Methodenartikel

Voorbereiding van de Rat Oligodendrocyte Progenitor culturen en kwantificering van Oligodendrogenesis gebruik van Dual-infrarood fluorescentie Scanning

DOI:

10.3791/53764

⸱

17 februari 2016

 ,  ,  , 
1Neurology, Johns Hopkins University, School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oligodendrocyten zijn de myeliniserende cellen van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren en kweken van hun precursoren, oligodendrocyten-voorlopercellen, uit rattencortex, evenals een snelle en betrouwbare kwantitatieve methode om oligodendrogenese in vitro te evalueren als reactie op experimentele factoren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efficiënte oligodendrogenese is het therapeutisch doel van een aantal onderzoeksgebieden, waaronder ruggenmergletsel, neonatale hypoxie en demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose en transversaal myelitis. Myelinisatie is niet alleen noodzakelijk om snelle impulspropagatie binnen het centrale zenuwstelsel te faciliteren, maar ook om trofische ondersteuning te bieden aan onderliggende axonen. Oligodendrocyte voorlopercellen (OPC's) kunnen in vitro worden bestudeerd om factoren te identificeren die de differentiatie van oligodendrocyten kunnen bevorderen of remmen. Tot op heden hebben veel van de beschikbare methoden om dit proces te evalueren ofwel grote aantallen cellen vereist, waardoor het aantal omstandigheden dat op elk moment kan worden onderzocht wordt beperkt, of arbeidsintensieve methoden van kwantificering. Hier beschrijven we een protocol voor de isolatie van grote aantallen zeer zuivere OPC's samen met een snelle en betrouwbare methode om oligodendrogenese uit meerdere omstandigheden gelijktijdig te bepalen. OPC's worden geïsoleerd uit P5-P7 neonatale rattencortex en in vitro gedurende drie dagen gekweekt voorafgaand aan differentiatie. Vier dagen na differentiatie wordt oligodendrogenese beoordeeld met behulp van een dual-infrarood fluorescentie-scantest om de expressie van het myeline-eiwit te bepalen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efficiënte zenuwgeleiding in het centrale zenuwstelsel (CNS) vereist myelinisatie door oligodendrocyten axonen. Tijdens de ontwikkeling oligodendrocyten ontstaan ​​uit een pool van oligodendrocyten progenitorcellen (OPC) die worden verondersteld te migreren van de ventriculaire zone van de zich ontwikkelende neurale buis voorhersenen en 1. Na de migratie OPCs differentiëren tot rijpe, myeliniserende oligodendrocyten die niet alleen vergemakkelijken efficiënte impuls voortplanting, maar ook axonen met trofische ondersteuning 2. De volwassen CNS handhaaft een overvloedige populatie van OPC's die gedurende de grijze en witte stof dat ongeveer 5-8% van alle cellen 3 worden gedispergeerd. Na een demyeliniserende belediging, OPC's migreren naar de plaats van het letsel, vermenigvuldigen en differentiëren om verloren of beschadigde myeline op blootgestelde axonen te vervangen. In sommige instellingen ziekte / schade dit proces blijkt inefficiënt of kan volledig mislukken 4. Terwijlchronische demyelinatie wordt verondersteld om toe te voegen aan de ziektelast, efficiënte oligodendrogenesis en remyelinisatie kan de symptomen 5 verlichten. Het is ook van belang geweest OPCs studeren in vitro het effect van experimentele factoren oligodendrogenesis bepalen.

Inzicht in de verschillende fasen van oligodendrocyt differentiatie is mede mogelijk gemaakt door de identificatie van de fase waarin specifieke cel markers. Zelfvernieuwende vroege progenitorcellen worden gedefinieerd door hun expressie van bloedplaatjes afgeleide groeifactor-alfa (PDGFRα), neurale / glia antigen 2 (NG2) A2B5 en 6-8. Als OPC initiëren hun differentiatie programma en zich terugtrekken uit de celcyclus, ze downregulate expressie van deze markers en beginnen om eiwitten indicatief voor premyelinating oligodendrocyten waaronder cyclisch-nucleotide 3'-fosfodiesterase (CNPase) en O4 uiten. Tenslotte, hun differentiatie tot meer gerijpte oligodendrocYtes wordt gekenmerkt door de expressie van myeline-geassocieerde proteïnen, zoals myeline geassocieerd glycoproteïne (MAG), proteolipide proteïne (PLP) en myeline basisch eiwit (MBP). MBP is een intracellulair perifeer membraaneiwit en een belangrijke component van de myelineschede. Muizen ontbreekt MBP het ontwikkelen van een ernstige fenotype waarin CNS myelinisatie is aanzienlijk gedaald leidt tot tremoren, convulsies en vroege dood 9,10. Deze belangrijke rol van MBP in myelinisatie heeft geleid tot het gebruik als een marker van oligodendrocyt differentiatie in vitro en in vivo 11.

