Transarterial Toediening van Oncolytic Virussen voor Locoregionale Therapie van Orthotope HCC in Ratten

Samenvatting

Oncolytische virotherapieën zijn in ontwikkeling als nieuwe therapieën voor de behandeling van hepatocellulair carcinoom (HCC). Hier beschrijven we een methode voor locoregionale therapie van HCC via hepatische arteriële toediening van oncolytisch virus.

Samenvatting

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is een ziekte met beperkte behandelingsopties en een slechte prognose. In de afgelopen jaren hebben oncolytische virotherapieën zich bewezen als potentieel krachtige middelen om maligniteit te bestrijden. Vanwege de unieke dubbele bloedtoevoer in de lever, is het mogelijk om therapieën lokaal toe te passen op orthotopische levertumoren, die overwegend worden gevoed door arteriële bloedstroom. We hebben eerder aangetoond dat lever-arterielle toediening van oncolytische virussen resulteert in veilige en efficiënte transductie-efficiëntie van multifocale HCC-laesies, resulterend in significante verlenging van de overleving bij immuuncompetente ratten. Deze procedure bootst de toepassing van transarterielle embolisatie bij patiënten na, wat de standaard palliatief zorg is voor veel HCC-patiënten. De mogelijkheid om tumortherapieën via de leverarterie toe te dienen bij ratten, maakt een zeer geavanceerd preklinisch model mogelijk voor het evalueren van nieuwe virale vectoren in ontwikkeling. Hier beschrijven we het gedetailleerde protocol voor microdissectie van de leverarterie voor infusie van oncolytische virusvectoren om orthotopisch HCC te behandelen.

Inleiding

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is de vijfde meest voorkomende kanker in de wereld, en de derde belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde dood, waardoor het een belangrijke gezondheids-zorg ^1,2. Voor patiënten die niet in aanmerking komen voor resectie van de tumor, of die in afwachting van een levertransplantatie, locoregionale therapie waarbij transarterial embolisatie (TAE) of transarterial chemoembolization (TACE) worden toegepast als standaard palliatieve zorg ^3,4. Deze therapieën gebruik maken van de unieke eigenschap van de dubbele bloedtoevoer in de lever, waarbij tumoren bijna uitsluitend worden gevoed door de lever arteriële bloedstroom, terwijl de omringende lever het merendeel van de bloedtoevoer van de poortader ^5,6 krijgt.

Vanwege de extreem beperkte efficacies gevestigde therapieën voor HCC hebben oncolytische virussen ontwikkeld tot veelbelovende alternatieve therapeutica. JX-594, onlangs omgedoopt tot Pexa-Vec, is een thymidine-kinase verwijderd vaccinia vector, gewapend met granulocyt-macrophage-koloniestimulerende factor (GM-CSF), welke fase II klinische proef voor HCC ⁷ heeft voltooid. Meer recent is een recombinant vesiculair stomatitis virus vector (VSV) die humaan interferon-bèta een fase I klinische proef aangegeven voor sorafenib-refractaire HCC (NCT01628640). Als oncolytische virussen dichter op de goedkeuring voor klinische toepassing voor HCC patiënten bewegen, de noodzaak van een effectieve toedieningsroute targeten multifocale ziekte is evident. Terwijl systemische toediening nauwelijks worden door inefficiënte tumor transductie kan intratumorale toepassingen de werkzaamheid van de therapie om de geïnjecteerde tumor beperkt, waardoor uninjectable microscopische lesies vatbaar voor ziekteprogressie.

We hebben een wijze om de hepatische slagader bij ratten oncolytische virus therapie mogelijk in een locoregionale wijze orthotopische HCC streefdoel. We hebben aangetoond dat deze toedieningsweg resulteert in veilige en effective transductie van multifocale HCC knobbeltjes, wat resulteert in aanzienlijke overleving verlenging in immuuncompetente ratten ^8-10. Hier beschrijven we de methode hebben, ontleden en injecteren in de leverslagader bij ratten. Een schema van de procedure is weergegeven in figuur 1 (eerder gepubliceerd ⁹⁾

Protocol

Let op: De volgende stappen zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van onze instelling en de lokale overheid van Beieren, Duitsland. Alle pogingen om dit protocol te reproduceren dient te geschieden in naleving met de lokale richtlijnen voor de humane behandeling van dieren, zoals gedicteerd door lokale dierlijke zorg en het gebruik commissie. Bijvoorbeeld, veel instituten vereisen dat steriele handschoenen worden gedragen tijdens knaagdier chirurgie. Bovendien moet het werk met virussen worden uitgevoerd in overeenstemming met de plaatselijke regelgeving, zorg voor persoonlijke en milieuveiligheid. Zorg moet worden genomen om goed te ontdoen van verontreinigd afval en instrumenten en werkruimte schoon te maken (dat wil zeggen, autoclaaf en reiniging met een geschikt antiviraal ontsmettingsmiddel volgens de instructies van de fabrikant).

