Normen voor Quantitative Metalloproteomic analyse met behulp van Size Exclusion ICP-MS

Samenvatting

Grootte-exclusiechromatografie gekoppeld aan inductief gekoppelde plasma - massaspectrometrie (ICP-MS) is een krachtig hulpmiddel om veranderingen in de abundantie van metalloproteïnen direct uit biologische monsters te meten. Hier beschrijven we een reeks metalloproteïne-standaarden die worden gebruikt om de moleculaire massa en de hoeveelheid metaal geassocieerd met onbekende eiwitten te schatten.

Samenvatting

Metalen zijn essentieel voor eiwitfunctie als cofactoren om chemische reacties te katalyseren. Verstoring van de metaalhaomeostase wordt in verband gebracht met een aantal ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer en Parkinson, maar de exacte rol die deze metalen spelen, moet nog volledig worden opgehelderd. Identificatie van metalloproteïnen stuit op veel uitdagingen en moeilijkheden. Hier beschrijven we een benadering die het mogelijk maakt om metalloproteïnen in complexe monsters te kwantificeren. Dit wordt bereikt met behulp van grootte-exclusiechromatografie gekoppeld aan inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie (SEC-ICP-MS). Met behulp van zes bekende metalloproteïnen kan de grootte-exclusiekolom worden gekalibreerd en kunnen de respectieve sporenelementen (ijzer, koper, zink, kobalt, jodium) worden gebruikt voor kwantificering. SEC-ICP-MS-sporen van menselijk hersenweefsel en plasma worden gepresenteerd. Het gebruik van deze metalloproteïnestandaarden biedt de mogelijkheid om de abundantie van metalloproteïnen kwantitatief te vergelijken tussen biologische monsters. Deze techniek staat klaar om licht te werpen op de rol van metalloproteïnen bij neurodegeneratieve ziekten, evenals andere ziekten waarbij onevenwichtigheden in sporenelementen worden geïmpliceerd.

Inleiding

Essentiële metalen spelen een cruciale rol in de normale biologische functies, inclusief de secundaire messenger pathways, metabolisme paden en organel functies. 30% van alle proteïnen worden verondersteld om metalloproteïnen ¹ en 50% van alle enzymen ² zijn. Metallo gebruik maken van deze trace metalen als co-factoren om chemische reacties te katalyseren, stabiliseren eiwitstructuur en voor wettelijke taken zoals secundaire boodschappers. Enkele van de meest bestudeerde spoorelementen met betrekking tot neurodegeneratie zijn koper, ijzer en zink ^3. Ze zijn gedacht te worden betrokken bij veel ziekte trajecten waar de door dyshomeostasis kan nadelige invloed. Bijvoorbeeld metalen status van superoxide dismutase (SOD) rechtstreeks invloed op de levensduur en fenotype van de transgene muizenmodellen van familiale vorm van amyotrofische laterale sclerose (ALS) ^4. Bij de ziekte van Alzheimer, zijn metalloproteomics technieken gebruikt om een ​​afname van het metaal status van transferrine in p ontdekkenLasma ^5. Deze studies wijzen op de belangrijke rol metalloproteïnen kunnen spelen bij de ziekte.

De studie van metalloproteïnen rechtstreeks van biologische weefsels is een ontwikkelende gebied. Hoewel sommige metallo zijn gekarakteriseerd, de meerderheid nog steeds gekarakteriseerde of onbekende ^6. Een van de belangrijkste problemen bij het ​​meten metalloproteïnen de verplichting om de natuurlijke toestand van het eiwit ⁷ handhaven. Klassieke bottom-up proteomische technieken vertrouwen op de vertering van de eiwitten in peptiden. Dit proces verstoort de niet-covalente interactie van metalen en eiwitten. Derhalve wordt geen informatie over de status van een metaal eiwit gewonnen.