Kwantificering van MBP kunnen worden bereikt met behulp van verschillende methoden. RT-PCR en Western blot analyse mogelijk voor het kwantificeren van MBP niveaus onder verschillende behandelingsregimes. Immunocytochemie is een gemeenschappelijke kwalitatieve aanpak die ook kwantitatief kan zijn wanneer de camera op basis van microscopie benaderingen worden gebruikt. Hoewel deze systemen zijn betrouwbaar en fundamenteelde studie van oligodendrocyt differentiatie, zij elk hun eigen nadelen die hun gebruik bij het screenen van geneesmiddelen te beperken. Ten eerste, de hoeveelheid primaire OPC's die nodig zijn voor RT-PCR en Western blotanalyse vermindert het aantal variabelen die gelijktijdig kunnen worden onderzocht. Terwijl de eis cel voor immunocytochemie is veel lager, moet veel tijd besteed worden aan elk experiment als kwantificering is het doel. Talrijke afbeeldingen moeten worden vastgelegd en vervolgens gekwantificeerd experimentele analyse te vergemakkelijken. Deze kanttekeningen worden belangrijke belemmeringen om te overwegen voor studies die high throughput beoordeling nodig. Hier beschrijven we een werkwijze die fundamentele aspecten van zowel immunocytochemie en Western blot werkwijzen voor myeline kwantificering gebruikt, terwijl zowel het aantal cellen nodig en tijd kwantitatieve analyse zou reduceren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) en de Johns Hopkins School of Medicine.

1. Bereiding van Assay platen, Stock Solutions, en OPC Base Media

Opmerking: De rat OPC base (Sato) beschreven media is afgeleid van eerder gepubliceerde studies 12,13. Alternatieve media formuleringen kunnen ook compatibel met deze procedure.

