Methodenartikel

Immunofluorescentie analyse van endogene en exogene Centromere-kinetochoor Eiwitten

DOI:

10.3791/53732

⸱

3 maart 2016

 , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Nationwide Children's Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we protocollen om endogene en exogene centromeer-kinetochoor-eiwitten in menselijke cellen te detecteren en deze eiwitniveaus op centromeren-kinetochoren te kwantificeren door indirecte immunofluorescente kleuring door het gebruik van fixatie (paraformaldehyde, aceton of methanol fixatie).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Centromeren" en "kinetochoren" verwijzen naar de plaats waar chromosomen zich tijdens de celdeling met de spindel verbinden. Directe visualisatie van centromeer-kinetochoor-eiwitten tijdens de celcyclus blijft een fundamenteel hulpmiddel bij het onderzoek naar de mechanismen van deze eiwitten. Geavanceerde beeldvormingsmethoden in fluorescentiemicroscopie bieden opmerkelijke resolutie van centromeer-kinetochoor-componenten en maken directe observatie van specifieke moleculaire componenten van de centromeren en kinetochooren mogelijk. Bovendien zijn methoden voor indirecte immunofluorescente (IIF) kleuring met specifieke antilichamen cruciaal voor deze observaties. Echter, ondanks talrijke rapporten over IIF-protocollen, hebben weinigen in detail gediscussieerd over problemen met specifieke centromeer-kinetochoor-eiwitten.1-4 Hier beschrijven we geoptimaliseerde protocollen om endogene centromeer-kinetochoor-eiwitten in menselijke cellen te kleuren door gebruik te maken van paraformaldehyde-fixatie en IIF-kleuring. Verder beschrijven we protocollen om Flag-gelabelde exogene CENP-A-eiwitten in menselijke cellen te detecteren die zijn onderworpen aan aceton- of methanol-fixatie. Deze methoden zijn nuttig voor het detecteren en kwantificeren van endogene centromeer-kinetochoor-eiwitten en Flag-gelabelde CENP-A-eiwitten, inclusief die in menselijke cellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Centromeren" werden klassiek gedefinieerd als gebieden onderdrukt meiotische recombinatie in de genetica en later gezien als het belangrijkste vernauwing van mitotische chromosomen, die een essentiële rol speelt nauwkeurige chromosoomsegregatie in mitose. "Kinetochoren" werden beschreven als het meerlagige structuren die binden aan microtubuli aan het oppervlak centromeren, zoals aangetoond door elektronenmicroscopie; "Kinetochoren" werden later gedefinieerd als macromoleculaire complex localiseert in het centromeer van mitotische chromosomen. Ondanks een dramatisch verschil in centromeer DNA-sequenties bij vertebraten, kinetochoor structuur en samenstelling sterk geconserveerd. Een dynamische interactie tussen spindel microtubuli en het kinetochoor vereist voor trouwe segregatie van chromosomen tijdens de mitose en defecten in centromeer-kinetochoor functie leidt tot aneuploïdie en daardoor kanker.

Het centromeer in de meeste eukaryotengeen gedefinieerde DNA-sequentie, maar is samengesteld uit grote arrays (0,3-5 Mb) repeterende alphoid DNA bestaat uit 171 bp α-satelliet DNA. Behalve in gist, wordt centromeer identiteit bereikt niet de DNA-sequentie, maar door de aanwezigheid van een speciale nucleosomen die de histon H3 variant CenH3 bevat (centromeer eiwit A [CENP-A] bij de mens). 5 CENP-A nucleosomen lokaliseren de binnenste plaat van zoogdier kinetochoren 7 en binden aan de 171-bp α-satelliet DNA. Actieve centromeres vereisen CENP-A-bevattende nucleosomen voor de aanwerving van een constitutieve-centromeer geassocieerd netwerk (CKan) en de kinetochoor eiwitten te leiden, die samen reguleren van de aanhechting van de chromosomen van de mitotische spindel en de daarop volgende cyclus progressie door de spil checkpoint.

In het licht van het bovenstaande bewijs heeft CENP-A voorgesteld om de epigenetische merkteken van het centromeer 8 zijn; echter, het proces waardoor CENP-A opgenomen into centromeer DNA en de factoren die tot deze opname nog niet goed gekarakteriseerd. Een korte-centromeer doeldomein (CATD) ligt in het histon voudige regio CENP-A, en vervanging van het overeenkomstige gebied van H3 de CATD zorgdragen om H3 het centromeer. 9 Verschillende studies suggereerde functionele rol voor post-translationele modificatie (PTM) van CENP-A 12-16; De moleculaire mechanismen van deze PTMs van CENP-A in de rekrutering van centromeren nog niet opgehelderd. We hebben eerder gemeld dat CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase activiteit is vereist voor CENP-A K124 ubiquitinering en lokalisatie van CENP-A naar centromeres. 17

De ontdekking en karakterisering van kinetochore eiwitten hebben geleid tot nieuwe inzichten over chromosoomscheiding. 18 meer dan 100 kinetochoor componenten zijn in gewervelde cellen die door verschillende benaderingen. 19,20 Een onderstaande hoe kinetochoren assembleren en functie komt ook uit het karakteriseren van de cellulaire functies van elke centromeer-kinetochoor eiwitten en eiwit-eiwit netwerk in cellen. 19 Directe visualisatie en geavanceerde imaging werkwijzen fluorescentiemicroscopie bieden opmerkelijke resolutie van centromeer-kinetochore componenten en laat directe observatie van de specifieke moleculaire componenten van de centromeren en kinetochoren. Bovendien, de methoden van indirecte immunofluorescentie (IIF) kleuring met behulp van specifieke antilichamen zijn cruciaal voor deze waarnemingen. Ondanks talrijke rapporten over IIF protocollen weinig besproken problemen specifieke centromeer-kinetochore eiwitten. 1-4 Zo ontwikkelen en rapporteringsmethoden van IIF kleuring en een kwantitatieve bepaling om IIF specifiek wat elke centromeer-kinetochoor eiwit is zeer belangrijk. In IIF kleuring, moet men overgaan tot de kleuringsprotocol verlies van het eiwit van belang voorkomen ofde rest van de cel. Echter, fixatie vernietigt antigene plaatsen af en verschillende antilichaam-antigeen combinaties werken slecht met een fixatief, maar zeer goed met elkaar, en 21 keuze fixeermiddel hangt grotendeels af van de eiwit (ten) van belang. Daarom verschillende fixerende methoden zijn van cruciaal belang in IIF kleuring van centromeer-kinetochoor eiwitten.

