Dit protocol beschrijft een hoogdoorlaattest voor het testen van ei-legvoorkeuren van Drosophila melanogaster met een nauwkeurigheid per enkel dier. Deze test biedt een eenvoudige, efficiënte en schaalbare platform om genen en circuitonderdelen te identificeren die een eenvoudig besluitvormingsproces controleren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
High Throughput Assay to-eierleggende Voorkeuren van de individuele onderzoeken
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Onlangs, eierleggende voorkeur van Drosophila heeft ontpopt als een genetisch handelbaar model om de neurale basis van eenvoudige besluitvormingsprocessen te bestuderen. Bij het selecteren van sites om hun eieren afzetten, vrouwelijke vliegen in staat zijn om de rangschikking van de relatieve aantrekkelijkheid van hun opties en het kiezen van de "grootste van twee goederen." Echter, de meeste eierleggende voorkeur assays zijn niet praktisch als men wil een systematische genetische screening aanpak om te zoeken naar het circuit basis ten grondslag liggen aan deze eenvoudige besluitvorming, want ze zijn basis van de bevolking en moeizaam op te zetten. Om de doorvoer te verhogen bestuderen van eierleggende voorkeuren van enkele vrouwtjes ontwikkelden wij aangepaste kamers die elk kunnen tegelijkertijd assay-eierleggende voorkeur tot dertig individuele vliegen en een protocol dat ervoor zorgt elk vrouwtje een hoge eierleggende rate (zodat hun voorkeur gemakkelijk waarneembaar en overtuigender). Onze benadering is eenvoudig uit te voerenen geeft zeer consistente resultaten. Bovendien kunnen deze kamers zijn voorzien van verschillende hulpstukken om de video opname leg dieren en licht leveren voor optogenetics studies. Dit artikel bevat de blauwdrukken voor het vervaardigen van deze kamers en de procedure voor het bereiden van de vliegen te worden getest in deze kamers.
Inleiding
Drosophila melanogaster is een krachtig genetisch modelorganisme om de neurale basis van gedrag te bestuderen. De snelle ontwikkeling van genetische hulpmiddelen om neuronen op een gerichte manier te manipuleren en de opkomst van geavanceerde gedragsanalysetools hebben ons vermogen om de circuitmechanismen die ten grondslag liggen aan de sensorisch-motorische transformatieprocessen van verschillende aangeboren en aangeleerde gedragingen1-3 te ontleden aanzienlijk verbeterd.
Drosophila eierlegging is een geschikt model om de neurale basis van eenvoudige besluitvormingsprocessen te bestuderen. In het bijzonder is aangetoond dat Drosophila-vrouwtjes het vermogen hebben om hun opties te vergelijken en te rangschikken voordat ze zich "verplichten" om een ei op een bepaalde optie te leggen4-8. Wanneer bijvoorbeeld alleen een eenvoudig (suikervrij) substraat of alleen een sucrose-bevattend substraat wordt gegeven, accepteren vrouwtjes beide opties voor het leggen van eieren. Wanneer ze echter beide opties worden gepresenteerd, verwerpen vrouwtjes in sommige contexten robuust het sucrose-substraat7,9,10. Er is echter relatief weinig bekend over de neurale mechanismen die vrouwtjes in staat stellen "het grootste van twee goederen te kiezen". Een grote hindernis is geweest het ontbreken van een efficiënte methode om eierlegvoorkeuren te meten, zodat een systematische genetische screeningsbenadering kan worden gebruikt om dit probleem te bestuderen.
In dit rapport beschrijven we het protocol dat we hebben ontwikkeld en dat het mogelijk maakt om de eierlegvoorkeuren van vrouwtjes met een nauwkeurigheid van één dier te meten en met een aanzienlijk verbeterde doorvoer en consistentie ten opzichte van eerdere methoden. Specifiek bieden we de blauwdrukken voor het bouwen van de door ons ontworpen kamers, het protocol voor het voorbereiden van de vrouwtjes zodat elk is voorbereid om veel eieren te leggen, en het protocol voor het gebruik van de kamers.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding Flies te worden getest
- Cultuur vliegt op standaard melasse / maïsmeel media op incubator ingesteld op 25 ° C en 65% luchtvochtigheid. Zorg ervoor dat de flesjes niet overladen. Bijvoorbeeld, zet 8 vrouwen en 6 mannen in een smalle voedsel flacon.
Opmerking: De "narrow eten flesje" hier wordt gebruikt heeft een inwendige diameter van 2,3 cm. Wij doorgaans verdeeld over 10 ml vlieg voedsel in elk flesje. De vlieg voedsel recept we gebruikten is hier beschreven: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2-3 dagen na verpopping vrouwen, bereid flesjes met verse gistpasta zie figuur 1E. Voeg verse gist pasta door het mengen van 6 g actieve gist met 10 ml 0,5% propionzuur. Gebruik een spatel om de gistpasta toepassing op de zijwand van het eten flesjes. Verzamel 30-35 Bijlage In vrouwtjes samen met 20 - 25 mannen in de flesjes.
- In het algemeen is het verzamelen van de mannetjes van de zelfde flesjes waar de vrouwtjes worden verzameld(Om tijd en moeite te besparen). Indien er bezorgdheid over de vruchtbaarheid van mannelijke Gebruik WT mannetjes plaats. Ook gistpasta is belangrijk om het eierproductie daarom dagelijks vers bereid.