  1. Resuspendeer poly-L-lysine (PLL) in een concentratie van 10 ug / ml in steriel gedeïoniseerd water. Pipetteer 400 ul van de verdunde PLL in elk putje van een zwarte wand, duidelijke bodem 24 well weefselkweek rang schotel.
  2. Coat weefselkweek gerechten gedurende 2 uur in een 37 ° C weefselkweek incubator of 's nachts in een 4 ° C koelkast.
  3. Aspireren PLL beklede schalen van ten minste 20 min voor plating. Laat de resterende PLL drogen van de put door het plaatsen van platen met 24 putjes met het deksel gedeeltelijk kier in een weefselkweekkap. Controleer of de putten volledig droog zijn voordat plating geïsoleerde OPC's. Cellen zullen niet houden aan plastic dat vloeibare PLL aanwezig is.
  4. Bereid N-acetyl-L-cysteïne (NAC) voorraadoplossing (1000x): Los 100 mg N-acetyl-L-cysteïne (NAC) in 20 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM). Aliquot en bewaar bij -20 ° C.
  5. Bereid hydrocortison stockoplossing (1000x): Voeg 1 ml van ethanol tot 1 mg hydrocortison en werveling op te lossen. Voeg 19 ml DMEM, meng de oplossing, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C. De toevoeging van hydrocortison het basismedium is aangetoond dat de overleving van gliacellen 14 verbeteren.
  6. Bereid d-Biotine voorraadoplossing (5,000x): Los 2,5 mg d-biotine in 50 ml PBS. Voeg 2/1 x 5 pl druppels van 0,1 N NaOH om te helpen bij het oplossen. Aliquot en bewaar bij -20 ° C.
  7. Bereid Insuline stock-oplossing (100x): Los 25 mg Insuline in 50 ml van weefselkweek kwaliteit water. Voeg 250 ul of 1 N HCl en meng tot oplossing helder. Steriliseren met een 0,22 urn filter en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 6 weken.
  8. Bereid Sato voorraad-oplossing (100x):
    1. Bereid progesteron voorraadoplossing (25 ug / ul): Los 2,5 mg progesteron in 100 ui ethanol.
    2. Bereid natriumseleniet voorraadoplossing (400 ng / pl): Los 4 mg natriumseleniet in 100 pl 0,1 N NaOH. Voeg 10 ml van DMEM en meng.
    3. Tot 100 ml DMEM, voeg 1 g menselijk apo-transferrine, 1 g runderserumalbumine en 160 mg putrescine en meng tot volledig oplossen. Voeg 25 ul van progesteron voorraad oplossing, 1000 ul van natriumseleniet voorraad-oplossing, en meng. Aliquot en bewaar bij -20 ° C.
  9. Bereid OPC basismedium: per 100 ml DMEM (met 4,5 g / l D-glucose, L-glutamine en 110 mg / l natriumpyruvaat), voeg 100 pl NAC, 100 gl hydrocortison, 20 pi d-biotine, 1 ml insuline, 1 ml Sato voorraad, 100 pi oligo-elementen B,2 ml B-27 supplement (50x) en 1 ml penicilline / streptomycine (100x). Steriliseren met een 0,22 urn filter en bewaar bij 4 ° C.
  10. Bereid PDGF-AA voorraadoplossing (1000x): Los 250 g in 12,5 ml PBS met 0,1% runderserumalbumine (BSA) aan een 20 ug / ml oplossing. Aliquot en bewaar bij -80 ° C.
  11. Bereid OPC proliferatiemedia: OPC basismedium gesupplementeerd met 20 ng / ml PDGF-AA.
  12. Bereid OPC differentiatie media: OPC basis media, aangevuld met 45 Nm triiodothyronine.
  13. Bereid kolombuffer: Aan 500 ml PBS, voeg 2,5 g BSA en 2 ml 0,5 M ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en breng de pH op 7,2. Steriliseren met een 0,22 urn filter en bewaar bij 4 ° C.

2. Rat Brain Dissection

Opmerking: P5-P7 rat pups worden in dit protocol. Elke rat pup cortex levert ongeveer 1,5-2,0 x 10 6 A2B5 positieve cellen.

  1. Steriliseren alle dissectie apparatuur met een 2506; C verwarmd kraal sterilisator.
  2. Voeg 15-20 ml PBS (zonder Ca2 + en Mg2 +) tot 50 ml conische buizen. Een 50 ml conische buis is voldoende voor 3-4 rattenpup cortex. Plaats 50 ml conische buizen op ijs. Gebruik 50 ml conische buizen in blokjes gesneden cortex weefsel te houden tijdens dissectie.
  3. Voeg koud PBS tot een 10 cm Petrischaal. Deze schotel wordt gebruikt voor dissectie onder de lichtmicroscoop.
  4. Offer ratten door onthoofding met grote chirurgische schaar. Spray kop met 70% ethanol.
  5. Pak het Whole Brain
    1. Met behulp van kleine schaar knippen de huid beneden de middellijn en achter de oren en schil de huid flappen terug. Snijd de schedel langs de middellijn vanaf de hersenstam en eindigt bij de ogen. Wees voorzichtig niet te diep snijden om de structuur van de onderliggende cortex behouden.
    2. Voeg twee zijdelingse sneden inferieur aan de kleine hersenen door het invoegen kleine chirurgische schaar in het foramen magnum. Maak een extra snede tussen de ogen, miererior naar de olfactorische bollen.
    3. Zorgvuldig pellen elke helft van de schedel terug. Verwijder de hele hersenen en plaats in de 10 cm petrischaal gevuld met koud PBS.
  6. Onder de dissectie lichtmicroscoop, verwijder de olfactorische bollen en cerebellum met fijne chirurgische pincet.
  7. Flip de hersenen, zodat het ventrale oppervlak is zichtbaar onder de lichtmicroscoop.
  8. Met behulp van fijne tang rechte uitvoeren van een stompe dissectie door het plaatsen tang gesloten uiteinden tussen de cortex en de hypothalamus tot een diepte ongeveer 2/3 van de hersenen. Eenmaal forceps hun plaats zodat de uiteinden open. Herhaal dit voor het andere halfrond.
  9. Plagen de cortex van de hypothalamus en middenhersenen regio's.
  10. Verwijder de hypothalamus, thalamus, middenhersenen door houden van de middenhersenen aan zijn achterste oppervlak en peeling richting het voorste uiteinde van de hersenen. Sever de voorste verbindingen.
  11. Verwijder de hippocampus van uitwendige afschilferen en vervolgens verbreken de verbinding met decortex met behulp van fijne gebogen dissectie pincet.
  12. Verwijder de resterende striatum door de sloop van het uit de onderliggende cortex naar buiten diagonale beweging met behulp van fijne gebogen dissectie pincet.
  13. Verwijder eventuele bloedvaten en hersenvliezen van het ventrale oppervlak van de cortex.
  14. Flip de hersenen, zodat het dorsale oppervlak zichtbaar is. Hersenvliezen en bloedvaten moet duidelijk zijn. Peel hersenvliezen uit de onderliggende cortex met behulp van fijne dissectie pincet. Begin peeling van de olfactorische locatie gloeilamp bijlage.
  15. Compleet stappen 2,4-2,14 voor een totaal van 3-4 rat pups.
  16. Plaats 3-4 ontleed rattenpup cortex in een droge petrischaal en hak met een gesteriliseerde scheermesje tot 1 mm x 1 mm brokken worden bereikt. Verzamel materiaal door spoelen schotel met PBS uit een 50 ml conische buis (stap 2) en plaats weer op ijs.

