Direct-current stimulatie en multi-elektrode Array Registratie van Inbeslagneming-achtige activiteit in de muizen Brain Slice Voorbereiding

Summary

Studies hebben aangetoond dat cathodale transcraniële gelijkstroom-stimulatie onderdrukkende effecten kan hebben op geneesmiddelresistente epileptische aanvallen. In deze studie werd een in vitro experimentele opstelling bedacht waarin de gelijkstroom-stimulatie en de multi-elektrode array-registratie van aanvallen-achtige activiteit werden geëvalueerd in een herfsnede-preparaat van muizen. De parameters van de gelijkstroom-stimulatie werden geëvalueerd.

Abstract

Kathodische gepulste elektromagnetische velden (tDCS) induceert onderdrukkende effecten op de resistente aanvallen. Om effectief acties uit te voeren, de stimulatie parameters (bv, oriëntatie, veldsterkte, en duur stimulatie) nodig hebben bij muizen hersenen slice voorbereidingen worden onderzocht. Testen en regelen van de oriëntatie van de elektrode ten opzichte van de positie van de muizen hersenen slice haalbaar. De onderhavige werkwijze behoudt de thalamocingulate weg naar het effect van DCS op de anterior cingulate cortex inbeslagneming-achtige activiteiten te evalueren. De resultaten van de multikanaals matrix recordings aangegeven kathodische DCS significant af van de amplitude van de stimulatie opgewekte responsen en duur van 4-aminopyridine en bicuculline geïnduceerde aanvallen-achtige activiteit. Deze studie is ook gebleken dat de kathodische DCS toepassingen op 15 min veroorzaakt langdurige depressie in de thalamocingulate route. De huidige studie onderzoekt de effecten van DCS op thalamocingulate synaptische plasticiteit en acute inbeslagneming-achtige activiteiten. De huidige procedure kan testen de optimale stimulatie parameters zoals oriëntatie, veldsterkte en de duur stimuleren in een in vitro muismodel. Ook kan de werkwijze de effecten van DCS corticale aanvallen-achtige activiteiten zowel op cellulaire als netwerkniveau evalueren.

Introduction

Epilepsie is een veel voorkomende neurologische aandoening. Dertig procent van de patiënten met epilepsie lijdt aan medicijnresistente aanvallen¹. Transcraniële directe stroom stimulatie (tDCS) biedt een niet-invasieve aanpak om netwerkactiviteiten over grote hersengebieden, zoals aanvallen, te beheersen of te veranderen. Klinische studies hebben aangetoond dat tDCS effectief is bij de behandeling van onbehandelbare aanvallen² en zowel korte- als langetermijnonderdrukkende effecten op aanvallen kan produceren^3-5. De therapeutische werkingsmechanisme van tDCS is echter nog steeds onduidelijk. Het gepresenteerde hersensnedemodel is een in vitro methode om te onderzoeken hoe het therapeutische werkingsmechanisme van tDCS de symptomen van aanval-achtige hersenactiviteiten verandert. Om de optimale effecten te bereiken, moeten specifieke stimulatieparameters, waaronder oriëntatie, veldsterkte en duur van de stimulatie, in een experimenteel model worden getest. Eerdere studies hebben aangetoond dat de oriëntatie van het elektrische veld belangrijk is om therapeutische effecten te verkrijgen⁶. Daarom is het testen en rangschikken van de oriëntatie van de elektroden ten opzichte van de positie van de geteste hersensnede haalbaar.

Frontaalkwab epilepsie en voorste cingulumkwab (ACC) aanvallen zijn vaak geneesmiddelresistent^7,8. Sommige studies hebben de toepassing van tDCS in de cingulumkwab gerapporteerd^9-11. tDCS is getoond om waakzaamheid, besluitvorming en emotie te beïnvloeden door verandering van ACC-activiteiten, en kan neuronale prikkelbaarheid en aanvalactiviteit in deze hersengebied moduleren¹². Daarom kunnen onderdrukkende effecten van tDCS op ACC-aanvallen nuttig zijn voor klinische behandeling en de evaluatie van alternatieve behandelingen.

