Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het kweken, op regelmatige basis, van een populatie Drosophila melanogaster met behulp van een vliegenpopulatiekooi.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Grote hoeveelheden DNA, RNA, eiwitten en andere cellulaire componenten zijn vaak vereist voor biochemie- en moleculaire biologie-experimenten. De korte levenscyclus van Drosophila maakt het mogelijk om grote hoeveelheden materiaal te verzamelen van embryo's, larven, poppen en volwassen vliegen, op een gesynchroniseerde manier, tegen een lage economische kostprijs. Een belangrijke strategie voor het vermeerderen van grote aantallen vliegen is het gebruik van een vliegpopulatiekooi. Dit nuttige en gebruikelijke hulpmiddel in de Drososphila-gemeenschap is een efficiënte manier om regelmatig milligrammen tot tientallen grammen embryo's te produceren, afhankelijk van de gewenste uniformiteit van het ontwikkelingsstadium. Hoewel het opzetten van een populatiekooi tijdrovend kan zijn, neemt het onderhouden van een kooi gedurende maanden veel minder tijd in beslag en maakt het snelle verzameling van biologisch materiaal in een korte periode mogelijk. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd en flexibel protocol voor het onderhoud van een Drosophila melanogaster populatiekooi, beginnend met 1,5 g geoogst materiaal van de vorige cyclus.
Inleiding
De mogelijkheid om genetische en biochemische methoden combineren Drosophila heeft in bijzondere mate geschikt organisme voor biochemie en moleculaire biologie studies 1-3. Deze studies vereisen vaak grote hoeveelheden biologisch materiaal, niet alleen van volwassen vliegen, maar ook van larven 4, 5 en poppen embryo 6-8. Om grote hoeveelheden materiaal te verkrijgen, onderzoekers gekweekte vliegen gebruik van grote containers bekend als "population kooien" vliegen. Deze kooien bestaan uit een cilinder van kunststof waarop een net op beide zijden van de invoering van het voedsel in de kooi zonder de vliegen ontsnappen mogelijk. Deze kooien kunnen zelfgemaakte 9-11 of gekocht van een bedrijf (zie tabel van specifieke materialen / apparatuur) zijn.
Een belangrijk voordeel van dit systeem grote aantallen vliegen groeien is dat de cyclus van de fruitvlieg 12 kan worden bestuurd op een wijze die alle vliegen ontwikkelen in een relatief gesynchroniseerde wijze. Deze synchronisatie wordt bereikt door het zaaien van nieuwe embryo's, het voeden van de larven / vliegen en het opofferen van de volwassen vliegen op precieze tijden. Met behulp van een gesynchroniseerde vlieg bevolking is vooral handig voor de ontwikkelingsbiologie studies 13.
Het begin van een nieuwe populatie kooi van enkele vliegen is een tijdrovend proces dat veel amplificatiecycli 9-11. Zelfs het gebruik van grotere containers als fly cultuur flessen of minicages, kan het hele proces voor de laatste maanden. Om deze tijdrovende stap te vermijden, veel Drosophila laboratoria regelmatig onderhouden dergelijke kooien. Dat het gemakkelijkst een nieuwe kooi uitgaande van een embryo van een reeds gevestigde populatie kooi starten. In het algemeen zijn de meeste laboratoria onderhouden wildkleur bevolking kooien, zoals Oregon R of Canton S. Dit handschrift bevat een gedetailleerd protocol te vliegen bevolking kooien te houden.
Protocol
1. Starten van de cyclus: zaaien Embryo's
NB: De cyclus begint met 1,5 g verzamelde materiaal (een mengsel van embryo's en / of een eerste instar larven) van de vorige cyclus. Dit materiaal zal in een plastic container (zie tabel van specifieke materialen / apparatuur) worden gebracht met een actieve gist mengsel tot de pupal fase. De container wordt gesloten nadat de introductie van het biologische mengsel van embryo's en larven met het deksel te voorkomen waardoor de larven ontsnappen. Er moeten gaten in het deksel maken om luchtcirculatie. Om te voorkomen dat de larven ontsnappen door de gaten, zijn schuim stekkers gebruikt. Tot slot, is het raadzaam om handschoenen en een laboratoriumjas, niet alleen in deze rubriek, maar ook in het gehele protocol te dragen, om te voorkomen dat vuil of vlekken kleren met bleekmiddel.