3. enzymatische en mechanische Tissue Dissociatie

Opmerking: deze stap is een papaïne-gebaseerde neurale dissociatie kit aanbevolen. Met behulp van Neural Dissociatie Kit (P), worden speciale stappen die optimaal zijn voor OPC isolatie beschreven.

  1. Bereid de eerste dissociatie enzym door verdunning enzym P met de geschikte buffer. De inhoud van elk 50 ml conische (1 monster) wordt opnieuw gesuspendeerd met een totaal van 1950 pl enzymmengsel. Plaats in het enzymmengsel in een 37 ° C bad gedurende 10 minuten.
    Voorbeeld 1: 1900 ui buffer + 50 gl enzym papaïne
  2. Spin alle 50 ml conische buisjes met 3-4 blokjes rattenpup cortex bij 300 g gedurende 3 min.
  3. Zuig het supernatant en voeg 1950 ul enzym oplossing voor elk monster buis en opsplitsen van de pellet door het buisje en schudt zachtjes.
  4. Incubeer in een 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 15 minuten onder voortdurend draaien buis.
  5. Gedurende de laatste 5 minuten van de incubatie bereiden tweede enzymmengsel A. Verdun het enzym in een geschikte buffer. Een totaal van 30 pl wordt toegevoegdelk 50 ml kegelvormige monsterbuis.
    Voorbeeld 1: 20 gl buffer + 10 gl enzym
  6. Zodra incubatie voltooid voeg 30 ul van het tweede enzymmengsel aan elke buis en zwenken om te mengen.
  7. Met een glazen Pasteur pipet verbonden met een pipet controller mechanisch dissociëren het weefsel door pipetteren 10-15 keer of totdat het weefsel stukken worden verkleind en de oplossing troebel. Breng het monster op de 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 15 min met een continue rotatie.
  8. Pipet elk weefsel homogenaat monster 10-15 keer met behulp van een 1 ml pipet.
  9. Pipet elk weefsel homogenaat monster 15-20 keer met behulp van een 200 ul pipet
  10. Geeft alle monsters naar de 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 10 minuten onder voortdurend draaien.
  11. Voeg 10 ml PBS (met Ca2 + en Mg2 +) aan elk monster en filtreer het homogenaat door een 40 urn filter poriën geplaatst op een 50 ml buis. Spoel de filter met een extra 1-2 ml PBS.
  12. Zwembad alle homogenaat monsters in een 50 ml conische buis en het verwerven van een algehele celgetal.
  13. Na het uitvoeren van de celtelling, splitsen homogenaat gelijkmatig in 15 ml conische buizen (1 buis voor elk monster). Centrifugeer gedurende 10-12 minuten bij 300 x g.