Een manier om dit probleem te overwinnen is door gelpermeatiechromatografie gekoppeld met inductief gekoppeld plasma - massaspectrometrie ^8,9 (SEC-ICP-MS). Dit levert informatie over geschatte grootte van het eiwit alsmede eventuele metalen die associated ermee ^10. Verder grootte uitsluiting een zachte chromatografische techniek die de natieve toestand van een enzym of eiwit-eiwitcomplex kan bewaren. Een voordeel van inductief gekoppelde plasma - massaspectrometrie (ICP-MS) is de kwantitatieve aard van de technologie. Met behulp van een set van metalloproteïnen normen is het mogelijk om absolute kwantificering van metalloproteïnen bieden tegen biologische monsters ^9,11. Dit wordt bereikt door het genereren van een standaardcurve van bekende injecteren metalloproteïnen over een bereik van metaalconcentraties.

Dit protocol toont een voorbeeld van hoe dit kan worden bereikt voor verschillende metalloproteïne normen. In dit artikel willen we standaard curves voor metalen die grotendeels onderzocht biologisch gebied waaronder ijzer (Fe), koper (Cu), zink (Zn), jood (I) en kobalt (Co) maken.

Protocol

1. Bereiding van Buffers en voorbeelden

1. Bereid 500 ml buffer, 200 mM ammoniumnitraat pH 7,6-7,8 (pH ingesteld met ammoniumhydroxide _(NH4OH)) met cesium (Cs) en antimoon (Sb) toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 10 ppb. Gebruik cesium en antinomy als interne standaarden om te letten op drift in de reactie van ICP-MS. Filter buffer vóór gebruik door een 0,22 urn filter.
2. Bereid monster afhankelijk van het type monster: vloeistof, weefsel- of celkweek.
   1. Voor monsters die homogenisatie (bijvoorbeeld weefsel of cellen) nodig, zodat zij geen detergens bevat. Gebruik Tris buffers voor de monstervoorbereiding. U kunt ook gebruik maken van fosfaat buffers, maar ze kan een negatieve invloed hebben op de metalloproteome na verloop van tijd of met vries dooi cycli ^12.
   2. Homogeniseren weefsel of celkweek monsters handmatig dounce of sonicatie gedurende 5 min met behulp van Tris gebufferde zoutoplossing (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM natriumchloride(NaCl) + ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) gratis proteaseremmers).
   3. Verduidelijken homogenaten door centrifugatie bij 16.000 xg gedurende 5 minuten. Verzamel de resulterende supernatant. Houd monsters bij 4 ° C.
      Opmerking: Alle monsters worden gecentrifugeerd voorafgaand aan het laden in de hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) flacons dat deeltjes zal gaan blokkeren de kolom grootte-uitsluitingschromatografie (SEC).
3. Normaliseren van de totale hoeveelheid eiwit geladen op de kolom over de monsters. Eiwitconcentraties bepaald bij 280 nm met een UV spectrofotometer microvolume ^13. Belasting tussen 20 en 150 ug eiwit. Met typische injectievolumes variërend 2-80 gl afhankelijk van de monsterconcentratie.
   1. Maak de steekproef arm van de micro volume UV spectrofotometer met gedestilleerd water voordat monster laden. Het monster arm is wanneer het eiwit monsters worden geladen.
   2. Blanco het instrument tegen 2 pl the sample buffer. Laad dan 2 gl van elk monster op de arm en meet de absorptie bij 280 nm.
   3. Wordt de concentratie. Voor ruw eiwit monsters, maken gebruik van een extinctiecoëfficiënt van 1 Abs = 1 mg / ml. Om de concentratie van eiwit in de monsters te bepalen, gebruikt de Beer-Lambert wet, A = ε xlxc, waarin A de absorptie, ε de extinctiecoëfficiënt, l de weglengte in centimeters en c de concentratie.

