Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Novel Metrics te karakteriseren Embryonale Verlenging van de nematode

5.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53712

⸱

28 maart 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry, Pharmaqam, Université du Québec à Montréal

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we protocollen die specifiek zijn ontworpen om morfogenetische defecten te monitoren die optreden tijdens de vroege en late fasen van embryonale verlenging van de rondworm Caenorhabditis elegans. Uiteindelijk zijn deze protocollen ontworpen om genen te identificeren die deze fasen reguleren en om hun differentiële vereisten langs de antero-posterior as van het embryo te karakteriseren.

Samenvatting

Het onderzoeken van de signaalroutes die de verandering van morfogenetische processen tijdens de embryonale ontwikkeling regelen, vereist robuuste en gevoelige metrische methoden. De embryonale verlenging van de nematode Caenorhabditis elegans is een late ontwikkelingsfase die bestaat uit de verlenging van het embryo langs de lengteas. Deze ontwikkelingsfase wordt geregeld door intercellulaire communicatie tussen hypodermale cellen en de onderliggende lichaamswandspieren. Deze signaalmechanismen controleren de morfologie van hypodermale cellen door het cytoskelet en de cel-celverbindingen om te vormen. Meting van embryonale letaliteit en ontwikkelingsstop in larvale stadia, evenals verandering van het cytoskelet en cel-cel-hechtingsstructuren in hypodermale en spiercellen zijn klassieke fenotypes die al meer dan 25 jaar worden gebruikt om deze signaalroutes te onderzoeken. Recente studies vereisten de ontwikkeling van nieuwe metrische methoden die specifiek gericht zijn op vroege of late verlenging en het karakteriseren van morfogenetische defecten langs de antero-posteriore as van het embryo. Hier bieden we gedetailleerde protocollen die de nauwkeurige meting van de lengte en de breedte van de verlengende embryo's, evenals de lengte van gesynchroniseerde larven, mogelijk maken. Deze methoden vormen nuttige hulpmiddelen om genen te identificeren die de verlenging regelen, om te beoordelen of deze genen zowel de vroege als late fasen van deze fase controleren en gelijkmatig vereist zijn langs de antero-posteriore as van het embryo.

Inleiding

Al bijna 50 jaar gevestigd het aaltje Caenorhabditis elegans zich als een krachtig model op belangrijke vragen in de ontwikkeling, neurobiologie, evolutie, gastheer-pathogeen interacties, enz. Bestuderen 1 De kracht van dit model in de studie van de ontwikkeling ligt in: de korte levenscyclus van 3 dagen; het gemak waarmee deze dieren genetisch kunnen worden gewijzigd; de transparantie dat de waarneming van de cel verplaatsing en morfologie maakt in levende dieren en de ontwikkeling die is meestal extra-uteriene. De ontwikkelingsstadia van de nematode betrekking embryogenese en vier larvale stadia (L1 tot L4), gevolgd door volwassenheid. Tijdens de embryonale ontwikkeling, epidermale morfogenese vestigde aandacht op zijn vermogen om een ​​beter begrip van hoe epitheelcellen migreren als groep, hoe ze reorganiseren hun verbindingen mogelijk te maken en hun individuele morfologie en hun relatieve positie binnen een functioneel epitheel wijzigen.Epidermale morfogenese is verdeeld in vier fasen: dorsale intercalatie bestaande uit de reorganisatie van de dorsale epidermale cellen, als de onderhuid genoemd; ventrale behuizing, die bestaat in de migratie van ventrale onderhuidse cellen in de richting van het ventrale middellijn aldus het embryo in een epitheliale cel monolaag bekisten; vroege en late rek transformeren van de boon-vormige embryo in wormvormig larven. Naar aanleiding van morfogenese, embryo luik en L1 larven beginnen voeden met behulp van beschikbare bacteriën in hun directe omgeving.