- Stel de plastic container.
- Maak drie vierkante gaten met een scheermesje in de kunststoffen container deksel van eenpproximately 2.2 cm. tape (3/4 inch etikettering tape) toe te voegen aan de vier hoeken van elk gat om een strakke pasvorm voor het schuim pluggen (50 x 55 mm, dxl) te garanderen, en plaats dan een schuim plug in elk gat.
- Bedek de binnenzijde van de plastic container met folie. Over deze film, voeg een laag van katoen de bodem van de kunststoffen container bedekken. Scheur de katoen met je vingers.
- Bereid de vlieg voedsel.
- Voeg 333 ml gedeïoniseerd water in een 500 ml bekerglas. Onder roeren van het bekerglas met een magnetische staaf, voeg 167 ul propionzuur en 1,08 ml fosforzuur, uit de voorraadoplossingen (99,96% en 85%, respectievelijk).
- Voeg langzaam 77,5 g actieve droge gist, het vermijden van grote klonten. Na het oplossen van het droge gist, voeg 38,8 g sucrose.
OPMERKING: Sucrose dient als laatste bestanddeel toegevoegd omdat onmiddellijk na het toevoegen van deze component zal fermentatie begint.
- Onmiddellijk na het oplossen van de sucrose, giet devoedsel over het katoen, en zorg ervoor dat de katoen gelijkmatig te dekken. Sluit de plastic houder met het deksel ontsnapt vliegen in het laboratorium besmetting van het voedsel te voorkomen.
- Resuspendeer 1,5 g van het geoogste embryo (niet dechorionated) van de vorige cyclus met 5 ml 70% ethanol. Gehalveerd twee filterpapier en het biologische mengsel gelijkmatig via 4 stuks met een spatel of een overdracht pipet met brede punt (cut indien nodig). Leg de vellen bovenop de geweekte katoen en sluit het deksel. Tenslotte incubeer de kunststoffen container bij kamertemperatuur (24 ° C) en vochtigheid (35%) tot het popstadium.
OPMERKING: De plastic container niet in een vochtige kamer geplaatst worden, omdat anders de bacteriegroei bevorderen.
2. Voortzetting van de Cyclus: uit embryo's te vliegen.
Opmerking: Dit deel van de cyclus gaat van de embryo's geplaatst in de kunststoffen container op dag 1 tot 9 dagen later wanneer de volwassen vliegen zal ontstaanvan de poppen. Tijdens deze 8 dagen niets te doen, maar het toezicht dat de embryo's de juiste weg naar de volgende fasen van de Drosophila levenscyclus tot eclosion. Als larven beginnen te sterven en het draaien van zwart in deze tijd, controleer dan of het schuim plugs niet te strak en dat er voldoende ventilatie aanwezig is. Deze periode is een goed moment om de fly bevolking kooi schoon te maken uit de vorige cyclus.
- Let op de embryo's worden 1 e instar larven ongeveer 24 uur na de volwassen vrouwtje hen gestort in de vlieg voedsel (zie stap 3). De resulterende larven voeden van de vlieg voedsel bereid in stap 1 gedurende 4 dagen, groeien en rui tweemaal in de 2 e en 3 e instar larven.
- Reinig de vlieg bevolking kooi.
- Plaats de kooi bij 4 * C gedurende ten minste 30 min te vertragen de activiteit van de vliegen. Verwijder het net dat bedekt één zijde van de kooi, en met een snelle beweging dop op de open zijde met een groot biologisch plasticzak. Giet de inhoud van de kooi in de zak.
- Met de biohazard zak nog steeds met betrekking tot de ene kant van de kooi, de positie van de kooi verticaal over een wastafel met de biologisch gevaarlijk zak naar beneden. Verwijder voorzichtig de plastic zak om vliegen te kunnen ontsnappen en gooi het in een container biologisch gevaarlijk afval.