2. Bulk Analyse van metalloproteïne Standards gebruik van inductief gekoppeld plasma - massaspectrometrie

1. Warm-up en tunen van het instrument met behulp van de protocollen van de fabrikant.
2. Zodra instrument wordt opgewarmd en afgestemd, voert bulk ICP-MS.
   Opmerking: De oplossingen van gezuiverd metalloproteïnen het algemeen moet worden verdund voor de meting. De metalen concentratie van de standaard kan worden geschat op basis van de bekende eiwit: metaal stochiometries en de geschatte eiwit Concentratie. Deze informatie kan worden gebruikt om de verdunning die passend binnen het bereik van de standaardkromme gegenereerd vallen zal bepalen.
   1. Verdun metalloproteïne normen, thyroglobuline, ferritine, ceruloplasmine, Cu / Zn SOD en vitamine B _12, zodat ze binnen het bereik van 0 vallen - 500 ug / L, middels 1% salpeterzuur. Normen bereiken binnen dit bereik, niet meer dan 1 verdunningen gebruiken 20. Voer seriële verdunningen in water om de voorraad te verdunnen voordat deze indien nodig.
   2. Stel de volgorde van de injecties. Eerst, analyseren de kalibratie zeven niveaus concentraties variërend 0-500 ug / l, gevolgd door de metalloproteïne normen. De zeven kalibratie niveaus 0, 1, 5, 10, 50, 100 en 500 ug / L.
   3. Selecteer elementen van belang. Hier, Gebruik Fe, Cu, Zn, Co en ik, omdat ze de elementen die de eiwitstandaarden zijn gebonden. Selecteer de elementen in de overnamemethode door het openen van de tab element selector en vervolgens die eleme gen en hun isotoop massa's die moeten worden geanalyseerd.
   4. Voeren monsteranalyse het instrument en het instrument software automatisch de kalibratiekrommen voor elke van de elementen worden geanalyseerd. De kalibratiekrommen worden gecreëerd door de software van het uitzetten van de tellingen / sec van de gedetecteerde tegen de hoeveelheid metaal die de norm is bedoeld om te bevatten, in mg / l metal. Met de kalibratiekromme om de concentratie van metaal bepalen de onbekende monsters.
      Opmerking: De ijkkromme, de software bepaalt de concentratie van metaal in elke metalloproteïne normen.
   5. Uit de totale analyseresultaten genereren metalloproteïne normen die de drie meest voorkomende spoorelementen in zoogdierlijke weefsels met een mengsel van Cu omvatten, Zn superoxide dismutase (SOD) verdund tot 200 ug / l koper en zink en ferritine (FTN) in een uiteindelijke concentratie van 2000 ug / l ijzer.

jove_title "> 3. HPLC System Setup en Size Exclusion Chromatography kolomequilibratiebuffer

Opmerking: Dit deel moet worden uitgevoerd parallel aan de vorige, aangezien ze allebei vereist ongeveer 1-1,5 uur in beslag.

1. Purge HPLC pompen met buffer in stap 1,1 en ontlucht de pompen gedurende 5 min bij een stroomsnelheid van 5 ml / min.
2. Zodra het systeem is verwijderd, ligt het debiet 0,1 ml / min en sluit de gelfiltratiekolom (4,6 x 300 mm, 3 urn, 150 A).
   Opmerking: Een natte verbinding tussen de buis en de kolom voorkomt eventuele luchtbellen gevangen tijdens het aansluiten van de kolom.
3. Sluit het andere uiteinde van de kolom om de UV-detector ingesteld op 280 nm absorptie bij gebruik PEEK buis te meten.
4. Geleidelijk verhogen van de stroomsnelheid van de kolom in stappen van 0,05-0,1 ml / min tot een uiteindelijke stroomsnelheid van 0,4 ml / min bereikt. Terwijl dit zich voordoet, controleert u de slangaansluitingen aan de kolom op eventuele lekkages. Bewaken van de drukvan het systeem waardoor het apparaat niet overschrijdt kolom eisen en houdt de druk spoor op het chromatogram in de software.
5. Laat de kolom in evenwicht komen met de vereiste debiet meer dan 5-10 kolomvolumes. Nadat het is in evenwicht gebracht, sluit u de instrumenten om het monster analyse plaatsvinden.
6. Stel de HPLC-methode tot buffer A overpompen de kolom bij 0,4 ml / min gedurende 15 min.

