Dit artikel presenteert een snelle en eenvoudige methode voor het toedienen van bleomycine rechtstreeks in de muis luchtpijp via intubatie. Belangrijkste voordelen van deze werkwijze zijn dat het zeer reproduceerbaar, gemakkelijk onder de knie, en vereist geen gespecialiseerde apparatuur of lange hersteltijden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een verbeterde werkwijze voor snelle intubatie van de trachea in muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ondanks enkele anatomische en fysiologische verschillen, blijven muismodellen een essentieel hulpmiddel voor het bestuderen van longziekten bij mensen. Bleomycinetoxiciteit is een veelgebruikt model om zowel acute longschade als fibrose te bestuderen, en er zijn meerdere methoden ontwikkeld voor het toedienen van bleomycine (en andere toxische stoffen) in de longen. Veel van deze benaderingen, zoals transtracheale instillatie, hebben echter inherente nadelen, waaronder de noodzaak van sterke anesthetica en overlevingschirurgie. Dit artikel rapporteert een snelle, reproduceerbare methode van intratracheale intubatie die milde inhalatieanesthesie, visualisatie van de luchtpijp en het gebruik van een surrogaat spirometers om de blootstelling te bevestigen omvat. Als bewijs van concept werden 8-12 weken oude C57BL/6 muizen ofwel 2,0 U/kg bleomycine of een gelijkwaardig volume PBS toegediend, en zowel schade als fibrotische eindpunten werden na de blootstelling gemeten. Deze procedure stelt onderzoekers in staat om een groot aantal muizen in een relatief korte periode te behandelen met weinig kosten en minimale zorg na de procedure.
Inleiding
Ondanks sommige anatomische en fysiologische verschillen, 1 muismodellen verder waardevol voor het modelleren van de menselijke biologie en pathogenese. 2 Vanuit husbandry oogpunt te zijn, muizen gemakkelijk te hanteren, een lage broedtijd, een versnelde levensduur en zijn relatief goedkoop naar huis. Met de ontwikkeling van verschillende genetische stammen en strategieën (bv., Conditioneel knock-outs, reporter muizen-lineage tracing benaderingen, enz.), Alsook de vele beschikbare reagentia (bijv., Antilichamen, recombinante eiwitten, remmers, etc.), zijn muizen een essentieel model gewerveld organisme menselijke homeostase en ziekteprocessen ontdekken geworden. 3
Muizen zijn bijzonder waardevol voor het bestuderen longaandoeningen, waaronder acute longbeschadiging (ALI) en pulmonale fibrose. 4 ALI bij mensen kan worden veroorzaakt door trauma, verwonding of sepsis en wordt gekenmerkt door epitheliale enendotheliale lek (bv., oedeem), ontsteking en ontluikende fibrose. Bij veel patiënten ALI ontwikkelt tot de ernstige vorm, acute respiratory distress syndrome (ARDS), wat vaak leidt tot fibrose en dood door respiratoir falen. 5,6 Longfibrose is een progressieve, fatale pathologie gekenmerkt door de overmatige depositie van extracellulaire matrix , met name type I collageen, wat leidt tot verminderde longfunctie. 7,8 Toediening van bleomycine (BLM) is de meest gebruikte en best gekarakteriseerde voorbeeld voor het induceren van ALI en fibrose bij proefdieren. 9 Hoewel BLM-geïnduceerde longfibrose bij knaagdieren doet herhalen niet volledig menselijke fibrotische fenotypes, 10 muizenstudies met dit model hebben geleid tot de ontdekking van vele belangrijke factoren beïnvloeden het ontstaan en de progressie van ziekte. 11