- voorzichtig openen bovennet genoeg om een klein gaatje maken, spoel de binnenzijde van de kooi met water, waarmee de vliegen wast in de gootsteen. Langzaam de grootte van het gat en elimineren alle de vliegen in de kooi.
- Maak de kooi en beide netten met water en zeep. Terwijl de netten nog nat borgen aan beide zijden van de droge schone kooi en eindelijk in een lab soaker papier, dat de kunststoffolie bereid in stap 1.1.2 plakken aan de kooi voorkomt. Nu de kooi is klaar voor de volgende cyclus.
- Vier dagen na de eerste installatie, observeert de larven verpoppen. De larven in deze fase blijven nog 4 dagen.
LET OP: Dijdens deze fase van de poppen zal bestrijken het gehele oppervlak van katoen in de plastic container. - Tijdens de pupal fase en voor de eerste vliegen naar voren komen, opent u de plastic container en plaats de plastic film die de katoen met alle poppen in het lab soaker papier in de schone bevolking kooi. Sluit het net met een dubbele knoop en de kunststoffen container en het deksel voor de volgende cyclus te reinigen.
LET OP: Poppen aangebracht op het deksel moet worden weggegooid en vernietigd door autoclaveren of bevriezing voor Eclosion.
3. volwassen vliegen.
NB: Na de 4 dagen van de pop de eerste vliegt stadium zal komen uit de poppen. Binnen 24 - 48 uur alle vliegen moeten Bijlage In. In dit deel van de cyclus, is het belangrijk hen voedsel te voorzien met als doel het creëren van de juiste omgeving voor reproductie.
- Bereid de melasse trays.
- Combineer in een 1 L kolf 556,25 ml gedeïoniseerd H2O, 90 ml melasse en 22 g agar. Autoclaaf met een roerstaaf gedurende 30 minuten, cool en voeg 9,25 ml van 10% Tegosept in 95% EtOH.
- Giet het mengsel in een vlees tray van 21 x 14,5 cm. Zorg ervoor dat het volume is genoeg om 15 te dekken - 17 trays. Wacht 10 - 20 min te stollen en elk dienblad met een plastic folie om te voorkomen dat ze uitdrogen. Verschillende kolven van 1 L kunnen worden bereid tegelijk. Bewaar de melasse bakken bij 4 ºC verpakt in plastic totdat ze nodig waren.
- Voeg een melasse dienblad bedekt met natte gist in de kooi met de volwassen vliegen.
- Voor het toevoegen van de plaat, plaats de kooi bij 4 ºC in de koude kamer gedurende 30 minuten.
- Voeg 200 ml gedeïoniseerd H2O in een beker en giet langzaam droge gist onder roeren met een lepel. Stop met het toevoegen van droge gist wanneer het mengsel wordt ongeveer de consistentie van pindakaas om te voorkomen dat vliegen vast komen te zitten in het voedsel.
LET OP: Het is belangrijk om niet toe te staan het voedsel oplossing anders stollen zal het erg moeilijk om te dekkende melasse lade en pak de eieren gedurende de oogst (zie paragraaf 4.3). - Verwijder het plastic van een dienblad en melasse bedekken met een laag van vers bereide natte gist met een lepel of spatel. Zorg ervoor dat het gehele oppervlak is bedekt.
- Terwijl de kooi is nog steeds in de koude kamer, opent het net en voorzichtig voeg de melasse bak met natte gist in de kooi. Sluit het net en zet de kooi bij RT.
NB: Het kan nuttig zijn om de plaat met een lege bak het vlees tijdens het inbrengen te dekken, maar zeker niet te toegang van de vliegen naar de melasse lade te blokkeren.
- Verander het eten plaat elke 24-48 uur om de gist te voorkomen dat te droog te krijgen. Volwassen vliegen zijn zeer gevoelig voor uitdroging.