Embryonale rek is derhalve een laat stadium van de embryonale ontwikkeling. Het bestaat uit de verlenging van het embryo langs zijn langsas en een vermindering van de transversale diameter. Het gaat om een ​​dramatische verandering van de vorm van hypodermale cellen. De rek wordt verdeeld in een vroege en een late fase. De eerste fase begint bij de komma stadium en eindigt wanneer het lichaam muur spieren beginnen aanbestedende op 1,75 maal het podium in wild-type (wt) embryo - overeenkomt met embryo's die 1,75 maal de lengte in vergelijking met niet-langwerpige embryo. Morfogene processen die zich in die fase worden vooral gedreven door samentrekking van filamenteus actine bundels (FBS) bij het ​​apicale pool van onderhuidse cellen die hun rek rijden langs de antero-posterior as van het embryo 2. Samentrekking van FB is controle door fosforylering van myosine-lichte ketens door drie kinases LAAT-502 / ROCK, MRCK-1 en PAK-1 5. De late fase van het rek, begint wanneer het lichaam muur spieren functioneel geworden en beginnen contracting. Het gaat om mechanotransductie signalering uit het lichaam muur spieren aan de dorsale en ventrale onderhuidse cellen en eindigt wanneer dieren broeden 3.

Rek defecten worden algemeen gekenmerkt door het percentage dieren sterven als embryo (embryonale letaliteit, EMB) en die de ontwikkeling arrestatie L1 larven (larven arrestatie fenotype; Lva) en beduidend korter dan gew. Identificatie van het stadium van ontwikkelings arrestatie vereist microscopische waarneming van dode embryo's en arresteerde Larven 3-6.

Recent werd aangetoond dat meerdere genen, zoals Cdc42 / Rac regulator en effector pix-1 en pak-1, controle morfogene processen tijdens zowel vroege als late rek 3,7. We hebben onlangs aangetoond dat morfogene werkwijzen verschillen langs de antero-posterior as van het embryo tijdens de vroege elongatie 3 7. Deze bevindingen gemotiveerd de ontwikkeling van nieuwe metriek specifiek gericht vroege of late stadia rek en andere statistieken waardoor de karakterisering van de morfologie van embryo's langs de antero-posterieure as tijdens de vroege rek.

Deze nieuwe werkwijzen omvatten het meten van de lengte van embryo aan het begin en aan het einde van vroege rek en de breedte van hun hijadvertenties en staarten. 7 Twee protocollen werden ontwikkeld om de lengte van de pas uitgekomen larven, gesynchroniseerd op L1 fase 7 meten.

De eierschalen van het embryo beschermen deze tegen alkalisch hypochloriet behandeling, terwijl larven, volwassen en bacteriën in de kweekmedia worden opgelost door de behandeling. Deze behandeling wordt vervolgens gebruikt om embryo's te zuiveren van een niet-gesynchroniseerde populatie een meerderheid van goed gevoede 8 volwassenen. Voedselrestrictie wordt gebruikt om pas uitgekomen larven synchroniseren. Lengtemeetapparaten deze larven wordt vervolgens gebruikt om rek defecten te detecteren. Deze meting heeft de voorkeur boven het meten van gearresteerde larven op kweekplaten omdat larven die uitkomen uit niet-volledig verlengde embryo kan herstellen "normale lengte" wanneer het wordt ingevoerd, maar hun geringe grootte handhaven wanneer gearresteerd in afwezigheid van voedsel.

Hier presenteren wij gedetailleerde protocollen waardoor de meting van de length van het verlengen van embryo's, evenals de breedte van de kop en de staart met behulp van time-lapse DIC microscopie en beeldanalyse (Protocol 1). We bieden ook gedetailleerde protocollen om de lengte van gesynchroniseerde larven met behulp van beeldanalyse (Protocol 2) en Flow-Cytometry (Protocol 3) te meten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Karakterisering van Vroeg Rek Defecten in WT en Mutant Dieren