Hoewel de exacte mechanisme (s) achter BLM geïnduceerde fibrogenese onbekend zijn, het initiëren van letselwordt gedacht dat het gevolg zijn van contact-afhankelijke DNA-breuken in de epitheelcellen die de geleidende luchtwegen en longblaasjes, en in het bijzonder type 1 pneumocyten. 12 De behoefte aan direct contact tussen BLM en de pulmonaire epitheel benadrukt het belang van een robuuste levering route en deze zorgen ook relevant voor een breed scala aan behandelingen gericht op het distale luchtwegen, waaronder recombinante proteïnen, antilichamen, siRNA, virussen, bacteriën, deeltjes, en meer. Orofaryngeale aspiratie (OPA) wordt algemeen gebruikt voor dit doel 13, maar een belangrijke tekortkoming van OPA is dat een gedeelte van het geleverde middel kan worden ingenomen in het maagdarmkanaal, hetgeen leidt tot onnauwkeurigheid in de toegediende dosering. Een andere veel gebruikte benadering is transtracheaal instillatie, die tracheostomie gaat onder zware verdoving de luchtpijp en instillatie van een middel bloot direct in de luchtwegen. 14 echter niet alleen kan een dergelijkeeen procedure ongewenst vanwege de invasiviteit, maar het is ook tijdrovend, vereist nogal wat training en veroorzaakt een sterke schade aan het ademhalingskanaal. 15,16 Verscheidene protocollen ontwikkeld die de directe toediening van agentia kan voordoen in de trachea zonder chirurgische ingreep, 16,17,18,19,20 maar deze werkwijzen omvatten verlengde herstelperiode door krachtige anesthetica, het gebruik van dure apparatuur (bijv., otoscope / laryngoscoop handel verkrijgbare procedure boards, fiber-optic draden, etc.), een overmaat van manipulatie in de mondholte en onzekerheid over de dosering.
Dit document beschrijft een relatief eenvoudige methode van toediening via intubatie die het mogelijk maakt een onderzoeker snel, goedkoop en betrouwbaar inboezemen een reagens in de muizen long met een beperkt risico van de resterende schade aan de omliggende weefsels.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De Institutional Animal Care en gebruik Commissies (IACUC) aan de Universiteit van Washington en Cedars-Sinai Medical Center hebben het dier werkzaamheden die nodig zijn voor deze studies goedgekeurd.
1. Voorbereiding
- Steriliseren zowel de stomp uiteinde pincet en de depressieve via autoclaaf.
- Met behulp van een biologische veiligheid kabinet, bereiden een werkvoorraad van BLM in PBS van het gevriesdroogde poeder. Sonificeer de oplossing gedurende 10 minuten bij 35 Khz zelfs menging te verzekeren.
Opmerking: Een totaal volume tussen 30 en 45 ul wordt aanbevolen pipetteren variatie op de lage kant en verstikking met grotere volumes voorkomen. - Bereid een schone werkruimte die ongeveer 1 m 2 onder de regeling zelf en aangewezen locaties voor kooien zowel voor als na de ingreep omvat.
- Bevestig de basis van de procedure bord om de bank direct voor de onderzoeker door tot 2 of 3 stroken laboratorium tape over de basis en underlying bank. Zie figuur 1 voor nadere specificaties over het maken van een bord.
- Bind een enkele lengte van formaat 4,0 hechtdraad tussen de twee positioneren schroeven van de procedure bord.
- Genereer een geïmproviseerde spirometer door het verwijderen en gooi de plunjer drie 1 ml injectiespuiten en afzetten van 60 pl PBS in de bovenkant van elk vat een luchtdichte afdichting. Zet de naaf van de katheter losjes aan een van de spuiten en leg het aan de ene kant van het bord.
- Aspireren 300 ul van lucht in een 1 ml spuit en leg het aan de ene kant van het bord.
- Snij een extra stukje tape ongeveer 6 centimeter in lengte en opzij leggen. Deze wordt gebruikt om het dier te bevestigen aan de plaat in stap 2,4.
- Opzetten van een isofluraan kamer. Bevestig O 2, isofluraan, en vacuüm op de juiste poorten op zowel de blootstelling kamer en de speling vacuüm. Als alternatief toedienen verdoving in een isofluraan-compatibele biologischeveiligheidskabinet.
2. intubatie
- Verdoven van de muis met isofluraan in de kamer tot het bewustzijn verliest en de ademhaling vertraagt tot een passend tarief. Een typische risico omvat 4% isofluraan en 2% O 2 gedurende 3 tot 4 min, en het ideale uitkomst 2-2,5 min sedatie. Dit komt overeen met een ademhalingssnelheid van 1 adem elke 2 sec.