1. Voorbereidingen Voordat u aan Surgery

1. Steriliseren chirurgische instrumenten (dat wil zeggen, in de autoclaaf).
2. Verdun het virus aan de KREDIETENiate concentratie die varieert afhankelijk van de toxiciteit van het specifieke virus wordt gebruikt en de gevoeligheid van de rat stam.
   Opmerking: Bijvoorbeeld, bij gebruik van vesiculaire stomatitis bij mannelijke Buffalo ratten, we meestal injecteren 10 ⁷ pfu in een volume van 1 ml, dat is de maximaal getolereerde dosis in dat model.
   1. Prefill het virus (met behulp van aseptische techniek) in 1 ml injectiespuiten, en bevestig 30 G naalden, zorg ervoor dat de lucht uit de spuit en naald.
3. Bereid de chirurgische ruimte met alle materialen en apparatuur die nodig is, en spuit het gebied met ethanol te desinfecteren. Vul een klein bakje met steriele zoutoplossing (0,9% NaCl) voor het bevochtigen van gaas swabs en wattenstaafje applicators.

2. Voorbereiding van de Rat

1. Dien een pijnstiller (zoals aangegeven door de lokale dierlijke zorg en het gebruik commissie), bij de juiste dosis 30 minuten voor het begin van de chirurgische procedure. Bijvoorbeeld,toedienen van een hoge dosis metamizol (100-200 mg / kg).
2. Verdoven van de rat, door middel inhalering (isofluraan) of injecteerbare (dwz een mengsel van Medetomidine (0,15 mg / kg), Midazolam (2 mg / kg) en fentanyl (0,005 mg / kg), ook bekend als MMF) anesthesie. Dien isolflurane door middel van een verdamper bij 1-3% en aan te passen als nodig is om een ​​normale ademhaling en de hartslag te houden.
   1. Voordat u verder gaat, ervoor zorgen dat de rat volledig verdoofd en niet in staat om pijn te voelen door knijpen de voet pad en observeren voor een reactie.
   2. Breng een veterinaire oogzalf tot droog te voorkomen tijdens de anesthesie.
3. Scheer de buik van het borstbeen naar beneden tot net boven de genitaliën met een kleine veterinaire tondeuse. Zorg ervoor dat een glad scheerresultaat te bereiken zonder de huid te beschadigen.
4. Bevestig de rat aan de chirurgische bed met behulp van tape op de voor- en achterpoten en, bij gebruik van inhalatie-anesthesie, plaatst u de snuit in een voldoende omvang neuskegel. Plaats een verwarmingselementonder het rat lichaamstemperatuur te handhaven. Ontsmet het buikgebied met een chirurgische kwaliteit ontsmettingsmiddel, gevolgd door een spoeling alcohol en toepassing van een antisepticum verf.

3. Laparotomie

1. Met behulp van een kleine gebogen scalpel, zoals # 15, een kleine verticale incisie in de huid laag direct langs de middellijn. Verleng de incisie tot aan de xyphoid proces. Vervolgens incise de spierlaag door voorzichtig te tillen met een paar Adson tang om een ​​scalpel incisie en trek de insnijding tot aan de xyphoid proces chirurgische schaar. Let erop dat de organen van de buikholte doorboren of de kleine bloedvaten aan weerszijden van de xyphoid nadelig beïnvloeden.
2. Plaats een retractor over de buik om de spieren en huid te verspreiden en bloot de hele buikstreek.
3. Bevochtig twee 7,5 x 7,5 cm ² gaaskompressen met steriele fysiologische zoutoplossing en gespreid over één boven de chirurgischeopening en een over de bodem, zoals getoond in figuur 2A.