  1. Montage van embryo's voor Normarski DIC Microscopy
    1. Bereid de volgende cultuur media en materialen:
      1. M9 buffer, los 12,8 g / l Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 g / l KH 2PO 4, 5 g / l NaCl, 0,25 g / l MgSO4 • 7H 2 O in gedestilleerd water en autoclaaf te steriliseren.
      2. NGM platen, los 3 g / l NaCl, 16 g / l agar, 2,5 g / l bactopepton in DDH 2 O. Autoclaaf en voeg 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 1 mM fosfaatbuffer en 5 ug / ml cholesterol. Pour 6 ml NGM per 60 mm schalen. Het medium laten stollen gedurende 24 uur bij kamertemperatuur geroerd. Voeg een paar druppels van een verzadigde kweek van E. coli OP50 bacteriën gekweekt in Luria-bouillon (LB). Laat de bacteriën groeien gedurende 48 uur en de platen bewaren bij 4 ° C.
      3. Om de worm pi genererenck, mount een 0,01 "diameter platina draad op een korte Pasteur pipet. Bevestig de platina-draad aan het uiteinde van de glazen pipet door het verwarmen van dit uiteinde met een benzeen brander. Vlak het uiteinde van de draad aan een soort schop te genereren.
    2. Groeien de worm spanning op 60 mm NGM platen met OP50 bij 20 ° C.
      OPMERKING: temperatuurgevoelige allelen vereisen het kweken van de dieren op niet-permissieve temperaturen tot 25,5 ° C. De platen moeten veel jonge volwassenen en nog genoeg voedsel bevatten om de protocollen te streven.
    3. Plaats een microscoopglaasje tussen twee spacer dia's die vallen onder twee lagen afplakband (Figuur 1A).
    4. Bereid een 3% agarose-oplossing (w / v) in M9 buffer door oplossen van 0,6 g agarose poeder in 20 ml M9 buffer door verwarmen in de magnetron gedurende 30 sec. Laat de oplossing afkoelen 5 minuten.
      OPMERKING: De agarose oplossing kan worden gebruikt voor een paar dagen na smelten in een magnetron. Hetkan ook worden hoeveelheden verdeeld en weken bewaard bij 4 ° C.
    5. Een druppel van 3% agarose hete oplossing op de glasplaatje tussen de twee spacer-dia. Vermijd de vorming van bubbels.
    6. Snel betrekking hebben op de agarose met een andere dia zoals weergegeven in figuur 1B en druk zachtjes naar beneden. De bovenste schuif zal de agarose druppel plat en het genereren van een pad met de dikte van twee lagen plakband.
    7. Laat de agarose te stollen gedurende ten minste 1 minuut bij kamertemperatuur of totdat de embryo's direct worden overgedragen aan de pad.
    8. Met behulp van een worm pick, transfer 20-30 goed gevoed jonge volwassenen uit de NGM-plaat in een micro-centrifuge buis met 400 ul van M9 buffer.
    9. Laat de wormen om sediment door de zwaartekracht ongeveer 5 minuten en verwijder het supernatant met behulp van een micropipet. Deze stap is bedoeld om het maximum van bacteriën geplukt met de nematoden verwijderen.
    10. Voeg 200 pl M9 buffer aan elke buis.
    11. Met behulp van een Pasteur pipette, overdracht van de inhoud van de buis (buffer en nematoden) een horlogeglas.
    12. Gebruik een of twee 25G 5/8 "naalden om de dieren op het midden van de body sectie (tussen de spermatheca en de vulva) te snijden.
      OPMERKING: Een scalpel kan ook worden gebruikt als alternatief voor naald (s). Doe dit op zwemmen nematoden en vergt vaak enige oefening. Het idee is om naalden een schaar of een mes afhankelijk hoeveel naalden worden gebruikt. Zodra de dieren worden opengesneden, hermafrodieten laat de embryo's in de buffer.
    13. Concentreer embryo's in het midden van het horlogeglas met vorming van een cirkelvormige vortex in de vloeistof.
    14. Verwijder het grootste deel van de M9 van het horlogeglas met behulp van een micropipet. Laat ongeveer 30 ul van M9 met de embryo.
    15. Verwijder de schuif die de agarose pad (Figuur 1B) door te schuiven van de pad.
    16. Snijd het pad met een scheermesje om zich volledig bedekken met een dekglaasje (Figuur 1C).
    17. Met behulp van een Pasteur pipet alle embryo's (en worm puin) op de agarose pad.
    18. Groep de embryo's in het midden van het kussen met een wimpers gelijmd aan het uiteinde van een tip voor 200 gl micropipetten.
    19. Plaats langzaam een ​​dekglaasje op het pad te voorkomen bubble vorming en verzegelen.
      OPMERKING: Verschillende sealers worden gebruikt. We gebruiken het tekenen gom gevonden in de kunst en ambachtelijke winkels (meestal gebruikt als maskering gom voor aquarel schilderen). Deze gom wordt gebruikt omdat het hydrofiel is en stolt redelijk snel en is niet toxisch voor de wormen. Dia's kunnen ook worden afgedicht met nagellak of valap (mengsel van vaseline, lanoline en Parafin was).
    20. Laat de tekening tandvlees droog gedurende ongeveer 15 min.
  2. Opnemen Vroege Rek met vier-dimensionale Normarski DIC Microscopy