Hier geoptimaliseerde werkwijzen voor indirecte immunofluorescentie (IIF) kleuring en een test om lokalisatie van endogeen centromeer-kinetochore eiwitten, waaronder CENP-A en Flag-tagged exogene CENP-A eiwitten en kwantificering van deze eiwitten in menselijke cellen aanpakken ontwikkeld. Deze methoden kunnen worden toegepast op de analyse van centromeer-kinetochore eiwitten in andere species.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cel Cultuur en Transfectie

  1. Zet een deksel glas (22 mm x 22 mm) in een 6-well polystyreen plaat. Eventueel jas een cover glas met Poly-L-lysine, 0,1% w / v, in water (zie lijst van materialen / Equipment) tot mitotische cellen op de cover glas van de volgende stappen te houden:
    Let op: Optimale voorwaarden moeten worden bepaald voor elke cellijn en toepassing.
    1. Aseptisch laag kweekoppervlak met Poly-L-lysine, 0,1% w / v in water (0,4 ml / putje van een 6-well polystyreen platen). Rock zachtjes om zelfs coating van de cultuur oppervlak te garanderen.
    2. Na 5 minuten, verwijder oplossing door aspiratie en grondig afspoelen oppervlak met steriele weefselkweek kwaliteit water.
    3. Droge minstens 2 uur vóór de invoering van de cellen en medium.
  2. Seed HeLa-cellen 17 of HeLa Tet-Off cellen 17,22 op een cover glas (22 mm x 22 mm) in een 6-well polystyreen plaat. Controleer of de cel dichtheid is 5,4 x 10 5 per putje. kweekcellenhoog-glucose DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
    Opmerking: Voor een optimaal resultaat, empirisch bepalen van de celdichtheid om te gebruiken in zaaien.
  3. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 18 uur.
    Opmerking: Bij HeLa Tet-Off cellen, transcriptie van het exogene gen actief in afwezigheid van de inducer (bijv tetracycline / doxycycline) derhalve kweekcellen zonder tetracycline / doxycycline en transfecteren tijdelijk de pTRM4 overexpressie vector (Tabel 2 ), waarvan de transcriptie wordt geregeld door de TRE promoter (zie hieronder).
  4. Achttien uur na het uitzaaien, transfecteren cellen als volgt:
    1. Maak oplossing A door het mengen van 1,5 pl siRNA oligo (20 uM versmolten beelden; Tabel 1) en / of 2,0 ug plasmide (Tabel 2) in 50 pl verlaagde serum medium (zie lijst Materiaal / Equipment) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min .
      Let op: In deze analyse,CA-UTR siRNA (een mengsel van 5 'en 3' UTR siRNA; Tabel 1) werden gecotransfecteerd voor gebruik in protocollen 3 en 4 (zie discussie).
    2. Maak oplossing B door het mengen van 0,75 pl transfectiereagens I (zie lijst Materiaal / Equipment) in 50 pl verminderde serum medium en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
      Opmerking: Een optionele stap is de toevoeging van 1,0 ul transfectiereagens II (zie lijst van materialen / Equipment).
    3. Mix A en B samen, en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
    4. Was de gekweekte cellen eenmaal met PBS en voeg 500 ul gereduceerd serum medium aan elk putje van de 6-well polystyreen platen. Voeg het mengsel van A en B (dat wil zeggen, RNA en / of DNA-lipide-complex) direct naar elk van de afzonderlijke put.
      Opmerking: Final concentratie 3,3 ug / ml (plasmide); 50 Nm (siRNA).
    5. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 4,5 uur. Verander het medium tot high-glucose DMEM with 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
    6. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 48-72 uur na transfectie.
      Opmerking: Voor een optimaal resultaat moet de incubatietijd voor celgroei voordat fixatie empirisch worden bepaald, en eiwit uitputting en / of expressie moet worden bevestigd door Western blot-analyse (zie Protocol 6).
    7. Als mitose analyse plaats, voeg paclitaxel (10 nM) aan gekweekte cellen 24 uur voor fixatie, of de gekweekte cellen 2,5 uur toe TN16 (0,5 uM) voor fixatie.

2. Cell Fixatie en immunofluorescentiekleuring endogeen Centromere-kinetochoor Eiwitten Detect (paraformaldehyde Fixation)

