Dit artikel introduceert een eenvoudige benadering aan het verstrekken van niet-continu verlopende statische spanningen op een concentrische cel-beladen hydrogel te reguleren celuitlijning voor weefselengineering.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kleurovergang stam Chip voor de stimulerende cellulaire gedrag in cel-beladen Hydrogel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Kunstmatige begeleiding voor cellulaire uitlijning is een hot topic op het gebied van weefselengineering. Allermeest naar de vorige onderzoek heeft één stam-geïnduceerde cellulaire uitlijning op een cel-beladen hydrogel onderzocht met behulp van complexe experimentele processen en massale controle systemen, die meestal geassocieerd met besmetting kwesties. Dus, in dit artikel stellen wij een simpele aanpak aan de opbouw van een kleurovergang statische belasting met behulp van een fluidic chip met een plastic PDMS cover en een UV transparant glas substraat voor de stimulatie van cellulaire gedrag in een 3D hydrogel. Overbelading foto-patternable cel prepolymeren in het fluidic kamer kunt genereren een convex gebogen PDMS membraan op de cover. Na UV crosslinking, via een concentrische circulaire micropattern onder de gebogen PDMS membraan, en buffer wassen, een communicatie voor behandelende cel gedrag onder een verscheidenheid van kleurovergang stammen is zelf gevestigd in één fluidic chip, zonder externe instrumenten. NIH3T3 cellen werden aangetoond na het observeren van de verandering in de trend van de cellulaire uitlijning onder begeleiding van de meetkunde, in samenwerking met de stimulatie van de stam, die van 15-65% op hydrogels variëren. Na een 3-daagse incubatie domineerde de hydrogel geometrie de celuitlijning onder lage druksterkte stam, waar cellen uitgelijnd langs de hydrogel rek richting onder hoge druksterkte stam. Tussen deze toonden de cellen willekeurige uitlijning als gevolg van de afbraak van de radicale begeleiding van hydrogel rek en de richtsnoeren van de geometrie van de patroon hydrogel.
Inleiding
Een blok-materiaal dat een inheemse communicatie bootst bijeenkomen, kan een hydrogel extracellulaire matrix (ECM) met herbouwen biomimetische weefsel steigers ter ondersteuning van de celgroei. Om te bezitten van de functies van een weefsel, is georganiseerde Celuitlijning een essentiële eis. Diverse 2D (dat wil zeggen, de cellen gekweekt op een oppervlak) en 3D (dat wil zeggen, de cellen ingekapseld in een hydrogel) cel uitlijning zijn bereikt door kweken of inkapselen van cellen in of op flexibele ondergronden met micro- of nano-patronen1. 3D uitlijning in microarchitectuur is aantrekkelijker te maken, zoals de communicatie dichter bij de inheemse weefsel construct2,3,4 is. Een gemeenschappelijke aanpak voor 3D Celuitlijning is de geometrische cue hydrogel vorm2,3. Vanwege de beperkte ruimte voor celproliferatie in de richting van de korte-as willen cellen uitgelijnd langs de richting van de lange-as in een micro-patroon hydrogel. Een andere benadering is trekvast stretch beroep openstaan bij de hydrogels om Celuitlijning parallel aan de stretch richting4,5.
Biofysische stimulatie op ECM hydrogels, zoals druksterkte stam of een elektrisch veld, kan reguleren cel functies voor goede weefsel integratie, proliferatie en differentiatie1,2,3. Veel onderzoek is gedaan om te onderzoeken van cellulaire gedrag door één stam voorwaarde toe te passen op een moment met behulp van meerdere mechanische controle eenheden4,6,7,8,9. Bijvoorbeeld is het gebruik van mechanische stap motors geperst of uitgerekt over een 3D cel-ingekapseld collageen hydrogel een gemeenschappelijke aanpak7,10. Echter, dergelijke controlerende apparatuur vereist extra ruimte en geconfronteerd met het probleem van de besmetting in de incubator7,9,11,12. Daarnaast het grote instrument niet het geven van een nauwkeurige controleomgeving te bieden hoge reproduceerbaarheid13.
Gezien het feit dat de cel-beladen hydrogels meestal op de micro-schaal voor biomedische toepassingen worden ingezet, is het voordelig om te combineren MEMS technieken voor het genereren van een aantal van de stam/stretch stimulatie te onderzoeken gelijktijdig cel gedrag in 3D biomimetische constructies in vitro2,14,15,16,17,18. Bijvoorbeeld kan met behulp van gasdruk te vervormen het PDMS membraan in microfluidic chips aanleiding geven tot verschillende stammen, celdifferentiatie rijden naar verschillende geslachten9,16. Er zijn echter vele technische uitdagingen, zoals de gecompliceerde chip fabricage processen in een schone kamer en de software controle integratie van motoren, pompen, afsluiters en samengeperste gassen.