    Opmerking: Het doel van deze stap is om vroege verlenging van komma opnemen begin late rek- Gedefinieerd als het moment waarop het lichaam muur spieren starten contracting. We streven ook naar meer dan één embryo in de tijd op te nemen. Acht uur rapporteringsperiode meestal nodig om vroeg rek nemen voor een groep van niet-gesynchroniseerde embryo.
    1. Plaats de gemonteerde-slide op het podium van een microscoop. Zorg ervoor dat de microscoop is uitgerust met een 10x en 60x doelstellingen, alsmede DIC lenzen, prisma, camera en capture software waarmee time-lapse microscopie en het genereren van Z-stacks (geautomatiseerde Z-platform).
      LET OP: zorg ervoor dat de temperatuur constant tussen 20 en 23 ° C in de microscopie kamer. Een verwarming koelkamer nodig kan zijn de microscoop podium, vooral bij gebruik van temperatuurgevoelige mutanten.
    2. Identificeer een groep embryo op vooraf morfogenese fasen met de 10X objectief.
    3. Eenmaal gevestigd, glijden de 10X objectief en voeg een druppel olie immersie op de dia.
    4. Met de 60X objectief, identificeren de boven- en onderkant van embryos het instellen van de Z-stack imaging parameters.
      NB: Aarzel niet om de Z-stack groter is dan de dikte van de embryo's in te stellen. Stel de afstand tussen twee aangrenzende vlakken 0,8 urn. Hierdoor zal de totale diepte van de embryo dekken 35-50 Z-plannen.
      LET OP: Als de microscoop bevat een geautomatiseerd xy-platform, kunnen embryo's zich op verschillende locaties van de pad tegelijkertijd worden opgenomen. Om dit te doen, op te nemen xy-coördinaten van elke locatie op het pad dat u wilt analyseren in de loop van het experiment. Zorg ervoor dat de xy bij het instellen van de parameter opname te selecteren en volg de rest van het protocol, zoals aangegeven. Dunne Z-snijden van het embryo tijdens de opname is niet per se nodig is voor de in dit protocol metingen. Opname embryonale ontwikkeling van wt en mutante dieren met de maximale resolutie is echter een goede gewoonte om een bibliotheek van opnames in staat om aanvullende analyses ondersteunen bouwen.
    5. setde time-lapse met 2 min intervallen tussen twee overnames durende 8 uur.
      OPMERKING: De belichtingstijd is afhankelijk van de lichtintensiteit voor de microscoop. Cel beweging tijdens de vroege rek is erg traag; exposure-time kon ongeveer één beeld per seconde of minder. Wanneer de embryo's in een vroeg stadium morfogenese (dorsale intercalatie, ventrale behuizing), zouden vroege rek worden geregistreerd binnen 1 uur. Zorg ervoor dat het licht sluiter wordt gesloten tussen elke overname.
    6. Voer de overname en op te slaan.
  3. Meting van vroege rek defecten middels beeldanalyse
    1. Open Fiji-ImageJ software ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
    2. Kies in het menu Analyseren / Set Metingen, selecteert Perimeter. Voor elk embryo, pas de Z-schaalbalk te richten op de keelholte van het embryo zoals getoond in figuur 2A. Dit zorgt ervoor dat u gericht op het midden van het embryo.
    3. Om de lengte van het embryo meten de tijd aanpassen schaalbalk het embryo van belang hebben bij aanvang van het eerste rek (komma stadium Figuur 2A). Let op de tijd ( "Time-begin").
    4. Kies de gesegmenteerde lijn tool. Trek een gesegmenteerde lijn van de punt van de mond van het embryo tot aan het uiteinde van de staart na de scheiding van het embryo (Figuur 2A). Met behulp van het tabblad menu Analyseren / Meet, de lengte van de getekende lijn ( "Lengte begin") te verkrijgen.
    5. Herhaal deze meting voor dezelfde embryo eind vroege rek (moment waarop spieren beginnen contracting). Noteer de tijd ( "Time-end") en meet de lengte van het embryo ( "Lengte-end") zoals hierboven (figuur 2B) beschreven.
    6. Bereken de duur (D) van de vroege rek en de lengtetoename (L) in deze fase als volgt:
      D = "Time-end" - "Time-begin '
      & #160; L = "Lengte-end" - "Lengte-begin '
    7. Om de breedte hoofd te meten, past de tijdschaal bar om een ​​embryo in het stadium van belang (1,2-voudig stadium of het einde van de vroege verlenging) te hebben. Kies de lineaire tool. Teken de transversale (dorso-ventrale as) middellijn van het hoofd. Deze sectie is het dikste gedeelte van de embryo (figuur 2C). Met behulp van het menu Analyseren / Meet, het verkrijgen van de lengte van de lijn die overeenkomt met het hoofd breedte.
    8. Op hetzelfde tijdstip Herhaal deze stap voor het tekenen van de transversale middellijn van de staart (middellijn tussen de intestinale klep en de staartpunt Figuur 2C) en meet het aan de staart breedte te verkrijgen.
      OPMERKING: Gebruik deze meting om embryo's te vergelijken in hetzelfde stadium in verschillende fenotypes. Om de reproduceerbaarheid van deze meting te garanderen, zorg ervoor dat een locatie gelegen rond het midden van de lijn van de staart van het dier die gemakkelijk van het ene dier kan worden herkend aan een vondstnother.
    9. Om de kop tot staart breedte verhouding berekenen, deelt het hoofd breedte bij de staart breedte.