- Tijdens het wachten op sedatie in te stellen, aspireren tussen 30 en 45 ul van BLM in een pipet en opzij leggen.
- Als u klaar bent, op te schorten de verdoofde muis door de bovenste snijtanden van de draad aan de positionering schroeven van de procedure platform. Zorg ervoor dat dorsale gedeelte van het dier ligt vlak tegen het platform oppervlak.
- Dat evenwel niet tot de ventilatie te beperken, plaats een stuk tape losjes over de lager (caudale) deel van de borstholte, net boven het middenrif. Plaatsing moet strak genoeg zijn om een goede uitlijning te handhaven tijdens het procedure, maar niet zo strak dat het de ademhaling beperkt.
- Schakel het belichtingstoestel tot tussen 80% en 100% intensiteit en richt de zwanenhals zodat deze 1-2 cm van het oppervlak van de huid, bij solar plexus. Controleer regelmatig het topje van de zwanenhals voor warmte te zorgen dat het niet de muis werkt verwonden.
- Die achter het platform, gebruik maken van de steriele, stomp uiteinde een tang om de tong te vinden. Let daarbij goed op de onderste snijtanden, zacht grip te voorkomen en trek de tong uit de mondholte.
- Met de resterende hand invoegen depressor en gebruiken om de tong plat tegen de bodem van de mondholte. Laat de tang, maar laat de depressor in de plaats voor de volgende twee stappen.
- Waar zich het licht, zodat de trachea is zichtbaar door geleiden van de zwanenhals proximaal vanaf het niveau van de solar plexus tot de bovenkant van de hoofdstam bronchiën bereikt.
Opmerking: In de luchtpijp kunnen gemakkelijk worden onderscheiden door de werking van de ademhaling, whilech zorgt ervoor dat het uitgezonden licht fluctueren in intensiteit. Wanneer correct gepositioneerd, wordt deze structuur waarneembaar in het axiale vlak als centraal pin licht met minimale omgevingslicht in de mondholte zelf. - Hoek de spuit, zodat het volgt de natuurlijke weg van de luchtpijp, en laat de 22-G catheter tip, met de bijgevoegde spuit met de druppel, recht in het lumen. De PBS bel zal beginnen te stijgen en dalen bij elke ademhaling na succesvolle plaatsing.
Let op: Deze actie kan door een aantal seconden worden vertraagd als gevolg van de diepe sedatie. - Voer de katheter een extra 5 mm. Verwijder de tong depressieve.
- Shift de spuit aan de andere hand, en het vastgrijpen van de hub, verwijder voorzichtig de spuit.
- Storting tussen 30 en 45 ul van BLM in het midden van het inwendige van de katheternaaf, sluit de tweede spuit en afzien 300 ul van lucht in de naaf.
- Vervang de tweedespuit met de eerste de luchtbel PBS dat. De bel zal blijven stijgen en dalen als de procedure succesvol is uitgevoerd.