  1. Bereiding van fixatief, buffers en reagentia.
    1. Vers bereid 50 ml 4% paraformaldehyde oplossing in PBS, pH 7,4.
      1. Voeg 40 ml van 1 x PBS om een ​​bekerglas op een roerplaat in een geventileerde afzuigkap. Hitte terwijl Stirring tot ongeveer 60 ° C. Voeg 2 g paraformaldehyde poeder aan het verwarmde PBS.
      2. Langzaam verhogen van de pH door toevoeging van 1 ml 1 N NaOH in totaal, omdat het poeder niet onmiddellijk oplossen.
        Opmerking: De oplossing verdwijnt na toevoeging van NaOH.
      3. Zodra paraformaldehyde is opgelost, cool en filteren van de oplossing.
      4. Stel de pH met 1 N HCl tot pH 7,4 en het volume van de oplossing met 1 x PBS tot 50 ml.
        Opmerking: Monsters van de oplossing kan worden ingevroren of zolang 1 week bewaard bij 2-8 ° C. De oplossing moet ijskoud of bewaard bij 4 ° C totdat het wordt gebruikt.
    2. Bereid 50 ml buffer KB1, bestaande uit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,5% BSA; en 0,5% Triton X-100.
      Opmerking: BSA moet vers worden toegevoegd.
      Opmerking: De buffer KB-serie zijn gebaseerd op de buffer KB in eerdere rapporten beschreven 1,2,4.
    3. Bereid 50 ml buffer KB2, bestaande uit 10 mM Tris-HCl,pH 7,5; 150 mM NaCl; en 0,5% BSA.
      Opmerking: BSA moet vers worden toegevoegd.
    4. Bereid 1 ml buffer bevattende KB3 DAPI (50 ng / ml).
    5. Bereid 100 ml fixeermiddel, bestaande uit 1 mg / ml p-fenyleendiamine; 10% PBS, en 90% glycerol.
      1. Stel de pH van 1 x PBS tot 9,8 met 1 N NaOH, oplossen p-fenyleendiamine in de oplossing en voeg glycerol.
      2. WINKEL 1 ml porties bij -80 ° C. Beschermen tegen licht.
  2. Verwijder het kweekmedium door afzuiging op 48-72 uur na transfectie (zie Protocol 1) voor mobiele fixatie. Spoel de cellen eenmaal met PBS. Toepassen PBS aan de zijkant van de kweekputjes voorkomen het oppervlak van de cellen te verstoren.
    Opmerking: De optimale tijd voor cel fixatie moet empirisch worden bepaald.
  3. Bevestig de cellen in 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Spoel de cellen tweemaal met buffer KB2 voldoende te verwijderen resterende 4% paraformaldehyde.
  4. PermeabiLize de monsters in buffer KB1 gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de cellen eenmaal met buffer KB2 en voeg buffer KB2 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om extra sites blokkeren van niet-specifieke binding.
    Opmerking: Buffer KB1 ook aanzienlijk bijdraagt ​​aan blokkeren.
  5. Verwijderen van een dekking van glas (22 mm x 22 mm) van een 6-well polystyreen plaat met behulp van een tang. Met behulp van een hydrofobe barrière pen (zie lijst van materialen / Equipment), teken een lichtgroen vierkant of een cirkel om een ​​hydrofobe barrière rond elk deksel glas te vormen. Niet aanraken of te dicht bij de cellen met de hydrofobe barrière pen. Plaats het deksel glas in de nieuwe 6-well polystyreen plaat.
  6. Verdun een primair antilichaam tegen centromeer of kinetochoor eiwit (verdunningsverhouding van 1: 100 tot 1: 200; zie ook Lijst van materialen / apparatuur) en ofwel een anti-CENP-B-antilichaam (verdunningsverhouding van 1: 400) of een anti- centromeer antilichaam (ACA) (verdunningsverhouding van 1: 2000) als een centromeer locatiemarkering in buffer KB2.
    Opmerking: Voor een optimaal resultaat, de laatste Concentratie van het primaire antilichaam in deze oplossing moet empirisch worden bepaald.
  7. Breng een voldoende (ongeveer 30 ui) van de verdunde primaire antilichaam aan het celmonster dompelen. Incubeer het celmonster gedurende 1 uur bij 37 ° C. Spoel de cellen 3 maal met buffer KB2.
  8. Met bufferoplossingen KB2, verdun een fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam (verdunningsverhouding van 1: 100 tot 1: 200) tegen elke primaire antilichaam.
    Opmerking: Voor optimale resultaten dient de uiteindelijke concentratie van het tweede antilichaam in deze oplossing empirisch worden bepaald.
  9. Breng een voldoende (een daling van ongeveer 30 ui op de dekglas) van het verdunde secundaire antilichaam aan het celmonster dompelen. Incubeer het celmonster gedurende 1 uur bij 37 ° C. Spoel de cellen 5 maal met buffer KB2 gedurende een periode van 30 min (6 min vijf wasbeurten).
    Opmerking: Voor optimale resultaten (dwz voor minimaal verlies van cellen), moet de optimale conditie wassen bepaald empirically.
  10. Breng een voldoende hoeveelheid buffer KB3 met DAPI (50 ng / ml) aan het celmonster dompelen. Incubeer het celmonster gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de cellen 1-2 keer met buffer KB2.
  11. Monteer de dekking van glas dat de cel monster op de micro dia bevat.
    1. Een druppel van montage medium in het midden van het micro dia.
    2. Verwijdert vloeistof uit het celmonster en gebruik handen of tang, plaatst het monster in het midden van het micro dia. Vermijd luchtbellen.
    3. Verwijder overtollige montage medium met een papieren handdoek.