Het huidige protocol beschrijft de voorbereiding van een elektrode in de opnamekamer voor DCS van een hersensnede en het effect ervan op de registratie van aanval-achtige activiteit met een multi-elektrode array (MEA).

Protocol

Procedures die proefdieren te betrekken werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en Ingebruikname Comité, Academia Sinica, Taipei, Taiwan.

1. Voorbereiding Experimentele Solution en Apparatuur voor multielectrode Array Recording

1. Bereid kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF; 124 mM NaCl, 4,4 mM KCI, 1 mM NaH ₂ PO _3, 2 mM _MgSO4, 2 mM _CaCl2, 25 mM NaHCO ₃ en 10 mM glucose, geborreld met 95% _O2 en 5% CO _2).
2. Gebruik twee types van MEA probes: 6 x 10 vlakke MEA en 8 x 8 MEA. Eerstgenoemde sondekapjes de regio die de cortex, striatum en thalamus omvat. De laatste sonde heeft alleen betrekking op de corticale regio.
3. Gebruik een 60-kanaals versterker met een banddoorlaatfilter ligt tussen 0,1 Hz en 3 kHz bij 1200 amplificatie. Het verwerven van gegevens op een 10 kHz sampling rate.
4. Plaats twee AgCl-gecoat zilver draden in de MEA kamer voor DCS. Gebruik de AgClbeklede zilverdraden elektrische velden die worden gegenereerd door een geïsoleerde stimulator produceren.
5. Plaats een wolfraam elektrode (diameter 127 micrometer, lengte, 7,62 cm; 8 ° AC conische tip; weerstand, 5 MQ) voor de thalamus stimulatie, en plaats de referentie-elektrode in de MEA kamer. Leveren stromen de wolfraam elektrode via een geïsoleerde stimulator die wordt bestuurd door een pulsgenerator.

2. Brain Slice Voorbereiding

1. Gebruik mannelijke C57BL / 6J muizen, 4-8 weken oud. Het huis van de dieren in een kamer met airconditioning (21-23 ° C; luchtvochtigheid van 50%; 12 uur / 12 uur licht / donker cyclus, lichten aan om 08:00) met vrije toegang tot voedsel en water.
2. Neem een ​​250 ml portie van de aCSF die bereid was in stap 1.1, en plaats deze in een bekerglas dat ijs bevat. Tegelijkertijd leveren continu gas dat bestaat uit 95% _O2 en _5% CO2.
3. Chirurgie
   1. Verdoven het dier met 4% isofluraan in een glasbox voor ongeveer 3 minuten. Zodra het dier een chirurgische diepte van de anesthesie (aangegeven door het ontbreken van een reactie op de teen knijpen) bereikt, leg het op een ondiepe lade die is gevuld met crushed ijs, en verwijder het hoofd met een schaar.
   2. Expose de schedel, en trim de resterende spier. Vervolgens wordt met behulp van rongeurs, afpellen van het dorsale oppervlak van de schedel van de hersenen. Knip de zijkanten van de schedel met behulp van rongeurs. Steriliseren alle chirurgische instrumenten met een 75% ethanoloplossing.
   3. Met behulp van een spatel, snijd de olfactorische bollen en zenuwverbindingen langs het ventrale oppervlak van de hersenen, en verwijder de hersenen. Na onthoofding snel de hersenen overdragen aan een bekerglas gevuld met ijskoud geoxygeneerd aCSF.
4. Bereiding van Medial Thalamus (MT) -ACC Brain Slice
   Let op: Bereid plakken dat het pad van het MT om ACC ¹³ bevatten.
   1. Hand-snijd de hersenen blok met twee sagittale sneden 2,0 mm lateraal van de middellijn in elk halfrondde subcorticale anatomie weergegeven. Maak dan twee schuine bezuinigingen. Maak de eerste cross-snede evenwijdig met de zichtbare fiber-darmkanaal in het striatum.
   2. Maak de tweede doorsnede van de verbinding tussen het cerebellum en de visuele cortex naar het midden tussen de voorste en commissure optische stelsel die ventrale en parallel aan de thalamocingulate biosynthese.
   3. Bevestig de hersenen blok naar een hoekige plaat (~ 120 °) met cyanoacrylaat lijm, en maak een snede net boven het keerpunt van de route. Vouw de plaat, plat, en lijm deze op de kamer fase van een vibratome.
   4. Voeg mediale thalamus-ACC hersencoupes (500 urn dik) en dompel hen in ijskoud geoxygeneerd aCSF.Transfer plakken aan de opname kamer, en laten 32 ° C onder continue perfusie (12 ml / min) met geoxygeneerd aCSF gedurende 1 hr.

