het detecteren en kwantificeren van de twee vormen van cellulose inrichting, waaronder röntgendiffractie en kruispolarisatie / magic angle spinning solid-state NMR ^4. Röntgendiffractie kan worden gebruikt om het aandeel van kristallijn cellulose versus amorfe domeinen bepalen in het monster ^5. Een alternatieve werkwijze gebruikt fractionering van celwand inhoud in zuur onoplosbaar en zuur-oplosbaar materiaal, onderscheid maken tussen de kristallijne en amorfe cellulose of andere polymeren, respectievelijk. In deze benadering wordt incorporatie van gemerkte glucose ^([14C] glucose) gebruikt om de cellulose ^6,7 kwantificeren. Deze werkwijzen vereisen grote hoeveelheden plantmateriaal gehele orgel analyses hooguit en dus zijn onvoldoende gevoelig voor weefsel-specifieke variatie in structuur van de celwand. Visualisatie van cellulose microfibrillen op cellulair resolutie kan worden bereikt in levende imaging studies samen met fluorescerende kleurstoffen ^8,9, dat veranderingen kunnen identificerende oriëntatie van de cellulose microfibrillen. Echter, deze kleurstoffen niet gebruikt voor kwantificatie, ze zijn niet specifiek voor kristallijn cellulose en kan interfereren met de normale structuur van de celwand ^8. Polscope is een beeldvormende techniek die berust op het vermogen van kristallijne cellulose lichtbundels gesplitst en vertragen deel van het licht ^10. Lichte vertraging is het sterkst microfibrillen die loodrecht liggen op de richting van de lichtpropagatie. Voor microvezels met gelijke oriëntatie, hoe hoger de mate van kristalliniteit, hoe groter het licht ¹¹ vlamvertraging. Derhalve wordt polscope gebruikt om zowel de relatieve niveaus en oriëntatie van de cellulose microfibrillen bestuderen.

Wortels vertonen lineaire groei, waarbij cellen uit de stamcelniche, aan het uiteinde van de wortel, ondergaan een reeks celdelingen, voordat ze snel uit te breiden ^12. De cellen die de wortel uit te breiden in een één richting (anisotrope)wijze zoals gedicteerd door klein molecuul signalering hormonen die de eigenschappen van de celwand ¹³ beïnvloeden. Differentiële reacties op hormonen, in tijd en ruimte, een middel van een evenwichtige orgel groei ^14. Derhalve kan een hoge resolutie analyse van celwandstructuur belangrijke informatie die nodig beter begrip van de verbinding tussen celtype-specifieke reacties op hele organen behalen. Hier melden wij de uitvoering van polscope weefsel-specifieke accumulatie van kristallijne cellulose studeren in Arabidopsis wortels, zoals waargenomen in hoge kwaliteit anatomische secties. Deze methode recent ontdekt celtype-specifieke accumulatie van kristallijne cellulose als reactie op ruimtelijke verstoring van hormonale activiteit ^15.

Protocol

1. Plant Groei

1. Surface steriliseren zaden.
   1. Steriliseren zaden (tot 30 mg) door natte of droge methode. Als voorbeeld voor droge sterilisatiemethode, voeg 1 ml glaciaal 37% HCl in 50 ml bleekmiddel, in een glazen beker in een gesloten exsiccator gedurende tenminste 4 uur en tot overnacht. Voer deze stap in een chemische kap.
2. Verspreid de steriele zaden op platen met 0,8% plantaardige agar in 0,5x Murashige & Skoog (MS) medium. Wikkel platen met Parafilm of poreuze tape en dek af met aluminiumfolie.
3. Bewaar de platen bij 4 ° C gedurende 1-4 dagen uniforme ontkieming te bevorderen.
4. Breng de platen een groeikamer geschikt voor de teelt Arabidopsis zaailingen. Plaats de platen verticaal wortelgroei bovenop het agarmedium te houden en doordringing te voorkomen.
5. Transfer zaailingen tot 7 dagen na het ontkiemen fixeermiddel (DAG).