4. Einde van de cyclus: Het oogsten van de Embryowet
LET OP: De beste vlieg vruchtbaarheid is 3-5 dagen na Eclosion. Daarom is het oogsten gedurende deze tijd zal de beste embryo opbrengst te krijgen. Na de gewenste collecties zijn completed, de cyclus is voorbij. De vliegen worden gedood en de kooi gereinigd zoals beschreven in stap 2.2.
- Typisch, 2 dagen na de fly Eclosion, de invoering van een nieuw melasse dienblad met verse nat voer in de kooi, zoals uiteengezet in paragraaf 3.2.5. De opbrengst van eieren depositie te verhogen met behulp van de vingers, maken het oppervlak van de natte gist zo onregelmatig mogelijk. Als een oude voedseldienblad aanwezig is in de kooi, voor het toevoegen van de nieuwe plaat, verwijder voorzichtig het en gooi het in een biologisch gevaarlijk zak. Nog een tip voor het verhogen van de opbrengst aan de katoen laag te verwijderen, zodat alle eieren in het voedsel zal worden gelegd. Handhaving van de kooi bij RT.
- Let op de embryo's als kleine witte stippen.
LET OP: De eieren zijn klaar om te worden verzameld. Voor routine-onderhoud van de vlieg kooi, 2 daagse collectie is de aanbevolen tijd. Deze collectie zal vooral embryo's en enkele 1 e instar larven bevatten. Zie representatieve resultaten voor typische opbrengsten van geoogste embryo's voor verschillende collectie tijdstippen. - Oogst de embryo's
- Plaats de kooi in de koude kamer gedurende 30 minuten. Ondertussen bereidt de kunststof houder en de vlieg voedsel voor de volgende cyclus zoals beschreven in punt 1.
- Per 8 autoclaaf lade voeg water toe tot ¼ van de totale capaciteit en voeg 1 ml 10% Triton X-100. Terwijl de kooi in de koude kamer verwijder voorzichtig de melasse bord en plaats deze in een biologisch gevaarlijk zak.
- Verwijder de lade uit de zak en snel onderdompelen (om te voorkomen dat vliegen ontsnappen) in de detergent oplossing in de autoclaaf lade. Sluit het biohazard zak en zet in een biohazard container. Vliegen zal niet verdrinken in water dat niet detergent bevat.
- Gebruik een grote kwast en gedestilleerd water pistool om embryo's en gist afwassen van melasse. Gooi platen en melasse in biohazard doos.
- Giet oplossing voorzichtig door een zeef drie set (grove zeef 30 op de top, 40 in het midden en 100 op de bodem). Wash klonten on hoogste niveau met gedestilleerd water pistool tot er geen klontjes blijven.
LET OP: De volwassen vliegen en 3 e instar larven in de zeef 30 worden behouden.- Spoel de autoclaaf bak met gedestilleerd water en giet het spoelwater door de zeven. Verwijder de bovenste zeef en herhaal proces als gist klontjes blijven. De meeste van de 1 ste en alle 2e instar larven in de zeef 40 blijven.
- Verwijder de tweede zeef. Het gelige materiaal in het derde (onderste) zeef het mengsel van embryo's en kleine 1e instar larven. Gedestilleerd water pistool om alle eieren naar één zijde van de zeef. Verzamel ze met een spatel en wegen.
- Tijdens deze cycli het verzamelen opbrengst van embryo / larven varieert tussen 7 en 13 g. Uitsluitend 1,5 g van dit materiaal een nieuwe cyclus (deel 1) start. Met de rest van de embryo voor verdere verwerking en kunnen worden weggegooid.
5. Overigeverwerking
OPMERKING: De embryo's gebruikt voor voortzetting van de bevolking kan direct worden gebruikt voor experimenten of alternatief kan worden ingevroren bij -80 ° C. Voor beide opties, kan de embryo's moeten eerst worden dechorionated.
- Voor dechorionation, was de embryo's gedurende 2 minuten in 50% bleekwater oplossing en goed naspoelen met gedestilleerd water.
- Het embryo, eerst droog te vriezen stevig aan te drukken met een papieren handdoek en weeg en plaats ze met behulp van een spatel, een 15 of 50 ml conische buis. Tenslotte onderdompelen conische buis in vloeibare N2 gedurende enkele seconden.