3. Post-procedurele Care
- Verwijder de katheter en tape en plaats het dier in een droge warme plaats totdat hij terug bij bewustzijn - meestal binnen een paar minuten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Geïntubeerd muizen werden dagelijks gecontroleerd op gewichtsverlies en nood, en offerde 4, 10 of 17 dagen later via intraperitoneale injectie van 2,5% 2,2,2 tribroomethanol. Bronchoalveolaire lavage (BAL) werd in drie wasbeurten PBS verzameld zoals elders beschreven 21 , en de rechter long werd gefixeerd in 10% formaline, ingebed in paraffine, en gekleurd met Masson's Trichrome door de Universiteit van Washington histologie en Imaging Core 22....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In gevallen waarin aërosol onpraktisch vanwege beperkte reagens beschikbaarheid, veiligheid, kosten of directe toediening trachea is een superieure werkwijze voor het afgeven van exogene middelen in de longen 16 transtracheale instillatie is op grote schaal gebruikt om dit te bereiken.; Zoals bij alle chirurgische ingreep, maar houdt ook de kans op complicaties als gevolg van de procedure zelf, en niet noodzakelijkerwijze het middel dat wordt ingeprent. 13 Daarom is het steeds ge...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Brian Johnson van de histologie en Imaging Core aan de Universiteit van Washington voor hulp met de trichroomkleuring en analyse. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies HL098067 en HL089455.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | Voor de beste resultaten, moet BLM worden gesuspendeerd in PBS, in aliquoten verdeeld en opgeslagen als eenmalig te gebruiken gelyofiliseerd aliquot |
| Blunt End Forceps | |||
| Tongue Depressor (d.w.z. gebogen Valleylab Blade Electrode, 2,4") | Covidien | E1551G | Maak voor gebruik een 45-graads bocht op 1,5 cm van de bladpunt. Een geschikte depressor kan ook worden gemaakt van elk metalen implement met vergelijkbare afmetingen. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 ml Slip-tip Wegwerp Tuberculinesering (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2 ml Pipettor en Filtertips | |||
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 gekoppeld met standaard dubbele Gooseneck verlichter | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | LED-verlichters met lager vermogen worden niet aanbevolen omdat ze de luchtpijp niet voldoende verlichten. |
| Intubatiebord | Zie Diagram 1. | ||
| Gekleurde labeltape: 0,5 in. Breed | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Zuurstof | |||
| Fosfaat-gebufferde zoutoplossing, 1X | Corning | 21-040-CV | Product moet steriel zijn |
| Niet-steriele zwarte zijde gebreide hechtdraad, 91,4 m, maat 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Anesthesieapparaat Isofluraan voor op tafel | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top Inductiemuis Isofluraan Kamer | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isofluraan, USP) Vloeistof voor inhalatie 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digitaal Pathologie systeem | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Kwantificeringskit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
Referenties
- Hyde, D. M., Hamid, Q., Irvin, C. G. Anatomy, pathology, and physiology of the tracheobronchial tree: emphasis on the distal airways. J Allergy Clin Immunol. 124, S72-S77 (2009).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Peters, L. L., et al. The mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet. 8, 58-69 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 485-497 (2012).
- Sharma, S. Acute respiratory distress syndrome. BMJ Clin Evid. 2010, (2010).
- Saguil, A., Fargo, M. Acute respiratory distress syndrome: diagnosis and management. Am Fam Physician. 85, 352-358 (2012).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal Immunol. 2, 103-121 (2009).
- Wuyts, W. A., et al. The pathogenesis of pulmonary fibrosis: a moving target. Eur Respir J. 41, 1207-1218 (2013).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Curr Opin Pulm Med. 17, 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? Int J Biochem Cell Biol. 40, 362-382 (2008).
- Myllärniemi, M., Kaarteenaho, R. Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis - preclinical and clinical studies of pirfenidone, nintedanib, and N-acetylcysteine. European Clinical Respiratory Journal. 2, (2015).
- Reinert, T., Baldotto, C. S. dR., Nunes, F. A. P., Scheliga, A. A. dS. Bleomycin-Induced Lung Injury. Journal of Cancer Research. 2013, 1-9 (2013).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Exp Lung Res. 32, 181-199 (2006).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Osier, M., Oberdorster, G. Intratracheal inhalation vs intratracheal instillation: differences in particle effects. Fundam Appl Toxicol. 40, 220-227 (1997).
- Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: Uses and Limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol (1985). 106, 984-987 (1985).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab Anim. 41, 128-135 (2007).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. J Vis Exp. , e50601(2013).
- Starcher, B., WIlliams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Daubeuf, F., Frossard, N. Performing bronchoalveolar lavage in the mouse. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 167-175 (2012).
- Li, Y., et al. Severe lung fibrosis requires an invasive fibroblast phenotype regulated by hyaluronan and CD44. J Exp Med. 208, 1459-1471 (2011).
- Grazioli, S., et al. CYR61 (CCN1) overexpression induces lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 308, L759-L765 (2015).
- Redente, E. F., et al. Tumor necrosis factor-alpha accelerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by targeting profibrotic lung macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 825-837 (2014).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. J Vis Exp. , e52261(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