4. opzetten en runnen van Size Exclusion - inductief gekoppeld plasma - massaspectrometrie

Opmerking: Operationele procedures kan variëren tussen de instrumenten en modellen. Neem contact op met het instrument technisch specialist voor meer informatie over het configureren van de ICP-MS wordt gebruikt te leren.

1. Plaats de ICP - MS in de standby-modus voor de hardware-instelling te wijzigen.
   1. Eenmaal in de standby-modus schakelt u de communicatie voor de auto-sampler en verander de sample kennismaking met "andere".
      Opmerking: Afhankelijk van de software en hardware configuratie selecteren "HPLC" als monsterintroductiemethode bron kan worden gebruikt. Neem contact op met het instrument technisch specialist om te weten of deze optie beschikbaar is.
2. Gebruik PEEK buis (ID 0,13 mm) om de stroom van de UV-detector rechtstreeks aansluiten op de vernevelaar op de ICP-MS.
3. Power back-up van de ICP - MS en laat het apparaat opwarmen 10-20 min.
4. Nadat het plasma ontstoken is, sluit de externe kabel van de ICP - MS naar de achterkant van de HPLC-autosampler. Doe dit zodra het plasma ontstoken; anders wordt het HPLC-systeem automatisch uitgeschakeld omdat de ICP - MS is niet op.
5. Verander de ICP-MS methode om gegevens voor LC-ICP-MS verzamelen.
   1. Alter de overname methode van spectrum tot tijd resolve acquisitie (TRA).
   2. Selecteer de te analyseren elementen, Fe, Cu, Zn, Co, I, alsmede andere elementen van belang, en stel integratietijden (typisch tussen 0,05-0,3 sec). Na de elementen van belang eenre gekozen, past de overname tijd om de looptijd match voor de chromatografie (bijvoorbeeld 900 seconden voor een 15 min chromatografie run).
   3. Hand af te stemmen ICP - MS gevoeligheid en botsingscel helium (He) gasstroomsnelheid met chromatografie buffer stroomt via Cs en Sb in de buffer. De He stroomsnelheden zijn gewoonlijk ~ 1 ml / min lager dan die voor bulkanalyse. Zodra het metaalion tellingen gestabiliseerd en relatieve standaardafwijking (RSD) waarden lager dan 5%, is het systeem klaar voor gebruik.
6. Maak monster lopen lijsten in zowel de HPLC en ICP-MS software programma's. Het monster run lijst bevat de volgorde waarin elk van de monsters is zo goed worden geïnjecteerd als de naam waarmee de gegevens worden opgeslagen. Controleer of het totale aantal monsters in de lijst wedstrijd tussen de twee programma's.
7. Start de monsterbatch voor de ICP-MS voor de HPLC als de injectie van het monster door HPLC wordt de ICP leiden - MS wil bijhoudengegevens. Als dit niet in de juiste volgorde wordt gedaan zal leiden tot ontbrekende gegevens.
8. Genereren kalibratiekromme punten door het injecteren van uiteenlopende hoeveelheden van de SOD en FTN gemengde standaard van 200 ug / l tot 6000 ug / L geïnjecteerd op de kolom voor Cu en Zn en 2000 ug / L tot 60.000 ug / L Fe. Injectie volumes variëren van 1 tot 30 pi.
   Opmerking: deze concentratiebereiken omvatten de concentratie van Fe, Cu en Zn typisch waargenomen in complex homogenaten. Voor monsters die alleen gezuiverde eiwitten bevatten het maximale bereik van de curve dienovereenkomstig moet worden aangepast. Wanneer de hoeveelheid metaal geassocieerd met het eiwit kan een kleiner of groter bereik worden omdat er minder vervuiling van het monster van andere factoren.
9. Analyseer elke onbekende weefselmonsters, plasma of celkweek.