2. fixatie

1. Bereid 50 ml Richardson Solution door het combineren van gelijke volumes van 1% Borax (buffer agent), 1% methyleenblauw en 1% Azure (histologische kleurstoffen) met tweemaal gedestilleerd water. Filteren door middel van een spuit Driven 0,22 pm PVDF Filter Unit voor gebruik.
2. Bereid 50 ml fixatief: 1,25% glutaraldehyde in 0,05 M natriumcacodylaat (buffermiddel).
   Opmerking: Deze materialen zijn toxisch en moeten in een chemische kap behandeld.
3. Voeg 100 gl Richardson oplossing (zie 2.1) aan de fixatie-oplossing (zie 2.2) aan de uiteindelijke bevestiging oplossing te verkrijgen.
4. Mark elk putje van een 6-well plaat met de bijbehorende sample naam.
5. Place 2-3 ml definitieve fixatie-oplossing (zie 2.3) in de putjes, zodat de zaailingen eenmaal overgedragen volledig gedekt in vloeistof.
6. Zorgvuldig overbrengen behulp van een tang, tot 10 zaailingen aan elk putje. Dicht de platen met behulp van Parafilm. Bewaren bij 4 ° C, in het donker, gedurende ten minste een nacht en maximaal een week.

3. Uitdroging

1. Dehydrateer zaailingen. Overbrengen tussen putjes van nieuwe 6-well platen gemaakt met toenemende concentraties ethanol, zoals hier vermeld: 10% ethanol gedurende 15 min; 30% ethanol gedurende 15 min; 50% ethanol gedurende 15 min; 70% ethanol gedurende 15 min; 85% ethanol gedurende 15 min; 95% ethanol gedurende 15 min; 95% ethanol bij 4 ° C overnacht, minimaal. Behandel zaailingen door ze voorzichtig vast te pakken door hun zaadlobben, bij voorkeur met plastic tang.

4. Infiltratie

1. Bereid infiltratie medium. Meng de inhoud van 1 zakje de historesin kit activator met 50 ml Basic harsvloeistof kit in een klein glazen flesje. Roer met magneet voor 20 min. Infiltratie medium kan bij 4 ° C gedurende enkele weken houdbaar.
2. Mark elk putje van een nieuwe 6-well plaat met de bijbehorende monsteromschrijving en vul met 2-3 ml van infiltratie medium.
3. Breng de zaailingen van de 95% ethanoloplossing de infiltratie medium behulp van een tang. Zorg ervoor dat de zaailingen fully waarop het medium.
4. Bewaren bij 4 ° C gedurende ten minste 4 dagen, om maximale penetratie zorgen in plantenweefsels.

5. Block Voorbereiding

1. Plaats kleine labels, potlood-gemarkeerd met sample naam, binnen elk putje van inbedding mallen.
2. Bereid inbedding medium door toevoeging van 1 ml verharder tot 15 ml infiltratie medium (zie 4.1). Probeer niet om een ​​volume te bereiden die kleiner is dan 15 ml, om problemen polymerisatie te voorkomen.
3. Vul helft van elk putje in de vorm met 200 ul inbeddingsmedium en bedek met een overhead filmstuk de gietvorm snijden, maar tot een grootte 1 mm groter aan weerskanten. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur, om polymerisatie mogelijk. Niet meer dan 5 uur.
4. Bereid een extra partij inbeddingmedium (zie 5.2) en blijf op ijs, om polymerisatie te vermijden terwijl wortel tips worden aangebracht in de mal.
5. Snijd elke wortel tip onder een dissectie scope met behulp van scalpel en zeer zorgvuldig te positioneren it: verticaal voor dwarsprofielen of horizontaal voor langsdoorsnede ongeveer 2-3 mm van de matrijs periferie. Vul de mal volledig met het blokkeren oplossing en cover met een overhead film. Merk op dat de blokkerende oplossing enigszins krimpt wanneer het wordt gepolymeriseerd.
6. Bewaren bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, minimaal.
7. Om de blokken drogen plaatsen in een doos met droge silicagel en laat bij kamertemperatuur gedurende de nacht, minimaal.

6. Sectioning

1. Bereid glas messen van glas staven met een mes maker. Gebruik de glazen messen voor weefsel snijden. Snijd de glazen staaf in een vierkant en snijd het plein schuin naar twee messen te produceren, met behulp van een diamant scoring tool.
2. Sectie blokken in 2-3 micrometer breed plakjes, met behulp van een machine snijden. Plaats plakjes op een glasplaatje, op de top van gedestilleerd water druppels en plaats de dia op een warmte-blok ingesteld op laag vuur (50 - 60 ° C), totdat het water verdampt.