4. Anti-A2B5 Bead Application, Column Zuivering en Plating

  1. Voer berekeningen voor kolom buffer en anti-A2B5 microbolletjes. Voeg 7 ul Column buffer voor elk 1 x 10 6 cellen. Voeg 2 ul anti-A2B5 microkralen voor elk 1 x 10 6 cellen.
  2. Combineer alle monsters door resuspenderen van de cellen in een totaal volume van 10 ml kolombuffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10-12 min.
  3. Resuspendeer de celpellet in de juiste hoeveelheid kolombuffer zoals berekend in stap 4.1. Als de pellet is groot en los, alleen maar ongeveer de helft van het volume kolombuffer de anti houdenlichaam de juiste concentratie in de cel resuspensie.
  4. Incubeer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  5. Add anti-A2B5 microbolletjes (berekend in stap 4,1), keer herhaaldelijk en incuberen bij 4 ° C gedurende 30-60 min. Keer de buis een paar keer om de 10 min. Langere incubatietijden kunnen cel opbrengst te verhogen maar kan toenemen aspecifieke binding.
  6. Voeg 5 volumes kolombuffer. Als de cellen worden opnieuw gesuspendeerd in een volume van 1 ml, voeg 5 ml kolombuffer, dat wanneer de cellen worden opnieuw gesuspendeerd in 2 ml, voeg 10 ml van kolombuffer.
  7. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.
  8. Bepalen hoeveel LS kolommen nodig zijn voor de zuivering. Een LS kolom volstaat 15-20 x 10 6 cellen totaal.
  9. Resuspendeer de celpellet in 1000 pl kolombuffer per LS kolom gebruikt.
  10. Prime elke LS kolom door toevoeging van 5 ml van kolombuffer. Verzamel de stroom door een 50 ml conische buis. Zodra de kolom buffer volledig geleid door de bovenste kamer, toepassen 1000 pi van de celsuspensie elke kolom en laat de cellen doorlopen door zwaartekracht.
    Opmerking: Als de dichtheid van de cellen te hoog is, kan de kolom trage werking.
  11. Onmiddellijk na de celsuspensie door de kolom gepasseerd, voeg langzaam 3 ml kolombuffer elke kolom ongebonden cellen te wassen. Als de was gemakkelijk loopt door de kolom (1 druppel voor elke 30-45 sec), was nog tweemaal met 3 ml van kolombuffer.
  12. Verwijder elke kolom en plaats deze op een 15 ml conische buis. Voeg 5 ml kolom buffer en duik de buffer door de kolom in een snel tempo met behulp van de plastic zuiger, dat wordt geleverd met de kolom. Kelderen zal de gebonden cellen die hen vrijgeven van de kolom te verwijderen.
  13. Verhogen zuiverheid uitvoeren van het monster door een tweede ronde van LS kolommen. Met een derde van het aantal kolommen tijdens de eerste doorgang. Prime de kolom met 5 ml van kolombuffer.Laat de kolom buffer door middel van de bovenste kamer te passen.
  14. Aangezien het volume van celsuspensie veel groter zal zijn, gelijkmatig 1000 gl celsuspensie toepassing op elke kolom en laat de suspensie door de bovenste kamer van de kolom stroomt voor bijvullen met een extra 1000 pl.
  15. Zodra de celsuspensie volledig is toegepast op de tweede kolommen, was 2-3 maal met 3 ml van kolombuffer.
  16. Verwijder elke kolom en plaats deze op een steriele 15 ml conische buis. Voeg 5 ml kolombuffer en dompelen de buffer met de plastic zuiger die verpakt is met de kolom. Kelderen zal de gebonden cellen die hen vrijgeven van de kolom te verwijderen.
  17. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 12-15 min. De pellet moet verschijnen compact.
  18. Resuspendeer de celpellet 5-10 ml voorverwarmde OPC proliferatiemedia (OPC basismedium gesupplementeerd met PDGF-AA 20 ng / ml).
  19. Tel de cellen met een hemocytometer.
  20. Plate de cellen. Verdun de cellen aan 60.000 cellen / ml met OPC proliferatiemedia. In elk zwart, heldere bodem 24 vormt Pipetteer 500 ul cellen langs de kant van de bron tot 30.000 cellen per putje te verkrijgen. Meng de cellen door schudden van de plaat horizontaal met behulp van een cijfer acht beweging. Als uitvoeren van de bepaling van 48, 96 of 384 putjes, voeg 15.000, 7500 of 1500 cellen per well, respectievelijk. Deze aantallen kunnen worden aangepast afhankelijk van de individuele specificaties plaat.
  21. Bereid een aparte plaat voor de Dag 0 basislijn controle culturen. Deze bedieningsplaat moeten met 4% paraformaldehyde zoals beschreven in paragraaf 5.7, wanneer onderscheid wordt gemaakt op dag 0.
  22. Cultuur van de cellen in OPC proliferatiemedia bij 37 ° C gedurende 3 dagen zonder wisselen van materiaal.