In dit werk tonen we een eenvoudige benadering van een zichzelf onderhoudende kleurovergang static-stam microfluidic chip verkrijgen door gebruik te maken van een concentrische circulaire hydrogel patroon en een flexibele PDMS membraan. In tegenstelling tot de meeste van de bestaande benaderingen is ons platform een draagbare en wegwerp miniatuur-apparaat dat kan worden vervaardigd buiten een gele kamer en die bezit zelf genereren kleurovergang stammen op concentrische cel-ingekapseld hydrogels, zonder externe mechanische apparatuur tijdens de incubatie. 3T3 fibroblast cel gedrag beïnvloed door een combinatie van hydrogel vorm en een scala aan treksterkte stretch begeleiding signalen werden gedemonstreerd tijdens de observatie van de celuitlijning in 3D ECM-mimetische omgevingen in de kleurovergang stam-chip voor 3 dagen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. GelMA-synthese
- Weeg 10 g gelatinepoeder af en voeg dit toe aan een glazen kolf met 100 mlDulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS). Doe een magnetische roerlat in de kolf en plaats deze op een roerende hotplate.
- Dek de kolf af met aluminiumfolie om waterverdamping te voorkomen. Stel de hot plate temperatuur in op 50-60 °C en de roerder op 100 rpm gedurende 1 uur om het gelatinepoeder goed op te lossen.
- Nadat de gelatine is opgelost, voeg 8 mL methacrylzuuranhydride zeer langzaam toe (één druppel per seconde) met behulp van een pipette. Laat het reageren bij 60 °C gedurende 3 uur.
- Voeg voorverwarmde DPBS (40 °C) toe aan de kolf tot een eindvolume van 500 mL en laat deze mix gedurende 15 minuten mengen om de reactie te stoppen.
- Snij ondertussen een dialysemembraan (14 kDa snijwergrootte) in verschillende buizen van 25 cm lang. Dompel ze 15 minuten onder in gedeïoniseerd (DI) water en maak een knoop om één uiteinde van de dialysebuizen te sluiten.
- Laad de geschikte hoeveelheid (30 - 60 mL) van de polymeeroplossing in de dialysebuizen en sluit het andere uiteinde. Plaats ze in een 5-L plastic beker met DI water gedurende een week. Ververs het DI water twee keer per dag en houd de oplossing tijdens het dialyseproces op 40 - 50 °C.
- Verzamel de oplossing uit de buis in een glazen fles van 500 mL. Giet ~450 - 500 mL oplossing in een 500-mL filterbeker (poriegrootte van 0.22 µm) en breng een vacuüm aan op de filterbeker om de oplossing door de filtermembraan te forceren voor sterilisatie.
- Breng de gesteriliseerde polymeer over in verschillende gesteriliseerde buizen van 50 mL en bewaar ze in een -80 °C vriezer gedurende 3 - 5 dagen.
- Vriesdroog de -80 °C polymeer gedurende 1 week met behulp van een vriesdroger om GelMA te vormen. Bewaar de GelMA in een -80 °C vriezer.
2. 3-(Trimethoxysilypropyl)methacrylaat (TMSPMA)-modificatie
- Snij commerciële glasplaten in twee kleine stukken (25 mm x 37,5 mm) en dompel ze 4 uur lang onder in 0,5 M NaOH-oplossing. Was de platen met een grote hoeveelheid DI water.
- Plaats de plaat op een rek in een glazen container met 95% ethanol en reinig met behulp van een ultrasone reiniger op 43 kHz gedurende 15 minuten. Laat de glasplaat aan de lucht drogen.
- Dompel de glasplaten 1 uur lang in 5% TMSPMA in 99,5% ethanol.
- Was de platen in 95% ethanol, laat de platen aan de lucht drogen en gloei de TMSPMA-coating in een oven gedurende 2 uur bij 80 °C.
3. Chipfabricage
- Neem één 2 mm- en één 0,3 mm-dik polymethylmethacrylaat (PMMA) plaat, breng dubbelzijdig plakband aan op één zijde van het PMMA-oppervlak en laat de lijnvoering aan één zijde los. Laat twee 2 mm-dikke PMMA-platen en één 1 mm-dikke plaat zonder dubbelzijdig plakband achter.
- Snijd met een laser een 2 mm-dikke PMMA-plaat zonder dubbelzijdig plakband tot 42 mm x 30 mm om de onderplaat te maken. Snijd een 2 mm-dikke PMMA-plaat met dubbelzijdig plakband om de randplaat te maken, met buitenafmetingen van 42 mm x 30 mm en binnenafmetingen van 37,5 mm x 25 mm.
- Snijd met een laser de 0,3 mm-dikke PMMA-plaat met dubbelzijdig plakband in een 12 mm-centrumcirkel met twee 2 mm-brede en 8 mm-lange stromingskanalen aan tegenovergestelde kanten van de cirkel (Figuur 1a).
- Om de PMMA-mal voor het gieten van de PDMS-afdekking voor te bereiden, monteer de drie stukken PMMA-componenten uit stappen 3.2-3.3 (Figuur 1b) met behulp van dubbelzijdig plakband.
