Microarray-technologie maakt kwantitatieve meting en profielbepaling van genexpressie van transcripten op genoombreed niveau mogelijk. Daarom biedt dit protocol een geoptimaliseerde technische procedure in een tweekleurige op maat gemaakte boviene array met gebruik van boviene embryo's op dag 7 om de haalbaarheid van het gebruik van een kleine hoeveelheid totaal RNA aan te tonen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Transcriptome Profilering van In-Vivo Geproduceerd Bovine Pre-implantatie embryo's met behulp van twee-kleuren Microarray Platform
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vroege embryonale verliezen zijn een grote bijdrager aan onvruchtbaarheid bij rundvee. Bovendien wordt rundvee een interessant model om de menselijke pre-implantatie embryo ontwikkeling te bestuderen vanwege hun vergelijkbare ontwikkelingsproces. Hoewel genetische factoren bekend zijn om de vroege embryonale ontwikkeling te beïnvloeden, is de ontdekking van dergelijke factoren een serieuze uitdaging geweest. Microarray technologie maakt kwantitatieve meting en genexpressie profilering van transcript niveaus op een genoom-breed basis mogelijk. Een van de belangrijkste beslissingen die genomen moeten worden bij het plannen van een microarray experiment is of een een- of tweekleurige benadering te gebruiken. Een tweekleurige opzet verhoogt de technische replicatie, minimaliseert variabiliteit, verbetert gevoeligheid en nauwkeurigheid en maakt ook loop ontwerpen mogelijk, waarbij de gemeenschappelijke referentie monsters worden gedefinieerd. Hoewel microarray een krachtig biologisch hulpmiddel is, zijn er potentiële valkuilen die zijn kracht kunnen verminderen. Daarom demonstreren we in dit technische artikel een geoptimaliseerd protocol voor RNA extractie, amplificatie, labeling, hybridisatie van het gelabelde geamplificeerde RNA naar de array, array scannen en data-analyse met behulp van de tweekleurige analysestrategie.
Inleiding
Vroeg embryonaal verlies in hoogproductieve melkkoeien is een van de belangrijkste uitdagingen in de zuivelindustrie 1, 2. Bovine is uitgegroeid tot een interessant model voor pre-implantatie embryo-ontwikkeling van het menselijk studeren omdat ze gelijkaardige ontwikkelingsproces 3, 4. Er is echter meer onderzoek nodig om beter inzicht te krijgen over de genen die betrokken zijn bij runderen vroege embryonale ontwikkeling.
Na twintig jaar sinds de eerste microarray technologie ontwikkeld in 1995 5,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het dier deel van deze studie werd uitgevoerd bij de Metabolic Research Unit van de Universiteit van Alberta, Edmonton, Canada, met alle dierlijke experimentele procedures goedgekeurd (Protocol # AUP00000131) van de Universiteit van Alberta Animal Care en gebruik Comite, en de dieren verzorgd volgens aan de Canadese Raad van Animal Care richtlijnen (1993).
1. Embryo Productie, Isolatie van Totaal RNA en DNase behandeling
- Voor dierlijke experimentele protocollen en embryo verwijzen in onze vorige publicaties 17, 18.
- Pool en snap bevriezen soortgelijke embryo's van elke koe in v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een representatief resultaat van totaal RNA geamplificeerd en aRNA vanaf dag 7 runderembryo's wordt getoond in Figuur 3 en samengevat in tabel 1.
RNA integriteit en profiel kan worden vastgesteld na RNA-extractie. Kwaliteitsbeoordeling RNA kan gebeuren door bioanalyzer instrument (figuur 3A) en slechts monsters met RIN waarde hoger dan 7,0 gekwalificeerd te worden gebruikt.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het eerste probleem om microarray-analyse uit te voeren met behulp van de Dag 7 embryo's van runderen krijgt niet voldoende hoeveelheden van hoge kwaliteit RNA voor het bestuderen van genexpressie. Traditioneel fenol / chloroform RNA-extractie en ethanolprecipitatie methode wordt niet aanbevolen voor Dag 7 embryo's, wat resulteert in een lage opbrengst en mogelijke overgebleven fenol remmen RNA-amplificatie reactie. In plaats daarvan een standaardmethode kolommen gebaseerde beter om totaal RNA te isoleren en elu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Onderzoek ondersteund door Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk en Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25x Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10x GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack van 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | - |
Referenties
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006). ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