3. Voorbereiding van de perfusie kamer voor multielectrode Array Recording

1. Voorbereidingvan perfusie kamer
   1. Plaats een MEA probe op een multi-kanaalsysteem, en gebruikt twee verschillende polyethyleenbuizen de probe verbinden met een peristaltische pomp. Gebruik een buis naar de aCSF begeleiden in de MEA kamer en de andere buis naar de aCSF uit de kamer te begeleiden. Tenslotte continu perfuseren de bereiding met warme (29-30 ° C) geoxygeneerd aCSF (8 ml / min).
2. Transfer slice hersenen om MEA. Houd de hersenen slice op de MEA met een natte wattenstaafje. Verplaats de hersenen slice zorgvuldig zodat de ACC boven de elektroden georiënteerd.
3. Gebruik slice anker kits en hold-downs om op de hersenen slice. Deze stap zorgt voor een goede elektrische verbinding tussen het segment en elektroden.

4. Het genereren van elektrische velden door DCS

Opmerking: De definitie van het elektrische veld oriëntatie was gebaseerd op de richting van de axodendritic as in de ACC. De oriëntaties van dendrieten en soma compartimenten warenbevestigd met Golgi kleuring ^12.

1. Plaats het AgCl elektrode (gedefinieerd als de anode) proximaal van de ACC en plaats de andere elektrode (gedefinieerd als de kathode) distaal van de ACC. Noteer de veldsterkte die wordt gegenereerd door de twee oriëntaties veld (parallel en loodrecht op de ACC axodendritic vezels) Door de MEA en levert de stroom van de elektrische velden met een stimulator.
2. Bevestig de afstand van het AgCl elektroden (ongeveer 1,5-2 cm) en pas stroomsterkte de stimulator naar de DCS tussen 0,5 en 2 mA maken.

5. Elektrisch-geïnduceerde corticale Synaptic Responses

Opmerking: Laten synaptische responsen in de ACC door elektrische stimulatie in de MT, waarin een programmeerbare elektrische stimulus generator produceert rechthoekige tweefasige stroompulsen.

1. Herhaal Sectie 3 hierboven.
2. Plaats een wolfraam elektrode in de MT, en peulvruchten te verlossen van de stimulator naar de Thalamic regio van de schijfjes via bipolaire wolfraamelektroden.
3. Gebruik maken van verschillende stroomsterkten om de drempel dat een ACC reactie uitlokt vast te stellen. Hier, gebruik een intensiteit van ± 150 pA en duur van 200 psec, wat een 80% maximale respons in de ACC meeste segmenten opgewekt.
4. Beweeg de wolframelektrode langs de thalamocingulate route (van MT naar corpus callosum) in de MT-ACC slice naar de optimale respons profielen te verkrijgen.
5. Maak 10-20 sweeps van ACC reacties, en het gebruik van de software om automatisch het gemiddelde van alle van de ACC opgeroepen door MT stimulatie. Het resultaat iss de synaptische reacties in ACC opgewekt uit MT stimulatie door MT-ACC route.