5. Data-analyse, manipulatie en visualisatie

1. Sla de gegevens in de door komma's gescheiden waarden (csv) bestandsformaat en laad inom verwerkingsprogramma's zoals vereist.
2. Om te controleren voor instrument drift, verdeel de tellingen per seconde voor elk element van de tellingen per seconde voor zowel Cs of Sb.
3. Genereer kalibratiecurven voor elk van de elementen.
   1. Bepaal het oppervlak onder de metalen piek die overeenkomt met de metalloproteïne die aan elk van de injecties wordt gebonden door het uitvoeren piekintegratie de voorkeur gegevensanalyse software.
   2. Plot het gebied onder de metalen piek ten opzichte van de totale hoeveelheid van het metaal dat op de kolom werd geïnjecteerd in elke run, 200 - 6000 ug / l voor Cu en Zn en 2000 - 60.000 ug / L Fe. Voer lineaire regressieanalyse met de softwareprotocol.
   3. Met de resultaten helling van de lineaire regressieanalyse als factor tellingen per seconde omzetten pg / sec. Verdeel elk van de tellingen per seconde data locaties in het chromatogram door het stijgingspercentage van de lijn waarde.
4. Grafiek van de gegevens inpg / sec tegen de chromatogram tijd. Bepaal het oppervlak onder de pieken van belang. Het oppervlak van de piek geeft de totale hoeveelheid metaal dat het eiwit is gebonden aan, in pg.
5. Genereer een ijking op basis van het molecuulgewicht van de bekende metalloproteïnen en het tijdstip waarop ze elueren. Gebruik de omvang van de eiwitpieken schatten complexe monsters.

Resultaten

Het gebruik van metalloproteïne standaarden maakt het kalibreren van de gelfiltratiekolom. Figuur 1A toont het elutieprofiel van de normen thyroglobuline, ferritine, ceruloplasmine, Cu / Zn SOD en vitamine B ₁₂ basis van de metalen die verbonden om (Fe, Co, Cu, Zn en I). Figuur 1B toont de ijkkromme voor de gelfiltratiekolom basis van het molecuulgewicht van eiwitstandaarden en hun elutietijd, gepresenteerd in de vorm van elutievolume (Ve) gedeeld door het lege volume van de kolom (Vo). De eiwitten gebruikt om deze standaard curve te genereren zijn concanavaline A, conalbumine, ceruloplasmine, ferritine, SOD en thyroglobuline.

Figuur 2A toont de elutie van ferritine een bereik van 2000 - 60.000 ug Fe geïnjecteerd op de kolom en figuur 2D is de regressieanalyse uitgevoerd met peak gebied. Figuren 2B en 2C zijn de elutie profielen voor Cu / Zn SOD voor Cu en Zn en 2E en 2F zijn de regressieanalyses gegenereerd met behulp van de piekoppervlakken. De resultaten van de regressieanalyse wordt gebruikt om de ruwe data in tellingen / sec omzetten pg / sec, zodat de hoeveelheid metaal geassocieerd met het eiwit kwantitatief worden bepaald. De omzetting wordt uitgevoerd door het delen van de tellingen / sec door de helling van de lineaire regressie (bijvoorbeeld 334,6 (tellingen / sec) x (sec / pg) of koper).

Zoals vermeld, kan deze techniek worden gebruikt om metalloproteïnen in complexe biologische monsters te identificeren. Menselijke hersenen en plasma zijn onderworpen aan deze techniek en Figuren 3 en 4 tonen respectievelijk de resultaten verkregen. Menselijke hersenen gescheiden door SEC-ICP-MS wordt getoond in figuren 3A-3C, elk overeenkomende met een ander metaal belang (Cu, Zn of Fe). Figuren 4A-4C tonen de sporen verkregen wanneer humaan plasma is onderworpen aan deze techniek. De complexiteit en de grootte van het monster het aantal pieken die worden gezien beïnvloeden. Zoals verwacht plasma wordt gedomineerd door een paar metalloproteïnen waaronder ceruloplasmine en transferrine.