Resultaten
Het onderhoud van een vlieg kooi populatie is gebaseerd op de fly levenscyclus. Derhalve, nadat de initiële biologische mengsel van embryo's en larven in de kunststofhouder (figuur 1A) de bevruchte eieren larven worden in maximaal 2 dagen en de larven groeien 4 dagen, relatief gesynchroniseerd door de verschillende instar larven stadia ( zie figuur 1B).
Nadat de larven de 3 e instar larvale stadium voltooid zullen ze verpoppen en bedekken het oppervlak van de katoen binnen de kunststoffen container met wat op het binnenoppervlak van het deksel (figuur 1C). Dit verpopping periode zal gaan voor de komende 4 dagen totdat de vliegen af van de metamorfose proces. Gedurende deze periode is het sterk aan te raden om de vliegen te zetten in de kooi. De eerste volwassen vliegen begint te ECLOSE op dag 9-10 na deaanvang van de cyclus (figuur 1D) en dag 11 zullen allemaal voortgekomen zijn uit de poppen.
De beste opbrengst van de embryo collectie wordt verkregen 3-5 dagen na verpopping (dag 13 tot 15) en tenslotte afneemt bij dag 17 (7 dagen na verpopping). Daarom is het raadzaam om de laatste lade van vers voedsel toe te voegen op dag 13 en het verzamelen van de eieren op dag 15 (Figuur 1 E en F). Dit verzamelen van het maximum aantal embryo's mogelijk. Toevoegen van een derde extra dag voor verzamelen kan resulteren in voedsel dat te droog en daardoor de opbrengst van verzamelde embryo verminderen. Tabel 1 toont de opbrengst aan 6 opeenvolgende cyclus verzamelingen, met een uitgangsmateriaal van 1,5 g per cyclus, en figuur 2 is het aanbevolen schema voor een hele cyclus collectie.
Het materiaal geoogst in 2 dagen60; perioden hoofdzakelijk uit embryo. Echter een klein aantal larven zijn ook aanwezig. Voor kooi onderhoud deze larven zijn geen probleem, aangezien een zekere asynchroniciteit verwacht. Maar om een aantal biochemische experimenten, de zuiverheid van deze embryo's is erg belangrijk, maar tegelijkertijd is het ook noodzakelijk om grote hoeveelheden eieren verzamelen om deze experimenten. Daarom werden verschillende korte achtereenvolgende verzamelingen uitgevoerd op 1 uur en 3 uur na snel toevoegen bij kamertemperatuur een nieuwe plaat met voedsel, een schatting van de opbrengst en zuiverheid die kan worden verkregen met deze werkwijze (Tabel 2 en Figuur 3) . De 1 uur opeenvolgende collecties zijn begonnen met een zeer lage opbrengst (14,5 mg), maar dan is de hoeveelheden van embryo verhoogd voor elke verzamelde tijd, maar de laatste keer. De lage opbrengst aanvankelijk kan worden veroorzaakt door het vliegen gestresst tijdens het veranderen het eten maar later acclimatiseren. Anderzijds, geen larvae waargenomen in de vijf opeenvolgende verzamelingen (figuur 3A), waaruit blijkt dat kortere verzamelingen leveren hogere zuiverheid. Indien katoen niet uit de kooi wordt verwijderd, wordt de kans dat larven van eerdere tijdstippen blijven en voer de nieuwe plaat wordt vergroot. Zelfs als katoen wordt verwijderd, soms larven wandelt op de zijkant van de kooi en in de voedselketen in een verzameling.