6. Elektrisch-geïnduceerde inbeslagneming-achtige activiteit

Opmerking: Beslag-achtige activiteit werd geïnduceerd door toepassing van 4-aminopyridine (4-AP, 250 pM) en bicuculline (5 uM). Vorige tijd-control studies toonden aan dat maximale en stabiele reacties verschenen2-3 uur na drug toepassing ^14.

1. Herhaal Sectie 5 hierboven.
2. drugs toe te voegen aan de perfusie-oplossing. Gebruik 4-AP (250 uM) en bicuculline (5 uM). Meng de drugs gelijkmatig en verder perfusie 2-3 uur.
3. Beslaglegging-achtige activiteit vergemakkelijken, handhaven de perfusiepomp relatief snel perfusiesnelheid (8 ml / min), die ook kan helpen voorkomen dat de opbouw van een pH gradiënt.
4. Plaats een wolfraam elektrode in de MT, en leveren van elektrische stimulatie (150 uA, 200 psec duur) aan ACC reactie profielen te verkrijgen.
5. Voeg 10-20 sweeps en het gemiddelde van de respons.
6. Vervang de perfusie oplossing met verse aCSF uit te spoelen de drugs. Herhaal stap 6.5.

7. Testen Effect van DCS op Opgeroepen corticale Responses

1. Herhaal de punten 3 en 4. Zorg ervoor dat uniforme elektrische velden worden opgewekt door het passeren van stromen tussen twee parallelle AgCl-gecoat zilver draden die in de M zijn geplaatstEA kamer. Als er geen problemen, de DCS blijft tussen de 0,5 en 2 mA.
2. Schakel de DCS, en plaats een wolfraam elektrode naar de thalamus te stimuleren (± 150 uA, 200 psec duur). Om maximale synaptische reacties in de ACC te verkrijgen, maken 10-20 veegt en het gemiddelde van de reacties.
3. Tegelijkertijd zet de DCS (2 mV / mm DCS sterkte) en thalamus stimulatie (350 uA, 200 psec duur). Evalueer de veranderingen van de amplitude van de thalamus stimulatie opgewekte ACC respons tijdens DCS.
4. Schakel de DCS en voeg 4-AP (250 uM) en bicuculline (5 uM) aan de perfusievloeistof. Wacht dan 2-3 uur. Als de drugs van invloed op de hersenen slice, de slice produceert corticale beslag reacties.
5. Maak 10-20 sweeps van ACC reacties, en meet vervolgens de amplitude en de duur van de elektrische opgeroepen corticale beslag reacties.
6. Na stap 7.5, tegelijkertijd zet de DCS (2 mV / mm DCS sterkte) en thalamus stimulatie (150 uA, 200 duratiop usec). Evalueer veranderingen in de amplitude en duur van corticale opgewekte responsen in beslag DCS toepassing.
7. Vervang de perfusie oplossing met verse aCSF uit te spoelen de drugs, en herhaal de stappen 7.2 en 7.3.
8. Verzamel alle van de registratie van de gegevens, en de groep van de gegevens in de verschillende experimentele omstandigheden. Evalueer de amplitude en duur van corticale beslag gedrag onder verschillende experimentele omstandigheden.

8. Data Analysis

1. Gebruik software (bijv MC Rack software) om automatisch het gemiddelde van de opgenomen reacties, en de uitvoer van de ruwe data naar een spreadsheet. Analyseer de amplitude en duur van de ruwe gegevens en het genereren van kleur cijfers.
2. Om oscillerende inbeslagneming gebeurtenissen op te sporen, te gebruiken software om de basiswaarde en standaarddeviaties (SD) te meten. Set 3 SD van het geluidsniveau als de drempel. Amplituden van de pieken in een oscillatie geval deze drempel overschrijden automatisch detecterened.
3. Voer de statistische analyse met Student's t-test.
4. Express metingen en one-way variantie-analyse (ANOVA) resulteert in de tekst als gemiddelde ± SE, met n met vermelding van het aantal schijfjes bestudeerde ^12.