Figuur 1. De kalibratie van Size Exclusion Chromatography - inductief gekoppeld plasma - massaspectrometrie met behulp van bekende metalloproteïnen (A) Elutie profiel voor de metalloproteïne normen op basis van hun respectieve metalen.. (B) Molecuulgewicht kalibratiekromme voor eiwitstandaarden thyroglobuline (i), ferritine (ii), ceruloplasmine (iii), conalbumine (iv), Cu / Zn SOD (v) en concanavaline A (vi)."Target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Het gebruik van Ferritin en Cu / Zn SOD als metalloproteïne Standards om de hoeveelheid Cu, Fe en Zn in verband gebracht met metalloproteïnen bepalen in een complex biologisch monster (A) Elutie profiel voor ferritine over de injectie range 2000 -. 60.000 ug / L van ijzer. (B) en (C) elutieprofiel van Cu / Zn SOD via injectie bereik van 200 - 6000 mg / l koper en zink, respectievelijk. (D), (E) en (F) tonen de regressie-analyse resultaten van de metalen ijzer, koper en zink, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Cu, Fe en Zn Metalloproteome van het menselijk brein. (A) Copper trace (B) Iron trace (C) zink trace. Elutie van het eiwit normen voor elk metaal wordt getoond door de zwarte trace met hun moleculair gewicht onder de grafiek aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Cu, Fe en Zn Metalloproteome for Human Plasma. (A) Copper trace (B) Iron trace (C) zink trace. Elutie van de eiwitstandaarden voor elk metaal wordt aangegeven door de zwarte trace met hun molecuulgewichtdicated onder de grafiek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Zorgen de natuurlijke toestand van het eiwit betekent bijzondere aandacht aan de gebruikte buffers en opslag van het monster nodig. Niet alle chromatografietechnieken of staalvoorbereidingstechnieken kunnen worden toegepast. Het is belangrijk dat de gebruikte gedurende monsterbereiding en chromatografie buffers ontberen metaalchelatoren en gebruiken buffers die fysiologische pH en zoutconcentraties nabootsen. Andere voorwaarden om te voorkomen dat zijn voorzien van verwarming van het monster of de toevoeging van eiwit denaturerende (bijvoorbeeld ureum). Het is cruciaal om het aantal vries dooicycli minimaliseren. Het vermogen van de gekozen buffer divalente metalen te binden ook belangrijk en is een reden dat Tris of ammoniumnitraat buffers worden verkozen boven fosfaathoudende buffers.

De lage resolutie en piekvermogen van de gelpermeatiechromatografie ten opzichte van andere vormen van chromatografie is een belangrijke beperking van deze techniek. Echter, de zachte aard van size exclusion Chromatography is belangrijk om de natuurlijke toestand van het eiwit behouden, en aldus het behoud van de relatief zwakke metaal-eiwit bindingen. De eis om de natuurlijke toestand van de proteïnen te behouden vereist speciale aandacht voor de behandeling van de monsters zoals het beperken van het aantal invries dooicycli vermijden metaal chelatoren (bijvoorbeeld EDTA) of chaotrope zouten en detergenten.

Deze lage resolutie van deze techniek invloed op de mogelijkheid om de hoeveelheid metaal geassocieerd met een specifiek eiwit te kwantificeren als het in een complex monster de pieken die meer dan één eiwit bevatten. Daarom zou de hoeveelheid metalen bepaald volgens de piekintegratie een indicatie van de totale hoeveelheid metaal betrokken bij al de eiwitten geëlueerd op dit tijdstip en niet slechts een specifiek eiwit. Om deze beperking te omzeilen het gewenste eiwit zou verder worden gezuiverd onder natieve omstandigheden. Dit zou voor de kwantificering vanhet metaal geassocieerd met het eiwit Vermeld een hogere certainity. Een andere potentiële beperking van deze techniek zou het verlies van eiwit door niet reversibele binding aan de kolom. Om te bepalen of dit gebeurt herstel proef moet worden uitgevoerd, waarbij de hoeveelheid eiwit geëlueerd uit de kolom wordt geanalyseerd om te bepalen of dit overeenkomt met de geïnjecteerde hoeveelheid. Hetzelfde kan gebeuren door het metaalgehalte van de elutie materiaal en het uitgangsmateriaal door bulk ICP-MS. Winningskolom kan afhankelijk van de gebruikte omstandigheden, maar het is aangetoond dat volledige terugwinning van eiwitten uit een gelfiltratiekolom mogelijk ^9. Dus is het belangrijk om te controleren of er enige schade onder de bedrijfsomstandigheden wordt gebruikt.