5. Inductie van OPC Differentiatie en Bevestiging met 4% paraformaldehyde

Opmerking: Bij het testen van het effect van kleine moleculen op oligodendrogenesis, we routinematig dissolve drugs in dimethylsulfoxide (DMSO) tot 1000x aandelen die vervolgens bij -80 ° C worden opgeslagen en direct verdund in SATO media tot een eindconcentratie van 0,1% DMSO verkrijgen bereiden. We hebben geen veranderingen in zowel OPC proliferatie of differentiatie met deze concentratie DMSO waargenomen (gegevens niet getoond).

  1. Voorverwarmen OPC basismedium tot 37 ° C en ontdooien medicatie voorraden kamertemperatuur. Bij het uitvoeren van behandelingen in tweevoud, voor te bereiden van ongeveer 1,25 ml van media per behandelingsgroep in een 1,5 ml buis. Voor drievoudige monsters, gebruik 2 ml centrifugebuizen om rekening te houden speling.
  2. Bereid de behandeling mastermengsels voor repliceren putten door het verdunnen van de behandeling aandelen direct in OPC base media. Kort vortex of meng elke mastermix homogene verdeling van de behandeling.
  3. Bereid 45 nM triiodothyronine (T3) als de positieve controle en de geschikte drager als negatieve controle. Verdun 10 mM T 3 stock1: 1000 in 1 ml OPC basismedium en vervolgens verder verdund in de behandeling master mix de eindconcentratie van DMSO verlagen indien nodig.
  4. Zuig het materiaal uit de cultuur putten één behandeling groep tegelijk om te voorkomen dat het drogen van de cellen. Gebruik een 200 ul pipet tip over het uiteinde van de glazen Pasteur pipet vermijden afschrapen zwart materiaal van de zijkanten van de goot en in de cultuur.
  5. Voeg langzaam 500 pl behandeling mastermix langs de kant van de put onder toepassing van een 1 ml pipet.
  6. Incubeer de culturen voor de gewenste periode, het uitvoeren van een volledige media-uitwisseling met verse behandeling media om de 2-3 dagen. We routinematig zich aan een 30-40% MBP + cultuur na 4 dagen in differentiatie media.
  7. Aan het einde van de gewenste behandelingsperiode, vers bereid 4% paraformaldehyde (PFA) of ontdooien van een ingevroren voorraad tot kamertemperatuur. LET OP: PFA is uiterst giftig en moet worden bereid in een zuurkast.
  8. Aspireren de media en voeg langzaam 4001, l PFA aan de zijkant van de put om de cellen te repareren. Incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Zuig het PFA en voeg langzaam 500 ul steriel D-PBS (met Ca2 + en Mg2 +) aan de zijde van de put om de cellen te wassen. Herhaal het wassen in totaal twee keer. Niet zuig het laatste wasbeurt.
  10. Wikkel de plaat in parafilm en bewaar bij 4 ° C voor latere verwerking of direct doorgaan naar de volgende stap. Platen kunnen worden opgeslagen voor meerdere weken.

6. immunocytochemie Kwantificering van myelinebasiseiwit

Opmerking: Bij het uitvoeren vloeistofverwerking procedures in de 24 putjesplaten wordt aanbevolen snel werken om te voorkomen dat het drogen van de cellen. Hier is het gebruik van een multi-channel aspirator vacuum en multichannel pipet aanbevolen.