7. Slide Voorbereiding voor gepolariseerde microscoop

1. Richardson verdunde oplossing (zie 2.1) tot 0,2% van de oorspronkelijke oplossing en gebruik 1 ml aan de plakjes dekken. Leg ze op de hitte blok voor 5 sec en daarna wassen met gedestilleerd water.
2. Droog de dia op een hete plaat. Controleer onder een dissectie omvang en markeer de achterkant van de slede met een markering, waarmee de positie van de segmenten van belang aangeven van latere identificatie onder de microscoop te vergemakkelijken.
3. Voeg 100 ul van montage medium en dek af met een deksel slip.

8. Image Acquisition

1. Plaats de bedekte dia met de baanvakken onder een lichtmicroscoop met Polscope passend om retardance informatie en een polarisator / optische interferentie filter (figuur 1 AD) te verkrijgen.
2. Kies een vergroting die duidelijke visualisatie van het gehele monster mogelijk maakt (bijvoorbeeld 40X in deze studie) en de focus van de microscope op een leeg veld dat blok sectie, maar geen wortel gedeelte bevat. Probeer om een ​​schone omgeving te vinden zonder vlekken. Gebruik deze regio om de achtergrond in te stellen.
3. Stel de imaging-systeem en de software parameters: Stel bereik tot 17 nm. Apply "Auto Exposure" en achtergrondafbeelding te verkrijgen van het lege veld (zie 8.2). afbeelding Een achtergrond wordt gebruikt per experiment.

9. Polscope Analyse van Cellulose microfibril Orientation

1. Analyse van de langsprofielen.
   1. Plaats een dia met longitudinale secties onder de microscoop en een retardance beeld van te krijgen. De focus van de microscoop op een wortel gedeelte van belang. Zorg voor een nieuwe bestandsnaam.
   2. Maak een foto Abrio (afbeelding met vertraging informatie) door het raam "Levende Abrio". Zeker een sectie die de celwand, die kan worden geïdentificeerd door de gekleurde cellulose langs de omtrek van de cel, zoals getoond in Figuur 2C omvat vangen.
2. Beeldanalyse.
   1. Dubbelklik op de desbetreffende afbeelding in de stack. Selecteer "Orientation Pseudo kleur" in het tabblad 'Display Settings ".
   2. De cellulose microfibril hoek schatten, overeenkomen met de overeenkomstige kleur van de celwand dat bij het kleurenwiel.
      OPMERKING: De kleurenwiel in Figuur 2C geeft de langzame as van het licht liggen langs de microfibril die richting langs de lengteas van de microfibrillen toont. De hoek van cellulose microfibrillen is het aangegeven door de kleur en de lange as van de cel. Bijvoorbeeld, de verlengende cel in het vak ziet cyaan kleur, gekanteld over 90 ° op de lengteas van de cellen.
   3. Voor de gemiddelde microfibril hoek in de celwand te kwantificeren, gebruik "retardance en Azimuth Stamp" tool op de werkbalk van de software. Terwijl de selectie van het gereedschap, punt en klik op de regio van belang in het verkregen beeld.
      LET OP: Dit will resulteren in de weergave van de hoeken (azimut) in graden (figuur 2C).
   4. In een alternatieve open access gepolariseerd het licht analyse software, lunch "Pol-Analyzer" plugin van de plugin menu. In het nieuw geopende venster selecteert u het tabblad "Dubbele breking" en open en sla de achtergrond bestand en het beeldbestand.
   5. In het venster afbeelding, selecteer "Specs." en stel de 'ROI pixelgrootte' (gebruik 5 pixels voor deze studie). In de "Specs." venster, selecteer "toont waarden in Result table".
   6. Gebruik de Polygon gereedschap om de regio van belang in het venster afbeelding te markeren. Selecteer "oriëntatielijnen" naar de oriëntatie van de cellulose microfibril verkrijgen.
      Opmerking: Dit zal resulteren in de weergave van de hoeken (azimut) in graden.
      OPMERKING: De gemiddelde hoek berekend door een van beide methoden moeten vervolgens genormaliseerd naar de positie van de wortel doorsnede volgens de glijbaan. Om te corrigeren voor afwijkingen vande horizontale positie van het gehele wortel doorsnede volgens de slede kwantificeren gemiddelde microfibril hoek van de celwand aan weerszijden van de cel langs de lengteas (dat wil zeggen, loodrecht op de sectie en langs de wortelgroei as, Figuur 2C). Deze hoek is 180 ° bij de wortel gedeelte nauwkeurig gepositioneerd langs de glijbaan. Voor het berekenen van de microfibril hoek aftrekken van de gemiddelde gemeten microfibril hoek van de flankerende celwand van 180 °. Voeg de resulterende verschil van de gemiddelde gemeten microfibril hoek van de celwand die plat ligt op de dia.