Voor de 3 hr opeenvolgende verzamelingen, opbrengst varieerde 840-1250 mg, hetgeen ongeveer 10 keer meer dan de opbrengsten die in het 1 uur verzamelingen. De zuiverheid van deze embryo's was bijna 100% (Figuur 3B). Af en toe larven waargenomen. Sommige ontwikkelingsstudies vereisen een zeer strikte synchronisatie voor de verzamelde embryo's. Om de synchronisatie zuiverheid te verhogen, is het raadzaam om de eerste collectie plaat weggooien, want als de omstandigheden niet ideaal zijn, kunnen vrouwtjes meer rijpe eicellen te behouden en te deponeren dem bij verbeteren, bijvoorbeeld door introductie van een verse plaat. Ook is het belangrijk te weten dat oudere volwassen vliegen (> 6 dagen) produceren minder gesynchroniseerd embryo. Om de mate van synchronisatie met grote nauwkeurigheid te verifiëren, wordt een DAPI kleuring van de verzamelde embryo aanbevolen.
Figuur 1. De Drosophila melanogaster Life Cycle in een Fly Bevolking Cage. (A) Inleiding van de cyclus zaaien 1,5 g van embryo's in de plastic container doos. Ter vergelijking, in het onderste deel, de lengte van het filter is 8,5 cm. (B) De larven groeien relatief gesynchroniseerd 5 dagen na het begin van de cyclus. (C) Op dag 8, de meeste van de vliegen in de popstadium. De onderste panelen B (B ') en C (C ') zijn vergrotingen van de vermelde gebieden in de bovenste panelen. (D) Volwassen vliegen voortgekomen uit de poppen 10 dagen na cyclus initiatie. (E) Volwassen vliegt binnen de bevolking kooi voordat het proces van het verzamelen van de embryo's op dag 15. De gelige materiaal op de vlieg voedsel zijn bevruchte eieren. (F) Embryo's (en een paar larven) verzameld op de bodem van de 100 meest grove zeef, na een hele kooi cyclus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. hele cyclus Collection Schedule. Figuur 2 toont de aanbevolen schema voor een volledige cyclus collectie. t = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Zuiverheid van 1 uur en 3 uur opeenvolgende collecties. Representatief beeld van embryo's verzameld op 1 uur (A) en 3 uur (B) na het toevoegen van een nieuwe dienblad met eten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| cyclus nummer | Opbrengst (g) |
| 1 | 10.3 |
| 2 | 9.5 |
| 3 | 10.3 |
| 4 | 12.7 |
| 5 | 10 |
| 6 | 7.1 |
| Collection # | Lengte van de collectie (hr) | Opbrengst (mg) |
| 1 | 1 | 14.5 |
| 2 | 1 | 21.6 |
| 3 | 1 | 56.1 |
| 4 | 1 | 160.1 |
| 5 | 1 | 106.1 |
| 1 | 3 | 960 |
| 2 | 3 | 840 |
| 3 | 3 | 1250 |
Tabel 2 Rendement van 1 uur en 3 uur Opeenvolgende collecties. Tabel 2 toont de opbrengst aan 5 opeenvolgende verzamelingen 1 uur na het toevoegen van nieuwe voeding en 3 achtereenvolgende verzamelingen 3 uur na het plaatsen van een nieuwe plaat melasse.
Discussie
Beginnend met 1,5 g materiaal kan een opbrengst van verzamelde embryo tussen 7 en 13 g per cyclus verkrijgen. Om een dergelijke hoeveelheid materiaal te krijgen is het belangrijk om de juiste kweekomstandigheden voor alle fasen van de vlieg cyclus te handhaven.
De belangrijkste parameters zijn temperatuur en vochtigheid, die 24 ° C en 35% moet zijn. Als deze twee parameters niet constant in de normale omgeving van het laboratorium gehouden, zou een mogelijkheid zijn om de vlieg kooi te plaatsen in een incubator of klimaatkamer. Andere protocollen aanbevolen 70% vochtigheid en een constante 24 uur licht-donker cyclus om de opbrengst van de geproduceerde eieren 9,10 verhogen. Echter houden de luchtvochtigheid ongeveer 35% voorkomt bacteriële besmetting, en omdat het doel van dit protocol is uitsluitend de handhaving van een populatie kooi, worden de vliegen in de normale lichte omgeving van het laboratorium gehouden.
