Retroductal Submandibulaire Gland Blaasinstillatie en gelokaliseerde gefractioneerde bestraling in een Rat Model van het speeksel hypofunction

Samenvatting

Hypofunctie van de speekselklieren, een belangrijk nadelig effect van radiotherapie in het hoofd- en nekgebied, vermindert de kwaliteit van leven van een patiënt. Het aantonen van de werkzaamheid van nieuwe therapieën in diermodellen is een voorwaarde voordat er een klinische overgang plaatsvindt. Dit protocol beschrijft retroductale toediening en lokale bestraling van submandibulaire rattenklieren.

Samenvatting

Normale weefsels die binnen de poorten van straling liggen, worden onbedoeld beschadigd. Speekselklieren raken vaak beschadigd tijdens radiotherapie van het hoofd en de nek. Onherstelbare celbeschadiging leidt tot een chronische verlies van speekselfunctie die basismondactiviteiten belemmert en het risico op orale infecties en tandbederf verhoogt. Hypofunctie van de speekselklieren en de complicaties ervan hebben een ernstige impact op het comfort van een patiënt. De huidige symptomatische behandeling van de aandoening is niet effectief, en er zijn nieuwere therapieën nodig om de aandoening te verlichten.

Speekselklieren zijn exocriene klieren, die hun afscheidingen via uitscheidingskanalen in de mond uitscheiden. Canulerings van deze kanalen biedt directe toegang tot de klieren. Retroductale toediening van een contrastmiddel aan de grote speekselklieren is een routinematige poliklinische procedure voor diagnostisch beeldvorming. Met behulp van een vergelijkbare procedure is lokale behandeling van de klieren haalbaar. Het uitvoeren van deze techniek in preklinische studies met kleine dieren stelt echter unieke uitdagingen. In deze studie beschrijven we de techniek van retroductale toediening in rattensubmandibulaire klieren, een procedure die werd verfijnd in het laboratorium van Dr. Bruce Baum (NIH)¹, en leggen we een procedure voor lokale klierontsteking vast.

Inleiding

Collaterale vernietiging van gezond weefsel vertegenwoordigt een aantal schadelijke bijwerkingen van kankerbehandelingen. Een deel of geheel van de grote speekselklieren dat de stralingsvelden liggen onvermijdelijk vernietigd. Daarom zijn de meeste patiënten die radiotherapie voor hoofd- en nekkanker, baarmoederhalskanker lymfoom of volledige lichaamsbestraling voor beenmergtransplantatie lijden een van de meest voorkomende en persistente schadelijke effecten van straling, speekselklier hypofunction ^2-6.

De fluïdum producerende acinaire cellen van de speekselklieren zijn uiterst gevoelig voor straling. Beschadiging van de speekselklieren veroorzaakt een drastische vermindering van de speekselproductie, een genoemd speeksel hypofunction voorwaarde. Chronische afname van speekselvloed schaadt belangrijke orale activiteiten zoals kauwen, slikken, spraak en smaak, maar de gevolgen van morbide intense pijn, mucosale tranen, dysfagie, opportunistische infecties en cariës verslechtert eenpatiënt welzijn en functie ^2,3.

Aangezien radiotherapie geassocieerde speeksel celverlies onomkeerbaar is, er geen corrigerende behandeling van xerostomie. De huidige behandeling die zich richt op assuaging symptomen met kunstmatige speeksel substituten en prosecretory drugs is niet effectief voor de lange termijn verlichting ^6. Hoewel verbeterde stralingsafgiftemiddelen technieken helpen verminderen de ernst van de aandoening, normaal weefsel toxiciteit en de complicaties ervan blijft een beperkende factor in kankerbehandeling ^6,7. Pre-emptive maatregelen om radiotherapie bijbehorende complicaties te voorkomen zijn dan ook steeds de norm. Radio-beschermende middelen die vangen vrije radicalen oxygen species, bevorder cel herbevolking, of verbetering van DNA-reparatie worden onderzocht om speeksel hypofunction ^8-11 af te wenden.