10. Polscope Analyse van kristallijne cellulose accumulatie

1. Gebruik de dwarse (kruis) secties. Merk op dat kristallijne cellulose ophoping alleen vergeleken tussen cellen bij de cellulosemicrovezels bij elkaar aansluitende gelijke hoek (zoals bepaald 9).
2. Dubbelklik op de desbetreffende afbeelding in de stack. Selecteer "Pseudo kleur "in het tabblad" Display Settings ".
3. Om retardance meten. Inzoomen op het beeld. Selecteer "Regio" en markeer alle regio's van belang. Ga naar het tabblad "metingen" en "Kopiëren naar klembord" alle waarden.
   1. De gegevens over naar Excel en vereiste informatie (gemiddelde regio retardance) extract. Normaliseren van de data.
      LET OP: Als u rekening te houden met de verschillen in dikte tussen de schijfjes, drukken de waarden ten opzichte van een specifieke celwand rand in de dia. Te normaliseren, verdelen de gemiddelde retardance overeenkomt met de celwand van belang die de gemiddelde retardantie van een ander celwand in dezelfde afbeelding. Zo werd het epidermale buitenste celwand genormaliseerd naar de binnenwand corticale celwand in onze studie.
4. Herhaal metingen gedurende minstens 3 delen per wortel, met een minimum van 3 wortels per monster.

Results

We bestuderen de effecten van celtype-specifieke reacties op brassinosteroiden (BRS) met de Arabidopsis wortel als model orgaan ^15-17. Wanneer de BR-receptor BRI1 is gericht, op de achtergrond BRI1 mutant, een subset van epidermale cellen die niet-haarcellen (Figuur 2A, B), remt unidirectionele celexpansie van naburige cellen, en hele-wortelgroei ^15. Polscope analyse werd uitgevoerd om het mechanisme achter deze remming onthullen. ...

Discussion

Hier presenteren we een methode voor het bepalen van de accumulatie van kristallijn cellulose in de verschillende weefsels van het Arabidopsis wortels, met behoud van anatomische informatie. Als zodanig verschaft een extra stap naar het begrijpen van groeiprocessen in planten op cellulair resolutie. Deze werkwijze kan ook worden toegepast voor het bestuderen van aanvullende plantensoorten en organen.

Een aantal punten moet rekening worden gehouden bij de toepassing van de methode. E...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige & Skoog (MS)	Duchefa	M0221
Borax	LOBA CHEMIE	6038
Methyleenblauw	Sigma	M-9140
Azure	Sigma	861065
Spuitgedreven 0,22 mm PVDF-filter	MILLEX-GV
Glutaraldehyde	EMS	16220
Natriumcacodylaat	Sigma	C-0250
Leica kit historesin	Leica	7022 18 500
Inbeddingsvormen	Agar Scientific	AGG3530
film 100 µ P.P.C.	www.Jolybar.com		overhead film
Knivemaker	LKB	7800
Ultratome III	LKB	8800	Ultratome
Shandon immumount	Thermo	9990402	montagemedium
lichtmicroscoop	Nikon	Eclipse 80i
Abrio beeldvormingssysteem	CRI	Abrio beeldvormingssysteem
Abrio V2.2 software	CRI	Abrio V2.2 software
Open access gepolariseerd licht beeldanalyse software	OPS	OpenPolScope	http://www.openpolscope.org/