Een ander belangrijk punt is om di houdensturbances de volwassen vliegen zo laag mogelijk. Het kan raadzaam zijn om de kooi op een locatie gescheiden van de vlieg kamer houden kruisverontreiniging van andere vliegen te voorkomen.
Het kweken van grote populaties van transgene en mutant vliegt wordt afgeraden, omdat het erg moeilijk om hun zuiverheid te behouden en ze kunnen uitgesproken afwijkend paring gedrag vertonen in grote populatie kooien 14.
Een mogelijk probleem bij het kweken van Drosophila in grote hoeveelheden is de aanwezigheid van andere organismen zoals mijten en / of schimmels, die strijden om het eten en daardoor de opbrengst aan geproduceerde eieren te beperken. Om dit te vermijden, is het zeer belangrijk om alle schoon te houden, het wassen van de kooi, netten en dozen vliegen met water en zeep en gooi de wegwerpmateriaal (schuimdoppen) na elke cyclus. Om schimmel te verminderen groeit, propionzuur en fosforzuur worden toegevoegd in de natte gist bij de voorbereiding van de vlieg voedsel in stap1.2 en Tegosept bij de voorbereiding van de melasse lade in stap 3.1. Het is soms handig om plaats materialen zoals plastic doos of zeven in -20 ° C wanneer de tijd is kort en materialen kunnen niet direct worden gereinigd.
Een hele verzamelcyclus optreedt in 14-15 dagen, beginnend bij de embryo's worden uitgezet in de box vliegen en eindigend met de laatste lichting dag. Gedurende deze periode, is het raadzaam om een schema te organiseren om alle nodige maatregelen voor het behoud van een populatie vlieg kooi (afb. 2), beschreven in het gedeelte protocol herinneren. Vanaf de dag dat de eieren worden uitgezet, totdat de volwassen vliegen komen, dient alleen te inspecteren de plastic doos, en wanneer verpopping plaatsvindt, te plaatsen in de kooi. Daarna de vliegen moeten worden gevoed om 2-3 dagen tot embryo's worden geënt voor een nieuwe cyclus. In het gehele protocol, de langste dag bij het verzamelen en zaaien van de embryo's voor het starten van een nieuwe cyclus. EENs commentaar in het protocol, de beste ei opbrengst is 3-5 dagen na volwassen Eclosion, en ten slotte daalt 2 dagen later. Dit geeft ons enige flexibiliteit om de dag waarop de oogst van de eieren wordt uitgevoerd kiezen.
Als om welke reden dan ook de opbrengst van de verzamelde embryo's minder dan de gewenste basisbedrag (1,5 g) is, kan men altijd een nieuwe melasse bak toe te voegen en het verzamelen van meer eieren de volgende dag. Voor constante verzamelingen, is het aanbevolen om 2 kooien parallel behouden en indien grotere hoeveelheden embryo vereist, is het ook mogelijk om grotere kooien gebruiken. Bij het doen van een verzameling korte tijd, een manier om de opbrengst te verhogen is om te profiteren van de eierleggende burst in de ochtend.
Er zijn vele voordelen van het verzamelen van grote hoeveelheden van verschillende ontwikkelingsstadia. Zo verzamelde embryo's populatie kooien zeer succesvol gebruikt in immunoprecipitatie assays 6-8, massa collection van larvale weefsel van gedissocieerde larven heeft aangetoond een zeer goede bron voor 3C experimenten 4 en RNA preparaten 15 en koppen volwassen vliegen zijn gebruikt voor ChIP experimenten 16. Bovendien zijn volwassenen vaak nodig om vliegen extracten maken weefselkweek 17.