3. Cel fixatie en immunofluorescentiekleuring van C-terminale Flag-tagged CENP-A eiwitten (Aceton Fixation)

  1. Voorbereiding
    1. Bereid ijskoude 75% aceton.
    2. Vers bereid 50 ml PBS (pH 7,4) met 0,5% magere melk en 0,5% BSA.
    3. Vers bereid 50 ml PBS (pH 7,4) met 0,1% magere melk en 0,1% BSA.
    4. Bereid 1 ml PBS (pH 7,4) met DAPI (50-100 ng / ml).
    5. Bereid 100 ml fixeermiddel zoals beschreven in 2.1.5.
  2. Verwijder het kweekmedium door afzuiging op 48-72 uur na transfectie (zie Protocol 1) voor mobiele fixatie. Spoel de cellen eenmaal met PBS. Toepassen PBS aan de zijkant van de kweek om te vermijden het oppervlak van de cellen te verstoren.
    Opmerking: De optimale tijd voor cel fixatie moet empirisch worden bepaald.
  3. Fixeer de cellen in ijskoude 75% aceton, en incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij -20 ° C. Droge cellen op de cover glas in een zuurkast gedurende 30-60 min bij RT.
    Opmerking: Voor een optimaal resultaat moet de tijd die nodig is voor fixatie en drogen cel empirisch worden bepaald.
  4. Met behulp van de hydrofobe barrière pen (zie lijst van materialen / Equipment), teken een lichtgroen vierkant of een cirkel om een ​​hydrofobe barrière rond elk deksel glas te vormen. Niet aanraken of te dicht bij de cellen met de hydrofobe barrière pen.
  5. Block nonspecific bindingsplaatsen op de cellen door toevoeging van PBS dat 0,5% magere melk en 0,5% BSA gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Gebruik PBS bevattende 0,1% magere melk en 0,1% BSA verdund anti-Flag-antilichaam (1: 1000 verdunning ratio) en ofwel een anti-CENP-B-antilichaam (verdunningsverhouding van 1: 200) of ACA (1: 2000 verdunningsverhouding ) als een centromeer locatie marker.
    Opmerking: Voor optimale resultaten dient de uiteindelijke concentratie van het primaire antilichaam in deze oplossing empirisch worden bepaald.
  7. Breng een voldoende (ongeveer 30 ui) van de verdunde primaire antilichaam aan het celmonster dompelen. Incubeer het celmonster gedurende 1 uur bij 37 ° C. Spoel de cellen 5 maal met blokkerende buffer gedurende 30 min.
    Opmerking: De cellen kunnen worden gespoeld met PBS. Voor optimale resultaten (dat wil zeggen het verlies van cellen te voorkomen), moet de optimale wasomstandigheden empirisch worden bepaald.
  8. Verdun een fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam (verdunningsverhouding van 1: 100 tot 1: 200) tegende elk primair antilichaam in PBS met 0,1% magere melk en 0,1% BSA.
    Opmerking: Voor optimale resultaten dient de uiteindelijke concentratie van het tweede antilichaam in deze oplossing empirisch worden bepaald.
  9. Breng een voldoende (ongeveer 30 ui) van de verdunde secundaire antilichaam aan het celmonster dompelen. Incubeer het celmonster gedurende 1 uur bij 37 ° C. Spoel de cellen 2 maal met PBS bevattende 0,1% magere melk en 0,1% BSA.
    Opmerking: PBS alleen kan ook worden gebruikt om de cellen te wassen.
  10. Breng een voldoende volume van PBS dat DAPI (50-100 ng / ml) aan het celmonster dompelen. Incubeer het celmonster gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de cellen 1-2 keer met PBS.
  11. Monteer het deksel glas met de cel monster op de micro dia zoals beschreven in 2.11.

4. Cell Fixatie en immunofluorescentiekleuring van N-terminale Flag-tagged CENP-A eiwitten (Methanol Fixation)

  1. Voorbereiding
    1. Bereid ijskoude methanol.
    2. Bereid TBS (pH 7,4) bevattende 4% geit serum.
    3. Bereid 1 ml TBS (pH 7,4) met DAPI (50-100 ng / ml).
    4. Bereid 100 ml fixeermiddel zoals beschreven in 2.1.5.
  2. Verwijder het kweekmedium door afzuiging op 48-72 uur na transfectie (zie Protocol 1) voor mobiele fixatie. Spoel de cellen eenmaal met TBS. Toepassen TBS aan de zijkant van de kweekputjes voorkomen het oppervlak van cellen te verstoren.
    Opmerking: De optimale tijd voor cel fixatie moet empirisch worden bepaald.
  3. Fixeer de cellen in ijskoude methanol en incubeer de cellen gedurende 6 min bij -20 ° C. Spoel de cellen tweemaal met TBS voldoende te verwijderen resterende methanol.
  4. Met behulp van een hydrofobe barrière pen (zie lijst van materialen / Equipment), teken een lichtgroen vierkant of een cirkel om een ​​hydrofobe barrière rond elk deksel glas monster te creëren. Niet aanraken of te dicht bij de cellen met de hydrofobe barrière pen.
  5. Blok-specifieke bindingsplaatsen op de cells door toevoeging TBS bevattende 4% geit serum. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Verdun een anti-Flag-antilichaam (1: 1000 verdunning) en ofwel een anti-CENP-B-antilichaam (verdunningsverhouding van 1: 200) of ACA (1: 2000 verdunningsverhouding) als een centromeer locatiemarkering in TBS bevattende 4% geitenserum .
    Opmerking: Voor optimale resultaten dient de uiteindelijke concentratie van het primaire antilichaam in deze oplossing empirisch worden bepaald.
  7. Breng een voldoende (ongeveer 30 ui) van de verdunde primaire antilichaam aan het celmonster dompelen. Incubeer het celmonster gedurende 1 uur bij 37 ° C. Spoel de cellen 5 maal met blokkerende buffer gedurende 30 min. Voor optimale resultaten (dat wil zeggen de minimaal verlies van cellen), moet de optimale conditie wassen empirisch worden bepaald.
  8. Verdun een fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam (verdunningsverhouding van 1: 100 tot 1: 200) gericht tegen elk primair antilichaam in TBS bevattende 4% geit serum.
    Opmerking: Voor een optimaal resultaat, de final concentratie van het tweede antilichaam in deze oplossing moet empirisch worden bepaald.
  9. Breng een voldoende (ongeveer 30 ui) van de verdunde secundaire antilichaam aan het celmonster dompelen. Incubeer het celmonster gedurende 1 uur bij 37 ° C. Spoel de cellen 3 maal met de blokkerende buffer.
  10. Breng een voldoende hoeveelheid TBS dat DAPI (50-100 ng / ml) aan het celmonster dompelen. Incubeer het celmonster gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de cellen 1-2 keer met TBS.
  11. Monteer de dekking van glas dat de cel monster op de micro dia bevat, zoals beschreven in 2.11.