Wijzigingen aan het protocol kan worden gerelateerd aan de metalloproteïne normen en worden gebruikt als elementen geanalyseerd. Het type metalloproteïne standaard onsed zal verschillen afhankelijk van de elementen die van belang zijn. Voor elementen zoals Cu, Fe en Zn eiwitten, SOD en ferritine worden toegepast. Andere metalloproteïne waarvan bekend stoichometries hebben kunnen ook worden gebruikt en enkele voorbeelden zijn zijn.

Een belangrijke complicatie die kan voortvloeien uit het gebruik van deze techniek is de opbouw van zoutkristallen in de fakkel van de ICP-MS. De opbouw van zoutkristallen te voorkomen, wordt de toorts gewassen met gedestilleerd water na elke 500 - 1000 ml buffer die door het systeem is gepasseerd of wanneer wordt bepaald door visuele inspectie dat indien de brander worden gewassen. Een ander probleem dat kan optreden is een snellere daling van de hygiëne van het monster en extractie kegels. Deze moeten regelmatig worden schoongemaakt volgende protocollen van de fabrikant.

De eerste steekproef voorbereiding is de meest kritische fase in het protocol. Als er sprake is van veranderingen in het eiwit - metaalcomplex de informatie gegenereerd niet geldig. Dit is een van de belangrijkste beperkingen van de techniek; Naast het gebruik van de lage resolutie, gelfiltratiekolom levert een beperkt exacte afbeelding van de werkelijke complexiteit van metalloproteïnen in de biologie.

De hier beschreven techniek maakt het mogelijk de uitbreiding van de kennis van de metalloproteome van een organisme. Bulkanalyse geeft slechts een ruwe indicatie van veranderingen in de hoeveelheid metaal in een monster. Naast de algemene overwegingen waarmee rekening moet worden gehouden met deze techniek een instrument dat kan worden gebruikt om de hoeveelheid metaal geassocieerd met eiwitten en identificatie metalloproteïnen die verschillen door vergelijking van de sporen verkregen kwantificeren. Het gebruik van deze techniek kan worden gebruikt om verschillen tussen ziektetoestanden identificeren. De geïdentificeerde metalloproteïnen kan dan verder worden onderzocht om te bepalen de rol die zij spelen bij de ziekte van processen. De toepassing van koppelteken ICP-MS heeft een groeiendetoekomst de rol van geneesmiddelen die een heteroatoom zoals platina, jodium en koper als de ICP-MS bepaald kan worden gebruikt om de eiwitten die het geneesmiddel bindt te identificeren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agilent 1290 Infinity Binary Pump	Agilent	G4220A
Agilent 1290 Infinity Autosampler	Agilent	G4226A
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat	Agilent	G1330B
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment	Agilent	G1316C
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector	Agilent	G1314E
Agilent 7700 ICP-MS	Agilent	G3282A
Ammonium hydroxide trace metal basis	Sigma	338818
Ammonium nitrate	Sigma	256064	Maak een verse 200mM oplossing op de dag van het experiment
Antinomy	Choice analytical	10002-3
Ceruloplasmin	Sigma
Cesium	Choice analytical	100011-1
Complete, EDTA free protease inhibitors	Roche	11873580001
Conalbumin	Sigma	C7786
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)	Sigma	L7647
Cu, Zn Superoxide dismutase	Sigma	S9697
Ferritin	Sigma	F4503
ICP-MS multielemental calibration standards	AccuStandard		Opgemaakt tot de vereiste concentraties in 1% salpeterzuur
Microvolume UV spectrophotometer	Thermo Scientific
65% Salpeterzuur	Millipore	100441	Verdund tot 1% voor gebruik
Peek tubing	Agilent	5042-6461
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6 x 300 mm, 3 μm, 150 Å	Agilent	5190-2508
Natriumchloride	Chem Supply	SA046
Tris Hydrochloride	ICN Biomedicals inc.	103130
Thyroglobuline	Sigma	T9145
Vitamine B12	Sigma	V2876