  1. Breng de plaat tot kamertemperatuur zuig de putjes en voeg 250 ul van D-PBS (met Ca2 + en Mg2 +) bevattende 0,1% Triton X-100 en 5%normaal geit serum (NGS). Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder zacht orbitaal schudden.
  2. Bereid de primaire incubatie-oplossing door verdunning monoklonaal anti-MBP-antilichaam 1: 1000 en konijn polyklonaal anti-actine antilichaam 1: 200 in D-PBS (met Ca2 + en Mg2 +) bevattende 5% NGS. Alternatief, konijn polyklonaal anti-Olig2 bij 1: 1000 kan worden gebruikt voor oligodendrocyten specifieke normalisatie in gemengde gliale kweken. Bereid genoeg primaire oplossing tot 250 ul per putje tegemoet te komen.
  3. Incubeer primaire antilichamen bij 4 ° C geïncubeerd gedurende 16-18 uur onder zacht orbitaal schudden.
  4. Zuig het primaire incubatieoplossing en was de cellen 3 x 10 min met 500 ul D-PBS (met Ca2 + en Mg2 +) bij kamertemperatuur onder zacht orbitaal schudden.
  5. Terwijl het wassen van de plaat, de voorbereiding van de secundaire incubatie oplossing door verdunning van anti-muis 680 en 800 anti-konijn antilichamen 1: 500 in D-PBS (met Ca 2+ en Mg 2+) met 5% NGS. Minimaliseer omgevingslicht blootstelling bij de voorbereiding van deze oplossing.
  6. Zuig het laatste wasbeurt en voeg 250 ul van secundaire incubatie-oplossing. Beschermt de plaat tegen licht en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder zacht orbitaal schudden.
  7. Zuig het secundaire incubatieoplossing en spoel de putjes 3 x 10 min met 500 ul D-PBS (met Ca2 + en Mg2 +) bij kamertemperatuur onder zacht orbitaal schudden.
  8. Scan de plaat via een beeldvormingssysteem opsporen van 700 nm en 800 nm fluorescentie emissies. Als uitgangspunt, stelt het middelpunt offset naar 3 en gevoeligheden tot 1,5 voor MBP, 5.0 voor actine en 3.5 voor Olig2. De gevoeligheid waarden nodig signaal overbelichting te voorkomen.
  9. Kwantificeren van de omvang van oligodendrogenesis gebruik van semi-automatische software-gebaseerde methoden.
    1. Met behulp van de software, zet de plaat analyse modus "24 Well" en lijn cirkels rond thij buitenomtrek van de gescande putjes. Stel de normalisering kanaal naar "800" en de uitvoer van de totale en de relatieve fluorescentie-intensiteiten van de 700 nm (MBP) en 800 nm (Olig2 / actine) kanalen.
    2. Verdeel de intensiteit bij 700 nm met de intensiteit op 800 nm om de genormaliseerde MBP expressie in relatieve fluorescentie-eenheden geven. Bereken het gemiddelde van herhaalde metingen en de schaal van de expressie van de Dag 0 + PDGF controles, dat bij de analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A2B5-positieve OPC zijn geïsoleerd door middel van positieve cel selectie met behulp van een magnetische scheiding column systeem. Voorafgaand aan de isolatiewerkwijze is de gehele hersenen verwijderd uit ratten die tussen P5 en P7. Zodra de gehele hersenen met succes wordt losgemaakt van de schedel, wordt de reukkwabben en cerebellum verwijderd met fijne chirurgische pincet (Figuur 1A). Om cerebraal corticaal weefsel isoleren de hypothalamus, thalamus en midbrain worden...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier gepresenteerde protocol beschrijft een snelle en betrouwbare werkwijze voor het isoleren en kwantificeren OPC rat in vitro oligodendrogenesis reactie op experimentele factoren. Met behulp van positieve selectie, zijn hoge opbrengsten van levensvatbare en pure OPC's direct gebruikt voor experimentele doeleinden. Deze methode stroomlijnt het isoleren, kweken en differentiatiestappen in een 1 week tijd en gefixeerde cellen kan geschikt bij 4 ° C gedurende enkele weken worden opgeslagen zonder verlies v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grant sponsor: National Institutes of Health; Grant nummer: R37 NS041435.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dissectiematerialen
PBS zonder Ca2+ en Mg2+Mediatech21-040-CV1x