5. Immunofluorescentie Afbeelding Observation, Acquisition, Kwantificering en analyse

  1. Houd u aan de cel monster door een gemotoriseerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 63x en 100x olie-immersie lens, een externe compacte lichtbron, en een digitale CCD-camera.
  2. Voer het capturen en verwerken, met inbegrip van deconvolutie, met behulp van SoftwareEen of Softwares B1 en B2 (zie lijst van materialen / Equipment). Zie Aanvullende Code Files (5.2.1) voor alle opdrachten die in Software A. Voor alle opdrachten die in Softwares B1 en B2, zie (5.2.2) in de Aanvullende Code Files.
  3. Een eerder beschreven werkwijze 23-25 ​​signalen van centromeer-kinetochoor eiwitten te kwantificeren (bijv resterende signalen CENP-A aan het centromeer) met de volgende kleine wijzigingen:
    1. Selectiegebied van de centromeer-kinetochore eiwitten en dat van de achtergrond als volgt:
      1. Mitotische cel: (centromeer-kinetochoor regio) Kies een gebied overlapt chromosomen gekleurd met DAPI; (achtergrond regio) en gebied buiten chromosomen maar binnen de identieke enkele cel (dat wil zeggen, cytosolische regio).
      2. Interphase cel: (centromeer-kinetochoor regio) Kies een gebied overlapt chromatine gekleurd met DAPI; (Achtergrond regio) en gebied buiten chromatine maar binnen de identieke enkele cel ( dwz cytosolische regio).
        Opmerking: zie ook Aanvullende Code Files (5.2.1.4.3) of (5.2.2.6.4) voor het gebied selectie met Software A of Software B2, respectievelijk.
    2. Kwantificeren van het percentage van de resterende signalen aan de centromeren met Software A of B. Voor deze taak, gebruikt u de volgende formule:
      Resterende signalen centromeer-kinetochoor eiwit op het centromeer-kinetochoor
      figure-protocol-1
      waarin s het helderheidssignaal van het geselecteerde gebied, hetgeen wordt bevestigd door ACA of CENP-B kleuring, b de helderheid achtergrondsignaal; r monster de referentie-ACA of CENP B-signalen voor siRNA (s) behandelde cellen; en r ctrl is de referentie ACA of CENP-B signalen voor Luc siRNA-getransfecteerde cellen.
      Opmerking: In deze analyse werden CENP-B-signalen als referentiesignalen voor CUL4A en RBX1 zoals in eerdere rapporten. 17
      1. Gebruik een Excel-bestand voor deze berekening na het kopiëren en plakken van de ruwe data uit het signaal kwantificering software zoals hierboven beschreven. Zie ook Aanvullende Code Files: (5.2.1.4) en (5.2.2.6) voor details. Een voorbeeld van de berekening is weergegeven in tabel 3.
    3. Analyseer ten minste 20 cellen om variatie in kleuring en beeld aanwinst voor elke meting niveau te elimineren. Eventueel gebruik "gemiddelde waarde" resterende centromeer-kinetochoor signalen voor elke geanalyseerde cel om deze waarden te vergelijken tussen verschillende centromeer-kinetochore eiwitten.

6. Western blot analyse van totaal eiwit

  1. Resuspendeer de cellen in denaturerende buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40, 0,5% deoxycholaat, 0,5% SDS, 1 mM EDTA en volledig EDTA-vrije proteaseremmer cocktail), 26 onder de schorsing van een sonicatie en vries-dooi-proces, en meteneiwitconcentraties als volgt:
    1. Voor de ultrasoonapparaat proces, voeg 50 ul van buffer A om de verzamelde twee putjes van een 6-well polystyreen plaat bij 48-72 uur na transfectie cellen (zie Protocol 1). Exploiteren van een ultrasoonapparaat voorzien verstoorder hoorn en micropunt (zie lijst van materialen / apparatuur) voor in totaal 15 sec intermitterende-pulsduur (duty cycle 50%) per één monster.
    2. Voor bevriezen en ontdooien proces bevriezen cellen met vloeibare stikstof en ontdooien cellen bij kamertemperatuur.
    3. Meet eiwitconcentraties met behulp van een commercieel proteïne testreagens I of II (zie lijst van materialen / Equipment).
      Noot: Lysaten worden verdund met een verhouding van 01:10 in de meting van eiwitconcentraties met hetzij reagens I of II. Bij deze verdunning, de SDS aanwezig in buffer A weinig of geen interferentie in deze meting.
  2. Meng het lysaat met 20-30 ug totaal eiwit met 2 x of 4 x SDS-PAGE laadbuffer. 27 Kook de monsters5 min en plaats ze op een 12,0% -15,0% denaturerende SDS-polyacrylamidegel voor elektroforese.
  3. Breng de eiwitten gescheiden door SDS-PAGE op een PVDF membraan door Western blotting onder toepassing van een eerder beschreven werkwijze. 17,24,27-31
    1. Blokkeert de niet-specifieke bindingsplaatsen op het membraan met 5% vetvrije melk in 1 x PBS, en vervolgens incuberen van de membraan met oplossingen van verdunde primaire antilichamen gedurende 1 uur bij KT. Zie lijst van materialen / Apparatuur voor gedetailleerde informatie (bv verdunning ratio) van elke primaire antilichaam.
    2. Na wassen van het membraan 3-4 maal (elke 3 tot 5 minuten incubatie met schudden) met PBS-T buffer (1 x PBS en 0,1% Tween-20), incubeer het membraan in een mengsel van nabij-infrarood (IR) fluorescerende kleurstof-geconjugeerde secundaire antilichamen (verdunningsverhouding van 1: 20.000), DyLight-geconjugeerde secundaire antilichamen (verdunningsverhouding van 1: 20.000) en / of mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerde secundaire antilichamen (verdund in PBS-T; dilutibetreffende verhouding van 1: 10.000) gedurende 1 uur bij KT. Zie lijst van materialen / Apparatuur voor gedetailleerde informatie (bv verdunning ratio) van elke secundaire antilichaam.
  4. Was het membraan 3 maal, en vervolgens scant het membraan naar de eiwitten met de infrarood-imaging systeem en / of de chemiluminescentie imager voor immunoblot detectie te analyseren (zie lijst van materialen / Equipment).
    1. Voor het gebruik van de infrarood-imaging systeem, zie (6.4.1) in de Aanvullende Code Files.
    2. Voor het gebruik van de chemiluminescentie imager, zie (6.4.2) in de Aanvullende Code Files. Gebruik een ultragevoelige verbeterde chemiluminescentie (ECL) substraat (zie lijst van materialen / apparatuur) voor dit systeem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunofluorescentie analyse van endogene CENP-A ondersteunt de hypothese dat CUL4A-E3 ligase nodig voor het lokaliseren van CENP-A centromeren
Onze recente studies is gebleken dat CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase activiteit is vereist voor ubiquitinering van lysine 124 (K124) op CENP-A en lokalisatie van CENP-A centromeren. 17 Aanvankelijk interfase-centromeer complex (Icen) werd geïsoleerd door anti-CENP-a: natieve chromatine immunoprecipitatie, 32-34