- Handhaaf de verzamelde vrouwtjes / mannetjes bij 25 ° C, 65% vochtigheid, tenzij de vliegen temperatuurgevoelig zijn.
- Na ~ 4-5 dagen, controleer dan de flesjes om te zien of vrouwtjes zijn klaar voor eierleggende experimenten. Ze zijn klaar wanneer het oppervlak van het voedsel medium is nat van larven actief gravende in het eten (zie figuur 1E - F).
Opmerking: De vrouwtjes meestal weigeren eieren leggen zodra het eten oppervlak nat en kruipen met larven wordt. Deze stap zorgt ervoor dat vrouwen klaar om te veel eieren te leggen wanneer ze substraten met een gewenste textuur zouden komen (bv., ~ 1% agarose).
2. Chamber Bouw, Vergadering, Assay Setup
- Heeft u een machine winkel te bouwen acryl-eierleggende kamers (Figuur 1A - D). De technische tekening van de verschillende stukken werden getoond in Aanvullende Figuur 1 -. 3 Hoge resolutie foto's kunnen ook hier te vinden (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Invoegen kunststof vellen in lading (bovenste) deel van de kamer zoals getoond in figuur 1C. Dit dient als de onderkant tijdens het laden vliegt in individuele eierleggende arena's.
- Verdoven vrouwtjes op een CO 2 pad en laad ze afzonderlijk in elk eierleggende arena. Laat ~ 30 min voor vliegen om te herstellen van de CO 2 en raken gewend aan de nieuwe omgeving.
- Bereid de agarose substraten.
- Voor het gemak, houdt een premade fles gesmolten 1% agarose in een 55 ° C waterbad.
- Voeg de gewenste hoeveelheid voorraad sucrose oplossing (2 M) in een 50 ml conische buis en mengen met geschikte hoeveelheid agarose. Bijvoorbeeld, de 150 mM sucrose substraat bereiden place 750 ul van 2 M sucrose-oplossing in de buis en vervolgens de buis te vullen met agarose aan de 10 ml markering.
- Bereid de vlakte substraat op dezelfde manier, maar voeg gedistilleerd water in plaats van sucrose-oplossing.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van agarose in dit protocol iets minder dan 1%. In onze ervaring, is de precieze concentratie van agarose niet zo lang uit als het wordt geregeld om binnen ~ 0,9-1,1% en dat de twee substraten van dezelfde concentratie agarose.
- Neem het substraat (onder) deel van de kamer en pipetteer 1000 pi agarose substraat in elke trog zoals in figuur 1D.
- Sta agarose stollen gedurende ~ 30 minuten.
- Nadat de agarose substraten en vliegen zijn klaar, assembleren alle drie stukken van de eierleggende kamer en neem dan de plastic vellen.
- Plaats de kamers in vlieg incubators.
Opmerking: De lengte van eierleggende experimenten kunnen variëren, afhankelijk van ervaproefgroepen behoeften. Wij doorgaans het experiment O / N (14-16 uur). Ook, geen significante impact van de circadiane timing on-eierleggende voorkeuren werd waargenomen. - Verdoven vrouwtjes door het injecteren van CO 2 in de kamer. Demonteer de kamer, gooi de verdoofde vliegen in fly lijkenhuis (bijv., Kan een lege koffie gevuld met een aantal maïsolie). Neem foto's van de resultaten voor het bijhouden van gegevens (zie figuur 2).
- Handmatig tellen het aantal eieren en bereken voorkeur indices voor analyse. Bereken voorkeur index als (N a - N b) / (N a + N b) waarbij N a en N b vertegenwoordigen aantal eieren op de site van een vs. plaats b, respectievelijk.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De eierleggende kamers zijn samengesteld uit verschillende stukken: een substraat (bodem) stuk, een verdeler (midden) stuk, een belasting (top) stuk, en 2 schuifdeuren (Figuur 1A - D). Deze stukken worden gebruikt om zelfstandig setup vliegen en substraten voor eierleggende experimenten. Figuur 1F toont hoe flacons moeten uitzien als vrouwtjes klaar zijn voor eieren leggen. Wanneer vliegen kiezen tussen een effen ondergrond en sucrose bevattend substraat...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De kamers en protocollen hier beschreven hebben een aantal verbeteringen ten opzichte van vorige eierleggende assays. Ten eerste, ze verhogen de doorzet van testen voorkeur van enkele dieren aanzienlijk. Elke kamer kan assay 30 alleenstaande vrouwen en het duurt minder dan een uur op te zetten. Ten tweede, ze verhogen de consistentie van de eierleggende voorkeuren ten opzichte van eerdere methoden. De standaardisering van de afmetingen van de arena, grootte van de leg substraten, en de afstand tussen de substraten maakt...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij bedanken de Duke Physics Shop, in het bijzonder Phil Lewis, voor het helpen bij het bouwen van de gedragsapparatuur en de bijlagen en het maken van de tekening. Dit werk wordt gefinancierd door de National Institutes of Health onder toekenningsnummer R01GM100027.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Eierleggende kamers | Op maat gemaakt | ||
| Camerahouders | Op maat gemaakt | ||
| LED-houders | Op maat gemaakt | ||
| Vliegvialen (smal) | Genesee | 32-116BC |
Referenties
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436(2011).
- Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910(2012).
- Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
- Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335(2015).
- Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
- Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
- Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432(2015).
- Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
- Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