2. Analyse van Late Rek Gebreken Met behulp van Image Analysis

  1. Synchronisatie van L1 Larven gebruik van Alkaline Hypochloriet Treatment
    1. Vanuit een niet-uitgehongerde mm plaat 60 met veel zwangere volwassenen, verzamel alle wormen in een micro-centrifugebuis door het wassen van de nematoden van de plaat met 1 ml M9 buffer met behulp van een Pasteur pipet.
    2. Sediment nematoden bij 3500 g gedurende 3 min bij kamertemperatuur en de bovenstaande vloeistof met behulp van een micropipet zonder de worm pellet.
    3. Voeg 1 ml hypochloriet oplossing aan elke buis (0,4 M hypochloriet, 0,5 M NaOH) en schud gedurende 3 minuten.
      LET OP: Alkaline hypochloriet oplossing moet vers worden bereid en embryo's in deze oplossing moet voorzichtig worden geschud, maar er voortdurend naar om de ontbinding van de volwassenen en de zuurstofvoorziening van de embr optimaliserenyos. Na 3 min schudden, moeten de meeste volwassenen hun eieren los in de oplossing.
    4. Spin bij 3500 g gedurende 3 min bij kamertemperatuur en snel de bovenstaande vloeistof met behulp van een micropipet zonder de pellet te verstoren.
    5. Was vier keer met 1 ml M9 buffer, gevolgd door centrifugatie bij 3500 g gedurende 3 minuten.
    6. Na de vierde wasbeurt, verwijder het supernatant en resuspendeer eieren in 700 pi M9 buffer zonder pipetteren de eieren (zoals de eieren zou vasthouden aan het plastic van de tip).
    7. Tape de buis op een 3-mm orbitale schudinrichting geplaatst in een incubator bij de geschikte groeitemperatuur en schudden bij 600 rpm overnacht.
  2. Lengte Meting van Synchronized Larven
    1. Centrifugeer gearresteerd L1 larven aan 3500 xg gedurende 3 min bij kamertemperatuur en de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de larven in 100 pi M9 buffer en over te brengen op een agarose pad met behulp van een Pasteur pipet (agarose pads moeten voorbereidend zoals beschreven in paragraaf 1.1.2 tot 1.1.8). Plaats een dekglaasje op het pad.
      OPMERKING: De pad hoeft niet te worden afgedicht met lijm voor dit experiment die korte acquisitie omvat.
    2. Gebruik een 10X objectief en fasecontrast verlichting aan de lengte van de larven meten of een hoge resolutie camera wordt gebruikt. Verhoging van de intensiteit van het licht om te kunnen foto's binnen een paar milliseconden te vangen en dus het verkrijgen van een duidelijk beeld van de larven (figuur 2D).
      OPMERKING: Tijdens het zwembad trashes van larven worden verminderd door de agarose pad, ze zijn nog steeds in beweging. Daarom hoge opnamesnelheden essentieel om een ​​duidelijk beeld te verkrijgen.
    3. Open Fiji-ImageJ en herhaal stap 1.3.1. Om de lengte van de larven te meten, kiest de gesegmenteerde lijn tool. Trek een gesegmenteerde lijn van de punt van de kop tot aan het uiteinde van de staart volgens de middellijn van de larven (figuur 2D, rechter paneel).
    4. Met behulp van het menu Analyseren / Meet, de lengte van de te verkrijgengetekende lijn overeenkomt met de lengte van de larven in micrometer.