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De laatste jaren zijn veel studies verschillende kwantitatieve microscopie assays ontwikkeld voor gefixeerde cellen. 42 Progress in centromeer-kinetochoor biologie vereist vaak een begrip van de centromeer-specifieke of kinetochoor specifieke functie van eiwitten waarvan subcellulaire ruimtelijk-temporele regulering weerspiegelt de veranderende functies deze eiwitten tijdens celcyclus. Daarom hier ontwikkelden wij werkwijzen IIF kleuring en een kwantitatieve bepaling om IIF specifiek wat de relatieve niveaus ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie ​​GM68418.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Lipofectamin 2000Life Technologies/Invitrogen11668transfectiereagens I
Lipofectamin RNAiMAXLife Technologies/Invitrogen13778transfectiereagens II
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985Gereduceerd serum medium, opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)Life Technologies/BioWhittaker12-604high-glucose DMEM, opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US originLife Technologies/Gibco10082FBS (fetaal bovien serum)
Poly-L-Lysine SOLUTIONSIGMA-SLDRICHP 8920Poly-L-Lysine, 0,1% w/v, in water
UltraPure Distilled WaterLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977Steriele weefselkweekkwaliteit water 
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) Surgipath105Dekglas (22 mm x 22 mm) 
6 Well Cell Culture ClusterFisher/Corning Incorporated07-200-836-well polystyreen plaat 
Penicillin, Streptomycin; LiquidFisher/Gibco15-140Penicilline-streptomycine
PAP PEN Binding SiteAD100.1Hydrofobe barrière pen (voor een waterafstotende barrière in immunofluorescente kleuring)
Paclitaxel (Taxol)SIGMA-SLDRICHT7402Taxol voor mitotische celanalyse
TN-16, microtubule inhibitor (TN16)Enzo Life SciencesBML-T120TN16 voor mitotische celanalyse
BSA (bovine serum albumin)SIGMA-SLDRICHA7906Blokkader
Triton X-100SIGMA-SLDRICHT8787Detergens voor permeabilisatie
ParaformaldehydeSIGMA-SLDRICHP6148Fixatiereagens
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Voor nucleaire kleuring
p-phenylenediamineSIGMA-SLDRICHP6001Voor montagemedium
VWR Micro Slides, FrostedVWR International48312-013Micro slides 
Anti-CENP-A antibodyStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Muis monoklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CENP-B antibodyNovus BiologicalsH00001059-B01PMuis monoklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:200 (IIF, methanol/aceton fixatie)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixatie)
Anti-CENP-B antibody abcamab25734Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:200 (IIF, methanol/aceton fixatie)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixatie)
Anti-centromere antibody (ACA)Fitzgerald Industries International, Inc.90C-CS1058Menselijke centromeer antiserum; verdunningsverhouding van 1:2000 (IIF)
Anti-CENP-H antibodyBethyl LaboratoriesBL1112 (A400-007A)Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:200 (IIF)
Anti-CENP-H antibodyBD612142Muis monoklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:200 (IIF)
Anti-CENP-I antibodyN/A, Dr. Katusmi KitagawaN/A, Dr. Katusmi KitagawaKonijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)
Anti-KNL1 antibodyNovus BiologicalsNBP1-89223Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 antibodyNovus Biologicals / GeneTexNB 100-338 / GTX70268Muis monoklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 antibodyGeneTexGTX110735Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:100 (IIF)
Anti-Ska1 antibodyabcamab46826Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:100 (IIF)
Anti-Flag antibodySIGMA-ALDRICHF3165Muis monoklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-Flag antibodySIGMA-ALDRICHF7425Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CUL4A antibodyN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriKonijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)
Anti-RBX1 antibodyCell Signaling4397Konijn polyklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:2000 (WB)
Anti-GAPDH antibodyChemiconMAB374Muis monoklonaal antilichaam; verdunningsverhouding van 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11001fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam (Affiniteit-gezuiverd secundair antilichaam)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11005fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam (Affiniteit-gezuiverd secundair antilichaam)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies/InvitrogenA11008fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeLuca, J. G., et al. Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Molecular biology of the cell. 16, 519-531 (2005).
  2. Earnshaw, W. C., Halligan, N., Cooke, C., Rothfield, N. The kinetochore is part of the metaphase chromosome scaffold. J Cell Biol. 98, 352-357 (1984).