- Snijd met een laser een 2 mm-dikke PMMA-plaat met dubbelzijdig plakband in een 5 cm x 5 cm stuk met een 3 x 3-array van 8,5 mm x 8,5 mm holle rechthoeken. Snijd nog een 5 cm x 5 cm stuk met een 3 x 3-array van 4 mm holle cirkels. Snijd met een laser een 1 mm-dikke PMMA-plaat zonder dubbelzijdig plakband in een 5 cm x 5 cm PMMA-onderplaat.
- Bereid de PMMA-mal voor om de PDMS-plug te gieten door de drie stukken PMMA-componenten uit stap 3.5 (Figuur 1c) met behulp van dubbelzijdig plakband samen te stellen.
- Bereid de PDMS-afdekking en PDMS-plug voor door 30 g PDMS-elastomeer en 3 g PDMS-hardingsmiddel goed te mengen; schuim het mengsel onder vacuüm gedurende 1 uur.
- Giet 1,8-2,0 g van het mengsel in de PMMA-mal voor de PDMS-afdekking en gebruik de geschikte hoeveelheid om elke holte van de PMMA-mal voor de PDMS-plug te vullen. Giet 10 g ongehard PDMS-mengsel in een lege 10-cm plastic plaat. Doe deze mallen in een vacuümkamer om gedurende 30 minuten te schuim.
- Hard de PDMS gedurende 2 uur bij 80 °C. Nadat de gehard PDMS op de mal is afgekoeld, verwijder de PDMS-afdekkingen en de PDMS-plugs van de PMMA-mallen.
- Puns twee gaten met diameters van ongeveer
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om te vergelijken de mechanische variaties tussen elke circulaire hydrogel in de voltooide kleurovergang stam stimulatie-chip, we gemeten de breedte van de lijn van elke ronde hydrogel in twee van de dezelfde chips, met injectie hoeveelheid 0 µL (figuur 4a) en 40 µL (figuur 4b), respectievelijk. Het percentage versnellingen op elke cirkel werden berekend door de versnellingen in de 40 µL-geïnjecteerd chip door de breedte van de l...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze paper rapporteren we op een eenvoudige benadering te vergelijken het uitlijningsgedrag cel na hydrogel vorm begeleiding en treksterkte rek. Een flexibele membraan PDMS creëert een koepel-vormige kromming voor het genereren van verschillende hoogtes van concentrische circulaire hydrogels. Na het loslaten van de druk, het PDMS membraan automatisch toegepast kracht op de hydrogels micro-patroon te vormen van de kleurovergang stam/rek, met een maximum in het midden en ten minste bij de buitenste rand. Zoals de vormin...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit project werd ondersteund door de Graduate Student studie in het buitenland programma (NSC-101-2917-I-007-010); het programma van de biomedische ingenieurstechnieken (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); en de nanotechnologie nationale programma (NSC-101-2120-M-007-001-), National Science Council van de R.O.C., Taiwan. De auteurs bedank Prof. Ali Khademhosseini, Gulden Camci-Unal, Arghya Paul en Ronglih Liao aan Harvard Medical School voor het delen van de hydrogel en cel inkapseling-technologie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL zwarte microcentrifugebuisje | Argos Technologies | 03-391-161 | Deze kan worden vervangen door een 1,5 mL buisje met een neutrale kleur, bedekt met aluminiumfolie |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | Voor het labelen van levensvatbare cellen |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Celmembraan doordringbare oplossing | Sigma-Aldrich | X100 | 0,5% Triton X-100 voor het doordringen van de celmembraan |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Kleurstof voor celkern |
| Dialyse membraan | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecuulgewicht afsnijding = 14.000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Dubbelzijdig plakband | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G2500 | Gelsterkte 300, type A, uit varkenshuid |
| Elektronische corona generator met hoge frequentie | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylzuuranhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Microspruit | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscoop | Olympus | IX71 | Inclusief twee filtersets: LF405/LP-B-000 en LF488/LP-C-000 van Semrock |
| Oxygenplasmamachine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Voor het fixeren van cellen |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mengsel voor het fabriceren van PDMS-chip-afgietsel |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicilline/streptomycine |
| Foto-initiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidiumjodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Voor het labelen van dode cellen |
| Steriele filtratiecup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | Voor hydrogel immobilisatie |
| Ultrasone apparatuur | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV-licht | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Vriesdroger | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automatische Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
Referenties
- Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells. Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Guan, J., et al. The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics. Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).
- Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system. Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).
- Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall. Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).
- Ramon-Azcon, J., et al. Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells. Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).
- Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation. PLoS One. 7 (9), e46689(2012).
- Gould, R. A., et al. Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture. Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells. Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).
- Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-Induced Alignment in Collagen Gels. PLoS One. 4 (6), e5902(2009).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Wan, J. Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery. Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).
- Segers, V. F., Lee, R. T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).
- Hsieh, H. Y., et al. Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment. Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