3. Karakterisering van Late Rek Gebreken Met behulp van flowcytometrie

  1. Synchroniseer Larven
    1. Zuiveren embryo's met behulp van de alkalische hypochloriet behandeling zoals beschreven in paragraaf 2.1 van de volle 100 mm platen van weldoorvoede jonge volwassenen en laat de embryo luik en de L1 arrestatie in M9 buffer voor 16 tot 24 uur bij 20 of 25,5 ° C afhankelijk van de stam geanalyseerd.
      LET OP: Een volledige plaat van weldoorvoede volwassenen per stam is voldoende voor de hieronder beschreven analyse.
  2. Kalibratie van de Worm Sorter
    OPMERKING: De flowcytometer hier gebruikt is een groot deeltje flowcytometer (hierna de worm sorter). De worm sorter is voorzien van een 670 nm rode laser diode, die is gelegen in de voorkant van een uitsterven detector. De worm sorter bevat ook een multi-line argon laser voor fluorescerende excitatie. de standard instrumenten drie fotomultiplicatorbuizen (PMT) fluorescentie detectors gebruikt om fluorescentie-emissie in het groene, gele en rode gebieden van het spectrum te detecteren. In de hier beschreven protocol, wordt TOF worden gebruikt om de grootte van de larven te meten, wordt het rode kanaal worden gebruikt om dode wormen die worden gekleurd met propidiumjodide (PI) te identificeren. GP (General Purpose) Hoge Fluorescentie Controle Particles gebruikt om het instrument te kalibreren en als een interne controle in ons experiment hoge fluorescentie weergegeven in groen, geel en rood. Zij zullen de enige objecten in de analyse met hoge emissie gedetecteerd in het groene kanaal monster en worden vervolgens geïdentificeerd op basis van deze eigenschap.
    LET OP: Levende dieren worden geïdentificeerd op basis van de afwezigheid van fluorescentie in de groene en rode kanaal als op de TOF. Autofluorescente emissie uit de darm van de larven niet detecteerbaar L1 fase.
    1. Schakel de laser blok, de computer, de compressor eend de worm sorter instrument. Druk op de START-knop op de geopende worm sorteermachine software, zoals aangegeven in de gebruiksaanwijzing van het instrument.
    2. Houd u aan de pop-up venster argon laser controle. Selecteer RUN-modus en wacht als de laser bevoegdheden oplopen tot 10 ± 1 mW. Selecteer DONE op de laser controle venster.
    3. Stel de schede en het monster druk om 5,10 ± 0,02 en 5,51 ± 0,01, respectievelijk. Laat de druk in evenwicht gedurende minstens 15 min en klik op de DRUK OK vakje.
      OPMERKING: De stroomsnelheid is afhankelijk van de huls en het monster drukken.
    4. Zorg ervoor dat alle luchtbellen aanwezig in het stromingskanaal buisjes tussen het monster beker en de analyse kamer te elimineren. Om dit te doen, klikt u op verwerven en tik zachtjes tegen het buisje tot er geen bubble verworven (zoals te zien in het venster acquisitie).
    5. Instellen van alle parameters voor tl en TOF metingen en detectie als volgt:
      1. Stel de schalen voor TOF, Ext, groen, geel en rood aan256. Set winst zoals beschreven in Tabel 1. Stel PMT Control bij 700 voor Groen en Geel en tot 900 voor Red.
        OPMERKING: Twee excitatie filters zijn (488 nm en 514 nm) en kan worden gebruikt om ofwel Green fluorescent protein (GFP) of geel fluorescerend eiwit (YFP) of fluorochromen geëxciteerd bij deze golflengten met multiline argonlaser wekken. Gepaste filters nodig hebben in de filter kamer van de apparatuur in te voegen. We gebruikten de 488 nm filter voor het volgende experiment.
    6. Om de worm sorter kalibreren, selecteer "run controle deeltjes" in het gereedschap menu. Doe 20 ml van 1x GP (General Purpose) Hoge Fluorescentie Controle Deeltjes in de beker (deze deeltjes zijn fluorescerende deeltjes van precieze grootte, verkocht door de fabrikant cytometrie om hun instrument te kalibreren).
    7. Klik op de knop Ophalen om schede en monsterstroom beginnen.
      OPMERKING: Verwacht een gemiddelde verband met de controle korrelverdeling 21 ± 6 en acoefficient van de variatie rond dat gemiddelde (CV) ≤11. Als de CV is> 11 en het gemiddelde is> 27 proberen om de buisjes te reinigen door te klikken meerdere malen op de Clean-knop of door de knop van de stroom kanaal.
  3. Overname van Animal TOF
    OPMERKING: Licht verspreidt wanneer een voorwerp passeert in de stroomcel tussen de laserbron en het uitsterven detector. De tijd die het licht wordt verstrooid door het vliegend voorwerp (vluchttijd, TOF) wordt gebruikt om de axiale lengte van het object te meten. De omvang van licht gemaskeerd door het object (extinctie, EXT) wordt gebruikt als een maat voor de ondoorzichtigheid / optische dichtheid.
    1. Plaats 10 gl van gesynchroniseerde wildtype (wt) L1 in een horlogeglas en een schatting van het percentage dode eieren met behulp van een stereomicroscoop.
      OPMERKING: Gesynchroniseerde L1 tonen Emb hoog (hoger dan 20%) in gew mag niet worden gebruikt voor verdere analyse.