4. Isolatie van de leverslagader

1. Met behulp van twee bevochtigde katoenen applicator doekjes bevochtigd met een steriele fysiologische zoutoplossing, de darmen en blindedarm til uit de buikholte, en leg ze op de lagere gaas swab. Vouw het gaas naar de organen vochtig te houden en om ze uit de weg te houden.
2. Met behulp van twee bevochtigde katoenen applicator wattenstaafjes, voorzichtig til de linker laterale lever kwab, die de meest overheersende kwab gezien in dit stadium zal zijn. Flip de lob omhoog en, met een paar kleine lente schaar, dwars door de vezelige membraan aan de onderzijde van de nok, zodat de lob volledig opgeklapt worden en rusten bovenop de eerder geplaatste gaas doekje. Vouw het gaas swab over de kwab om het te houden op zijn plaats.
3. Verder met de volgende kwab (de voorste nucleus caudatus), die nu de voorkwab gezien. met the behulp van een dissectie microscoop en fijne tang, ontleden het dun membraan rond de kwab om deze los en laat hem vrij omhoog worden omgedraaid. Plaats de lob onder het gaas staafje met de linker laterale lob.
4. Let op de achterste Spiegelse kwab, die nu zichtbaar zal zijn. Herhaal stap 4.3 met het achterste Spiegelse kwab volledig te ontleden en te spiegelen naar boven en in het gaas samen met de eerder geplaatste lever lobben.
5. Net onder de oorspronkelijke positie van de Spiegelse kwab, vindt de leverslagader, die nu zichtbaar en gemakkelijk te herkennen aan zijn sterke pulsaties zal zijn. Naar aanleiding van de slagader naar de anatomische rechts, let op de dikke membraneuze materiaal verduistert de gastroduodenale en de juiste lever slagaders uit het zicht. Met behulp van fijne tang, til dit materiaal en voorzichtig scheuren, zorg ervoor dat alle kleine schepen in dit gebied te voorkomen. Gebruik katoenen applicator doekjes om eventuele bloeden die kunnen optreden te stoppen.
   1. Zoek het eenrterial takken, die duidelijk zichtbaar met behulp van een stereomicroscoop bij de membranen goed worden ontleed.
6. Met behulp van twee fijne, atraumatische pincet voorzichtig ontleden de leverslagader, gastroduodenale slagader en de juiste leverslagader zodat zij bevrijd zijn van de omliggende membranen (Figuur 2B).

5. Bereiding van de slagader voor injectie

1. Laat een 7-0 Prolene hechtdraad onder de gastroduodenale slagader, en gebruik een micro-naaldhouder een vaste ligatuur binden aan het distale uiteinde, net boven de bifurcatie (zie Figuur 1 voor de juiste plaatsing). Rekening met ongeveer 2 inch hechtmateriaal nog op de uiteinden en klem ze een naaldhouder aan de slagader onderwezen trekken, zoals in figuur 2C.
2. Plaats een kleine klem op de leverslagader om de bloedstroom (figuur 2C) tijdelijk te blokkeren.
   Let op: Dit is important massale bloeden te voorkomen wanneer de naald uit de arterie verwijderd. Bovendien zal de blokkering van arteriële bloedstroom mogelijk maken langzamere virustoediening en betere transductie efficiëntie.
   1. Belangrijk: Werk snel om de hoeveelheid tijd die bloedstroom beperken gestopt - de injectie toe en daaropvolgende ligatie van de arterie binnen 5 min van klemmen van de leverslagader.
3. Als het mogelijk is, de vergroting van de microscoop ontleden, zodanig dat de gastroduodenale slagader is in scherpe focus en lijkt groot genoeg om nauwkeurig steek de 30 G naald. Plaats de naald van de injectiespuit in het lumen van de gastroduodenale slagader en druk langzaam op de zuiger.
   Noot: De juiste plaatsing van de naald resulteert in de geïnjecteerde oplossing direct stroomt door het juiste hepatische slagader en naar de lever.
   1. Voer de injectie heel langzaam aan transductie efficiëntie te maximaliseren.
4. Zodra bij injectievolume is toegediend, langzaam trek de naald uit de slagader.
   Opmerking: Er mag geen bloeden uit de injectieplaats zijn. In het geval dat bloeding optreedt, betekent dit dat de klem niet goed geplaatst en moeten snel worden aangepast.