  3. Hoffman, D. B., Pearson, C. G., Yen, T. J., Howell, B. J., Salmon, E. D. Microtubule-dependent changes in assembly of microtubule motor proteins and mitotic spindle checkpoint proteins at PtK1 kinetochores. Molecular biology of the cell. 12, 1995-2009 (2001).
  4. Regnier, V., et al. CENP-A is required for accurate chromosome segregation and sustained kinetochore association of BubR1. Mol Cell Biol. 25, 3967-3981 (2005).
  5. Bernad, R., Sanchez, P., Losada, A. Epigenetic specification of centromeres by CENP-A. Exp Cell Res. 315, 3233-3241 (2009).
  6. Black, B. E., Cleveland, D. W. Epigenetic centromere propagation and the nature of CENP-a nucleosomes. Cell. 144, 471-479 (2011).
  7. Warburton, P. E., et al. Immunolocalization of CENP-A suggests a distinct nucleosome structure at the inner kinetochore plate of active centromeres. Curr Biol. 7, 901-904 (1997).
  8. Karpen, G. H., Allshire, R. C. The case for epigenetic effects on centromere identity and function. Trends Genet. 13, 489-496 (1997).
  9. Black, B. E., et al. Structural determinants for generating centromeric chromatin. Nature. 430, 578-582 (2004).
  10. Black, B. E., et al. Centromere identity maintained by nucleosomes assembled with histone H3 containing the CENP-A targeting domain. Mol Cell. 25, 309-322 (2007).
  11. Fachinetti, D., et al. A two-step mechanism for epigenetic specification of centromere identity and function. Nat Cell Biol. 15, 1056-1066 (2013).
  12. Zeitlin, S. G., Shelby, R. D., Sullivan, K. F. CENP-A is phosphorylated by Aurora B kinase and plays an unexpected role in completion of cytokinesis. The Journal of cell biology. 155, 1147-1157 (2001).
  13. Zhang, X., Li, X., Marshall, J. B., Zhong, C. X., Dawe, R. K. Phosphoserines on maize CENTROMERIC HISTONE H3 and histone H3 demarcate the centromere and pericentromere during chromosome segregation. The Plant cell. 17, 572-583 (2005).
  14. Goutte-Gattat, D., et al. Phosphorylation of the CENP-A amino-terminus in mitotic centromeric chromatin is required for kinetochore function. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8579-8584 (2013).
  15. Bailey, A. O., et al. Posttranslational modification of CENP-A influences the conformation of centromeric chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 11827-11832 (2013).
  16. Samel, A., Cuomo, A., Bonaldi, T., Ehrenhofer-Murray, A. E. Methylation of CenH3 arginine 37 regulates kinetochore integrity and chromosome segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9029-9034 (2012).
  17. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Dev Cell. , (2015).
  18. Chan, G. K., Liu, S. T., Yen, T. J. Kinetochore structure and function. Trends in cell biology. 15, 589-598 (2005).
  19. Hori, T., Okada, M., Maenaka, K., Fukagawa, T. CENP-O class proteins form a stable complex and are required for proper kinetochore function. Molecular biology of the cell. 19, 843-854 (2008).
  20. Fukagawa, T., Earnshaw, W. C. The centromere: chromatin foundation for the kinetochore machinery. Developmental cell. 30, 496-508 (2014).
  21. Kedersha, N. The Proteintech Blog.Proteintech. Grainger, D. , Proteintech Group. (2012).
  22. Clontech Laboratories, Inc. HeLa Tet-Off Advanced Cell Line. , Available from: http://www.clontech.com/CR/Products/Inducible_Systems/Tetracycline-Inducible_Expression/ibcGetAttachment.jsp?cItemId=26908&fileId=6712191&sitex=10020:22372:US (2012).
  23. Meraldi, P., Sorger, P. K. A dual role for Bub1 in the spindle checkpoint and chromosome congression. EMBO J. 24, 1621-1633 (2005).
  24. Niikura, Y., et al. 17-AAG, an Hsp90 inhibitor, causes kinetochore defects: a novel mechanism by which 17-AAG inhibits cell proliferation. Oncogene. 25, 4133-4146 (2006).
  25. Yang, Z., et al. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25, 4062-4074 (2005).
  26. Wang, H., et al. Histone H3 and H4 ubiquitylation by the CUL4-DDB-ROC1 ubiquitin ligase facilitates cellular response to DNA damage. Mol Cell. 22, 383-394 (2006).
  27. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR? Trends Biochem Sci. 20, 257-259 (1995).
  28. Kitagawa, K., Skowyra, D., Elledge, S. J., Harper, J. W., Hieter, P. SGT1 encodes an essential component of the yeast kinetochore assembly pathway and a novel subunit of the SCF ubiquitin ligase complex. Mol Cell. 4, 21-33 (1999).
  29. Niikura, Y., Dixit, A., Scott, R., Perkins, G., Kitagawa, K. BUB1 mediation of caspase-independent mitotic death determines cell fate. J Cell Biol. 178, 283-296 (2007).
  30. Niikura, Y., Kitagawa, K. Identification of a novel splice variant: human SGT1B (SUGT1B). DNA Seq. 14, 436-441 (2003).
  31. Niikura, Y., Ogi, H., Kikuchi, K., Kitagawa, K. BUB3 that dissociates from BUB1 activates caspase-independent mitotic death (CIMD). Cell Death Differ. 17, 1011-1024 (2010).
  32. Ando, S., Yang, H., Nozaki, N., Okazaki, T., Yoda, K. CENP-A, -B, and -C chromatin complex that contains the I-type alpha-satellite array constitutes the prekinetochore in HeLa cells. Mol Cell Biol. 22, 2229-2241 (2002).