    2. Transfer gesynchroniseerd L1 uit de microcentrifuge (approximately 700 gl bevattende M9 L1) naar een 15 ml conische buis. Voeg propidium jodide (PI) bij een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml (verdunning 1/100 van een 1 mg / ml voorraadoplossing) en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur.
      LET OP: Dead eieren en larven worden gekleurd met PI en gedetecteerd als zeer fluorescerende objecten met behulp van het rode kanaal.
    3. Voeg 10 ml M9 buffer om op gebrandschilderd bevolking te verdunnen. Neem 5 ml van de verdunde bevolking en verdun ze vier keer door de toevoeging van 15 ml M9. Plaats deze verdunning in het monster beker.
    4. Laat het monster stroom door te klikken verwerven en te observeren het debiet.
      LET OP: Om een ​​nauwkeurige meting te hebben, het debiet moet blijven tussen 15 en 25 objecten / sec.
    5. Pas indien nodig het bedrag van dieren in de beker op het gewenste debiet te bereiken.
      OPMERKING: De stroomsnelheid zal afhankelijk van de druk (mantel en staal) die constant zijn zoals in 3.2.3 en de concentratie van larven in de beker. Als het debiet hoger is dan 25 objecten / sec voeg wat buffer in de beker. Als deze lager is dan 15 items / sec toe geconcentreerd L1 (uit stap 3.3.3) in de beker.
    6. Zodra de juiste concentratie van doel wordt bereikt, beoordelen het volume in de beker en voeg 1/4 e van dit volume in High Fluorescent GP Controledeeltjes 4x oplossing.
    7. Pas de gating en sorteren parameter. Om dit te doen, klikt u op 'Gating' op het menu en selecteer 'TOF vs.' en 'Green'. Klik op 'sorteren' op het menu en selecteer 'TOF vs.' en 'Red'. Gating en sorteren grafieken verschijnen dan zoals getoond in figuur 3A.
      LET OP: Dit zal de visualisatie van de controle deeltjes (emissie in groen en rood) mogelijk te maken, dode dieren gekleurd door PI en bellen (emissie in Rood en niet groen) en levende dieren (geen emissie in noch Groen of Rood kanalen) (figuur 3A ).
    8. Voer het experiment door te klikken ACQUire.
      LET OP: om kleine verschillen in grootte tussen de larven identificeren, analyseren ongeveer 10.000 objecten, dus ongeveer 8.000 dieren. Stop met het experiment en de gegevens als .txt-indeling exporteren door te klikken op STORE.
  4. Meting van de relatieve omvang van levende dieren in Synchronized Populaties
    1. Open het .txt bestand met behulp van een software in staat om grote hoeveelheden gegevens tabellen beheren.
    2. Van de geanalyseerde objecten extraheren de TOF behorende bij controle deeltjes die worden gekenmerkt door emissie in het groene kanaal hoger dan 100 arbitraire eenheden (dit is afhankelijk van de in punt 3.2.5 parameters). Maak een nieuwe kolom en noemen het 'control deeltjes'. Maak een kolom met alle andere voorwerpen behalve de controle deeltjes genaamd 'monster'. LET OP: de fluorescentie-emissie van nieuwe deeltje batch moet worden gecontroleerd voor aanvang van de acquisities. Dit zal de fluorescerende drempel waardoor de identificatie van de setcontrole deeltjes op L1s.
    3. Voor elk geanalyseerd stam identificeren van het gedeelte van het experiment waarbij de stroomsnelheid is gewijzigd (door de aanwezigheid van een prop eieren bijvoorbeeld). Om dit te doen:
      1. Zet de TOF "zeggenschap deeltjes 'voor elk monster als een factor van tijd (figuur 3B).
      2. Teken de lineaire trendlijn met behulp van de trendlijn gereedschap en de vergelijking op de kaart weer te geven.
        NB: De TOF controle deeltjes moet constant in de tijd (horizontale lijn, Figuur 3B). Gezien de vergelijking van de lineaire trendlijn getekend op de gegevens y = ax + b, ervoor te zorgen dat de 'a' waarde lager is dan 10 -4. Alle metingen binnen de tijd delen voor weergave van een breuk in de uitlijning van de controle deeltje moet uit de analyse worden verwijderd.
    4. Verwijder de dode embryo en bellen (emissie hoger dan 15 in het rood) evenals kleine puin en grote ei pluggen (TOF lager dan 10 en higher zijn dan 70, respectievelijk) van het 'monster' meting.
    5. Zet de distributie 'control deeltjes' voor elke stam geanalyseerd. Zoals blijkt uit figuur 3C deze distributies moet bijna perfect overlappen. Zodat TOF metingen verkregen voor verschillende stammen te vergelijken. OPMERKING: normalisatie van steekproefelementen TOF via control deeltjes kunnen worden gebruikt als de verdelingen van deeltjes in een controle monster geen overlay met die van controlemonsters. De genormaliseerde TOF worden berekend als volgt:
      1. Normaliseren TOF voor genotype G = (sample TOF voor G) / (gemiddelde 'control deeltje' TOF voor G) x (gemiddelde 'control deeltje' TOF voor wt), waar wt is de steekproef voor controles.
    6. Plot Larven TOF distributie voor elke stam inclusief de controle monster, in ons geval wt dieren (Figuur 3D). Meet het gemiddelde en de standaardfout van het gemiddelde (SEM) voor elke populatie ( Figuur 5A en B).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hoofd-, staart- en Head / Tail-breedteverhouding zijn robuust Metrics.