6. Closing

1. Laat een tweede 7-0 Prolene hechtdraad onder de gastroduodenale slagader, en bind een tweede permanente ligatuur boven de injectieplaats.
2. Verwijder de klem van de leverslagader. Controleer of de bloedstroom door de juiste leverslagader naar de lever is hersteld.
   1. Snijd de losse eindjes van de ligaturen.
3. Controleer dat er geen bloeden, voordat de darmen en de lever naar de buikholte. Zorg ervoor dat de appendix wordt teruggebracht in de oorspronkelijke oriëntatie.
4. Hechtdraad de spier en huid in afzonderlijke lagen met behulp van 4-0 vicryl hechtmateriaal met een gebogen naald. plaats Continuous hechtingen ongeveer 1 mm van elkaar en trek stevig vast.
   1. Tijdens de fase hechten, dienen een analgeticum zoals buprenorfine (0,05 mg / kg).
5. Verwijder rat uit anesthesie. Als isofluraan is gebruikt, moet de rat bewustzijn binnen enkele minuten terug te krijgen. Als MMF is gebruikt als een injecteerbare verdoving antagoniseren met een subcutane injectie van Atipamezole (0,75 mg / kg), Flumazenil (0,2 mg / kg) en naloxon (9,12 mg / kg), die de effecten van de verdoving omkeren en laat de dieren weer bij bewustzijn komen binnen 20 minuten. Houd ratten warm met een infrarood opwarming lamp tijdens de eerste fase van ontwaken.
   1. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven.
   2. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.
6. Monitor ratten post-operatief voor pathologische tekenen van angst, en de followmet pijnstillers zoals vereist door de lokale dierlijke zorg en het gebruik commissie. Zo kan buprenorfine worden toegediend bij 0,05 mg / kg elke 12 uur.

Resultaten

Met ervaring, kan een bijna 100% slagingspercentage (wat betekent dat de slagader met succes werd ontleed en geïnjecteerd, en het dier overleefde chirurgie) worden bereikt. Echter, de gezondheidsstatus van de rat voorafgaand aan de operatie (mate van tumorlast onderliggende leverfunctie, enz.) Vanzelfsprekend een rol spelen bij de uitkomst van de chirurgische ingreep. Na de operatie kunnen ratten worden verwacht voorbijgaand gewichtsverlies en een geringe, voorbijgaande stijging...

Discussie

Hoewel directe intratumorale injectie ongetwijfeld de eenvoudigste methode is om efficiënte tumortransductie van een enkele tumorknoop te bewerkstelligen, vertegenwoordigt hepatische arteriële infusie een ideale toedieningsroute om multifocale, orthotopische HCC aan te pakken. Deze methode is zowel veilig als effectief gebleken voor de behandeling van HCC bij immuuncompetente ratten met oncolytische virussen. Bovendien, aangezien HCC-patiënten routinematig worden behandeld door transarterielle toediening van chemo-embo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dierenklinische tondeuse	Aesculap	GT415	Kleine, snoerloze trimmer ideaal voor het verwijderen van vacht uit chirurgisch gebied
Stereomicroscoop	Zeiss	Stemi SV6
30 G naalden	Braun	4656300	30 G x ½”
1 ml spuiten	Braun	9161406V	Tuberculinese spuit
Wegwerp scalpel	Feather	2975#15	#15 mes
Standaard chirurgische schaar	Fine Science Tools	14001-13	Scherp/blunt, voor het openen van huid en spier
Adson pincet	Fine Science Tools	1101-12	Met tanden, voor het grijpen van huid en spier
Alm retractor	Fine Science Tools	17008-07	Met blunt tanden, voor het spreiden van de buikholte tijdens de chirurgie
Gaasjes	Lohmann & Rauscher	18504	7,5 cm x 7,5 cm, moet voor gebruik worden geautoclaveerd
Wattenstaafjes met katoen	Lohmann & Rauscher	11970	Steriel
Fijnpunt pincet	Fine Science Tools	11063-07	0,4 mm, gebogen punt, voor het dissecteren van de leverarterie
Vannas veerschaar	Fine Science Tools	91500-09	Voor delicaat snijden
Micro-naaldhouder	Fine Science Tools	12076-12	Voor het ligaren van de gastroduodenale slagader
Naaldhouder	Fine Science Tools	12005-15	Wolfraamcarbide kaken
7-0 Prolene hechtdraad	Ethicon	8648H	Polypropyleen hechtdraad met gebogen naald, voor het ligaren van de gastroduodenale slagader
4-0 Vicryl hechtdraad	Ethicon	V3040H	Met gekromde naald bevestigd
Infrarood verwarmingslamp	Beurer	IL11	Voor het handhaven van de lichaamstemperatuur na de operatie