Een van de meest veelbelovende toepassingen van de kooi om materiaal voor high-throughput assays die de analyse en screening van genen, transcripts, eiwitten en metabolieten toe als reactie op de blootstelling van ziekteverwekkers, biologische moleculen, chemische stoffen en ioniserende straling. In deze grootschalige assays grote aantallen individuen vereist, en de vliegenpopulatie kooi beschreven kan zeer nuttig zijn om grote hoeveelheden materiaal in de verschillende fasen van de levenscyclus Drosophila hun analyse en screening 18 verkrijgen.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) voor het originele protocol en assistentie bij de initiële installatie en leden van het Lei-laboratorium voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door het Intramurale Onderzoeksprogramma van het Nationaal Instituut voor Diabetes en Spijsverterings- en Nieraandoeningen.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
| Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
| Drogisterijgist | Affymetrix | 23540 | |
| Filterpapier | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
| Schuimbuispluggen | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Lengte |
| Vliegpopulatiekooi | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Lengte. Inclusief de netten voor de kooi. |
| Vleesbakje | Genpak | 1002S (#2S) | 8,25 x 5,75 x 0,5 inches |
| Melasse | Grandma´s | ||
| Kunststof container | Rubbermaid | 4022-00 | |
| Kunststof film | Glad | ||
| Fosforzuur | Fisher Scientific | S 93326 | Toxisch. Behandelen in chemiekap |
| Propionzuur | Fisher Scientific | A258-500 | Toxisch. Behandelen in chemiekap |
| Roestvrijstalen zeef #100 | VWR | 57324-400 | |
| Roestvrijstalen zeef #40 | VWR | 57324-272 | |
| Roestvrijstalen zeef #30 | VWR | 57324-240 | |
| Sucrose | MP | 152584 | |
| Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
| Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
Referenties
- Lim, S. J., Boyle, P. J., Chinen, M., Dale, R. K., Lei, E. P. Genome-wide localization of exosome components to active promoters and chromatin insulators in Drosophila. Nucleic Acids Res. 41, 2963-2980 (2013).
- Ong, C. T., Van Bortle, K., Ramos, E., Corces, V. G. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 26, 148-159 (2013).
- Gonzalez, I., Mateos-Langerak, J., Thomas, A., Cheutin, T., Cavalli, G. Identification of regulators of the three-dimensional polycomb organization by a microscopy-based genome-wide RNAi screen. Mol Cell. 8, 485-499 (2014).
- Magbanua, J. P., Runneburger, E., Russell, S., White, R. A variably occupied CTCF binding site in the ultrabithorax gene in the Drosophila bithorax complex. Mol Cell Biol. 35, 318-330 (2014).
- Maksimenko, O. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Res. 25, 89-99 (2015).
- Lei, E. P., Corces, V. G. RNA interference machinery influences the nuclear organization of a chromatin insulator. Nat Genet. 38, 936-941 (2006).
- Matzat, L. H., Dale, R. K., Moshkovich, N., Lei, E. P. Tissue-specific regulation of chromatin insulator function. PLoS Genet. 8, e1003069(2012).
- King, M. R., Matzat, L. H., Dale, R. K., Lim, S. J., Lei, E. P. The RNA-binding protein Rumpelstiltskin antagonizes gypsy chromatin insulator function in a tissue-specific manner. J Cell Sci. 1, 2956-2966 (2014).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of drosophila for protein biochemistry. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Roberts, D. B., Standen, G. N. The elements of Drosophila biology and genetics. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. , Oxford University Press. Oxford. 1-53 (1998).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: The laboratory setup. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Dahlberg, O., Shilkova, O., Tang, M., Holmqvist, P. H., Fb Mannervik, M. P-TEb, The super elongation complex and mediator regulate a subset of non-paused genes during early Drosophila embryo development. PLOS Genet. 13, e1004971(2015).
- Zhang, S. D., Odenwald, W. F. Misexpression of the white (w) gene triggers male-male courtship in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 6, 5525-5529 (1995).
- Chak, L. L., Mohammed, J., Lai, E. C., Tucker-Kellogg, G., Okamura, K. A deeply conserved, noncanonical miRNA hosted by ribosomal DNA. RNA. 21, 375-384 (2015).
- Moshkovich, N., Lei, E. P. HP1 recruitment in the absence of argonaute proteins in Drosophila. PLOS Genet. 12, e1000880(2010).
- Drosophila RNAi Screening Center [Internet]. , Available from: http://www.flyrnai.org/DRSC-PRC.html (2015).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63, 411-436 (2011).
Herprints en machtigingen