De hier beschreven protocollen zijn met succes gebruikt om de functie van regulatoren en effectoren van Rho GTPases pix-1, pak-1 karakteriseren en laat-502 tijdens de vroege elongatie 7. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft roman metrics om vroeg te karakteriseren en late stadia van de embryonale rek.

In hoofdstuk 1, de kritische stap is de mogelijke aanwezigheid van bacteriën op het pad. De embryo's zijn hermetisch afgesloten tussen het pad en het dekglaasje tijdens beeldacquisitie. Het afdichten van de slide is nodig om uitdrogen van de dieren tijdens het verwerven die meer dan twee uur duurt te voorkomen. Voor zover wij weten, geen van de jagers gebruikt om agarose pads tussen gli...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada en The Canada Foundation for Innovation. Dank aan Dr. Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) voor de let-502(sb118ts) stam. Enkele van de stammen werden verstrekt door het Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agar BioShopAGR001.500
AgaroseBioshopAGA001.500
CaCl2 (Calcium Chloride)Bio Basic Inc.CT1330
CholesterolSigma-aldrichC8667
Cleaning solution union Biometrica300-5072-000
Glass coverslipsFisherbrand12-542B
Glass slidesFisherbrand12-552-3
High fluorescent control particlesunion Biometrica310-5071-001
K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic)Bio Basic Inc.PB0447
K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic)Bio Basic Inc.PB0445
MgSO4 (magnesium sulfate)Sigma-aldrich230391
Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic)Bio Basic Inc.SDB0487
NaCl (sodium chloride)Bio Basic Inc.DB0483
Pebeo Drawing Gum 45 mlpébéoPDG033000any art/craft store
PeptoneBioShopPEP403.500
Sheath bufferunion Biometrica300-5070-100
COPAS Biosortunion Biometrica

Referenties

  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
  2. Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
  3. Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
  4. Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
  5. Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
  6. Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genetics. 156, 1671-1689 (2000).
  7. Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684(2014).
  8. Sulston, J., Hodgkin, J. Methods. Wood, W. B. , 587-606 (1988).
  9. Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
  10. Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
  11. Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077(2014).
  12. Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
  13. So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
  14. Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43(2014).
  15. Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
  16. Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Time-lapse microscopieflowcytometrieImageJ-analyseZ-stapel beeldvormingsorteren van wormenpropidiumjodide-kleuringmeting van de kopbreedteanalyse van de larvale lengte
Novel Metrics te karakteriseren Embryonale Verlenging van de nematode
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.