  33. Izuta, H., et al. Comprehensive analysis of the ICEN (Interphase Centromere Complex) components enriched in the CENP-A chromatin of human cells. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 11, 673-684 (2006).
  34. Obuse, C., et al. Proteomics analysis of the centromere complex from HeLa interphase cells: UV-damaged DNA binding protein 1 (DDB-1) is a component of the CEN-complex, while BMI-1 is transiently co-localized with the centromeric region in interphase. Genes Cells. 9, 105-120 (2004).
  35. Merlet, J., Burger, J., Gomes, J. E., Pintard, L. Regulation of cullin-RING E3 ubiquitin-ligases by neddylation and dimerization. Cell Mol Life Sci. 66, 1924-1938 (2009).
  36. Bennett, E. J., Rush, J., Gygi, S. P., Harper, J. W. Dynamics of cullin-RING ubiquitin ligase network revealed by systematic quantitative proteomics. Cell. 143, 951-965 (2010).
  37. Antonelli, A., et al. Efficient inhibition of macrophage TNF-alpha production upon targeted delivery of K48R ubiquitin. Br J Haematol. 104, 475-481 (1999).
  38. Codomo, C. A., Furuyama, T., Henikoff, S. CENP-A octamers do not confer a reduction in nucleosome height by AFM. Nat Struct Mol Biol. 21, 4-5 (2014).
  39. Thrower, J. S., Hoffman, L., Rechsteiner, M., Pickart, C. M. Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal. The EMBO journal. 19, 94-102 (2000).
  40. Yoda, K., et al. Human centromere protein A (CENP-A) can replace histone H3 in nucleosome reconstitution in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 7266-7271 (2000).
  41. Shelby, R. D., Vafa, O., Sullivan, K. F. Assembly of CENP-A into centromeric chromatin requires a cooperative array of nucleosomal DNA contact sites. J Cell Biol. 136, 501-513 (1997).
  42. Majumder, S., Fisk, H. A. Quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes. J Vis Exp. , (2014).
  43. Masumoto, H., Masukata, H., Muro, Y., Nozaki, N., Okazaki, T. A human centromere antigen (CENP-B) interacts with a short specific sequence in alphoid DNA, a human centromeric satellite. J Cell Biol. 109, 1963-1973 (1989).
  44. Yoda, K., Kitagawa, K., Masumoto, H., Muro, Y., Okazaki, T. A human centromere protein, CENP-B, has a DNA binding domain containing four potential alpha helices at the NH2 terminus, which is separable from dimerizing activity. J Cell Biol. 119, 1413-1427 (1992).
  45. Sugata, N., et al. Human CENP-H multimers colocalize with CENP-A and CENP-C at active centromere--kinetochore complexes. Hum Mol Genet. 9, 2919-2926 (2000).
  46. Earnshaw, W. C., Ratrie, H. 3rd, Stetten, G. Visualization of centromere proteins CENP-B and CENP-C on a stable dicentric chromosome in cytological spreads. Chromosoma. 98, 1-12 (1989).
  47. Goshima, G., Kiyomitsu, T., Yoda, K., Yanagida, M. Human centromere chromatin protein hMis12, essential for equal segregation, is independent of CENP-A loading pathway. J Cell Biol. 160, 25-39 (2003).
  48. Liu, S. T., Rattner, J. B., Jablonski, S. A., Yen, T. J. Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells. J Cell Biol. 175, 41-53 (2006).
  49. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. T time for point centromeres. Nat Cell Biol. 14, 559-561 (2012).
  50. Gascoigne, K. E., et al. Induced ectopic kinetochore assembly bypasses the requirement for CENP-A nucleosomes. Cell. 145, 410-422 (2011).
  51. Nishino, T., et al. CENP-T provides a structural platform for outer kinetochore assembly. EMBO J. 32, 424-436 (2013).
  52. Malvezzi, F., et al. A structural basis for kinetochore recruitment of the Ndc80 complex via two distinct centromere receptors. EMBO J. 32, 409-423 (2013).
  53. Schleiffer, A., et al. CENP-T proteins are conserved centromere receptors of the Ndc80 complex. Nat Cell Biol. 14, 604-613 (2012).
  54. Rago, F., Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Distinct organization and regulation of the outer kinetochore KMN network downstream of CENP-C and CENP-T. Curr Biol. 25, 671-677 (2015).
  55. Nishino, T., et al. CENP-T-W-S-X forms a unique centromeric chromatin structure with a histone-like fold. Cell. 148, 487-501 (2012).
  56. Bodor, D. L., et al. The quantitative architecture of centromeric chromatin. Elife. 3, e02137(2014).
  57. Oliver, C. Ch 58. Molecular Biomethods Handbook. Rapely, R., Walker, J. M. , Humana Press. 1063-1079 (2008).
  58. Terasima, T., Tolmach, L. J. Changes in x-ray sensitivity of HeLa cells during the division cycle. Nature. 190, 1210-1211 (1961).
  59. Levenson, G. B. R. Ch 8. Biomedical Photonics Handbook. Vo-Dinh, T. uan , CRC Press LLC. 8-19 (2003).
  60. Sanderson, J. Fluorescence bleed-though. , Available from: http://www.gum2012.fionastoreydesign.co.uk/Downloads/Bleed through text.pdf (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Immunofluorescence AnalysisCentromere Kinetochore ProteinsEndogenous Exogenous ProteinsParaformaldehyde FixationFlag tagged CENP AHuman Cell CultureIndirect Immunofluorescence StainingFluorescence MicroscopyProtein Localization QuantificationCell Fixation Protocol

Gerelateerde artikelen