Results

Voorbereiding van de Thalamocingulate Slice en MEA Recording System Setup

De MT-ACC segment van muizen is een speciaal segment preparaat dat verkenning van de elektrofysiologische eigenschappen van het thalamocingulate route toelaat. Figuur 1A toont de wijze waarop de MT-ACC slice bereid. De hersenen van de muis werd snel verwijderd en bewaard in koud geoxygeneerd aCSF (Figuur 1A, a, b). Om su...

Discussion

In deze studie werden de effecten van de duur en oriëntatie van DCS ACC aanvallen-achtige activiteit getest. Stabiele data in muizenhersenen plakjes verkrijgen, hoe de integriteit van de MT-ACC pathway houden en om schade te voorkomen is het belangrijk, met name de stappen waarin twee schuine sneden ventrale en dorsale verlaging van de cortex gemaakt. Bovendien kan de tijd om de hersenen slice bereiden beïnvloeden ook de activiteit van de hersenen deel, dat zo snel mogelijk naar de hersenen vers en sterk te houden moete...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Verdovingsmiddel:
Isofluraan	Halocarbon Products Corporation	NDC 12164-002-25	4%
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
aCSF (totaal:1 L):
D(+)-Glucose	MERCK	1.08337.1000	10 mM
Natriumwaterstofcarbonaat	MERCK	1.06329.0500	25 mM
Natriumchloride	MERCK	1.06404.1000	124 mM
(+)-Natrium L-ascorbaat, >=98%	SIGMA	A4034-100G	0.15 g/2 c.c
Magnesiumsulfaat, watervrij, ReagentPlus	SIGMA	M7506-500G	2 mM
Calciumchloridedihydraat	MERCK	1.02382.1000	2 mM
Natriumdiwaterstoffosfaatmonohydraat	MERCK	1.06346.1000	1 mM
Kaliumchloride	May & Baker LTD Dagenham England	MS 7616	4.4 mM
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Geneesmiddelen:
(+)-Bicuculline	TOCRIS	0130	5 µM in aCSF
4-Aminopyridine	TOCRIS	0940	250 µM in aCSF
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Herfsnede-voorbereiding:
Vibratome	Vibratome	Series 1000	Bloksnijden in 500 µm dikke plakken
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
MEA-systeem:
Multi-elektrode-array (MEA) sondes: 6 x 10 planaire MEA	Multi Channel Systems	60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10	elektrodediameter, 30 µm; elektrodeafstand, 500 µm; impedantie, 50 kΩ bij 200 Hz
Multi-elektrode-array (MEA) sondes: 8 x 8 MEA	Ayanda Biosystems	60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8	piramidevormige elektrode; diameter, 40 µm; tiphoogte, 50 µm; elektrodeafstand, 200 µm; impedantie, 1.000 kΩ bij 200 Hz
Een 60-kanaals versterker werd gebruikt met een banddoorlaatfilter ingesteld tussen 0,1 Hz en 3 KHz bij 1.200X versterking	Multi-Channel Systems	MEA-1060-BC
MC Rack-software met een samplefrequentie van 10 KHz	Multi-Channel Systems		Software voor gegevensverzameling en opnames
besturing van een pulsgenerator	Multi-Channel Systems	STG 1002
Snede-ankerkits en -vastzetklemmen	Warner Instruments	SHD-26H/10; WI64-0250
Peristaltiekpomp-minipuls3	Gilsom	MINIPULS3	perfusiesnelheid: 8 ml/min
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Stimulatiesysteem:
Geïsoleerde stimulator	A-M Systems	Model 2100	intensiteit van ±350 μA, duur van 200 μsec
Wolfraamelektrode	A-M Systems	575300	geplaatst in de thalamus