10 cm Polystyreen Petri-schalenFisherbrand0857512
Licht DissectiemicroscoopMoticSM2-168
Dissociatiematerialen
Tube RotatorMiltenyi Biotec130-090-753Dissociatie Tube Rotator
Neural Tissue Dissociatie Kit (P)Miltenyi Biotec130-092-628Enzymatische Dissociatie Kit
PBS met Ca2+ en Mg2+Corning20-030-CV1x
40 μm Cell StrainerCorning352340
A2B5 Kolomzuivering 
Anti-A2B5 MicrobeadsMiltenyi Biotec130-097-864Bead Gebonden A2B5 Antilichaam
LS KolommenMiltenyi Biotec130-042-401Magnetische Selectie Kolommen
EDTACorning46-034-Cl2 mM
PBS met Ca2+ en Mg2+Corning20-030-CV1x
Bovine Serum Albumine Sigma-AldrichA96470.50%
Kweekmaterialen
PDGF-AAPeproTech Inc100-13A20 ng/ml
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD2650Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine Sigma-AldrichT639745 nM
Clemastine fumaraat zoutSigma-AldrichSML0445-100MG1 μM
Quetiapine hemifumaaraat zoutSigma-AldrichQ3638-10MG1 μM
N-acetyl cysteïneSigma-AldrichA91655 μg/ml
ProgesteronSigma-AldrichP878360 ng/ml
Poly-L-lysineSigma-AldrichP152410 μg/ml
PutrecineSigma-AldrichP750516 μg/ml
NatriumselenietSigma-AldrichS526140 ng/ml
HydrocortisonSigma-AldrichH013550 ng/ml
d-BiotineSigma-AldrichB463910 ng/ml
InsulinSigma-AldrichI66345 μg/ml
Apo-TransferrineSigma-AldrichT1147100 μg/ml
Bovine Serum AlbumineSigma-AldrichA4161100 μg/ml
Trace Elements BCorning25-022-Cl1x 
B-27 SupplementLife Technologies175040441x 
Penicillin/StreptomycinLife Technologies151401221x 
DMEMLife Technologies11995-0651x 
24-well Zwarte Visiplate met dekselPerkin Elmer1450-605Weefselcultuurkwaliteit
Immunoctytochemie en Kwantificering
PFASigma-Aldrich100-13A4%
Triton X-100Sigma-Aldrich787870.10%
Normal Goat SerumJackson Immuno Research005-000-1215%
muis monoklonaal anti-MBPBiolegendSMI-99P1:1,000 Verdunning
konijn polyklonaal anti-ActinSanta Cruz BiotecnologySC-72101:200 Verdunning
konijn polyklonaal anti-Olig2MilliporeAB96101:1,000 Verdunning
geit anti-muis 680RDLicor926-680701:500 Verdunning
geit anti-konijn 800CWLicor926-322111:500 Verdunning
Alexa Fluor 594 geit anti-muisLife TechnologiesA110321:1,000 verdunning
Alexa Fluor 488 geit anti-konijnLife TechnologiesA110081:1,000 verdunning
Prolong Gold antifade met DAPILife TechnologiesP36931
DPBS met Ca2+ en Mg2+Corning21-030-CV
Licor Odyssey Clx InfraroodbeeldvormingssysteemLicor

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
  2. Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
  3. Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
  4. Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
  5. Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
  6. Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
  7. Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
  8. Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
  9. Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
  10. Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
  11. Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
  12. Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
  13. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
  14. Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
  15. Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
  16. Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
  17. Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
  18. Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
  19. Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
  20. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  21. O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
  22. Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
  23. Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Oligodendrocyte voorloperscellenkwantificering van oligodendrogenesedissectie van de ratcortexmagnetisch geactiveerde cel sorteringdetectie van myeline basis prote neOlig2 immunocytochemiedifferentiatie van celculturenbehandeling met experimentele factorenfluorescentiebeeldanalyse

Gerelateerde artikelen