Afscheidingen van exocriene speekselklieren afwateren in de mond door de belangrijkste uitscheidingsmechanisme leidingen. Intra-orale infusen van The excretie leidingen voor injectie van contrastmiddelen wordt routinematig uitgevoerd als een poliklinische procedure. Met een soortgelijk benadering kan speekselklieren direct gericht voor het plaatselijk behandelen ^12. Naast het risico van systemische bijwerkingen heeft retroductal klier indruppeling voordelen toegevoegd. De monolaag opstelling van speeksel cellen aan de ductale boom maakt targeting van speeksel epitheelcellen, en het vezelachtige inkapseling van de klier werkt als een barrière om ongewenste therapeutische spreiding reduceren. In wezen, speekselklieren zijn optimaal geschikt voor gerichte behandeling van schildklier aandoeningen, zoals door straling veroorzaakte speeksel hypofunction.

Conventionele bestraling bij de behandeling van kanker is in betrekkelijk geringe doses (1,8-2,5 Gy / fractie / dag, vijf dagen per week) gedurende weken. Daarom is een radio-beschermende therapeutische dat de werkzaamheid tegen een langdurige regeling straling blijkt in experimentele modellen heeft een grotere klinische lager. Compromaliseerde speekselklieren functie na gefractioneerde bestraling is opgenomen in kleine dieren, maar stralingsbron, fractie dosis en protocollen die gebruikt zijn gevarieerd ^9,10,13.

Dit rapport stelt methoden voor retroductal levering aan en gelokaliseerde straling van rat onderkaakspeekselklier behulp van patiënt-relevante stralingsbron en fractie dosis.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de LSU Health, Shreveport, Animal Care en gebruik Comite en waren in overeenstemming met de NIH richtlijnen voor de zorg en het gebruik van proefdieren.

1. Canulatie van Rat Submandibulaire speekselklieren

1. Voorbereiding van de spuit-Tubing Assembly
   1. Snijd een 10 cm lengte van PE10 polyethyleen buis met een scalpel. Houd beide uiteinden van de buis tussen de wijsvinger en duim. Verwarm het middelste gedeelte van de buis boven een zachte vlam en voorzichtig rekken de zachte slang aan de lengte verdubbeld door aan beide zijden.
   2. Snijd de slang in het midden met een scalpel onder een hoek van 45 ^o 2 canules krijgen - elk met een taps toelopend uiteinde. Vouw de niet-taps toelopende einde van de canule door het aanbrengen van het over een 29 G naald van 0,5 cc insuline spuit.
   3. Verwijder de canule en trek 220 pi zoutoplossing in de injectiespuit. Tik om luchtbellen te verwijderen. Monteer de cannuleen over de naald en duw de zuiger om de lucht te verdrijven en te zorgen voor een vrije stroom van de oplossing door de canule. Zet het volume op 200 ul.
2. Intra-orale Canulatie van Submandibulaire Gland Duct
   LET OP: Autoclaaf instrumenten voorafgaand aan de procedure, en steriliseer in-tussen procedures in een hete kraal sterilisator.
   1. Weeg de Sprague Dawley ratten, en verdeel het berekende volume van ketamine (42 mg / kg) / xylazine (8 mg / kg) / acepromazine (1,4 mg / kg) mengsel in een injectiespuit.
   2. Zet het dier vast door grijpen de basis van de staart tussen de wijsvinger en de duim van een hand en schuiven anderzijds over het lichaam te grijpen. Rest de wijs- en middelvinger langs de zijkanten van het hoofd, terwijl houden de romp met de duim en de resterende vingers.
   3. Injecteren het verdovingsmiddel in de achterste ledematen spieren. Bevestig de diepte van de anesthesie door teen knijpen en ooglidreflex. Solliciteer eye smeermiddel tot droog, terwijl voorkomendier onder narcose.
   4. Plaats het dier op een speciaal ontworpen platform (figuur 1), en over de bovenste snijtanden op de dwarsbalk. Trek de onderkaak door looping een rubberen band rond de onderste snijtanden en verankerd aan het platform.
   5. Passeren een steriele hechtdraad door de tong en til het aan de vloer van de mond te verhogen. Klem de hechtingen met een hemostat, en gaat het over de dwarsbalk.
   6. Vouw de wangen met een op maat gemaakte wang strooier (figuur 1), en onder een stereomicroscoop vind sublinguale papillen op de vloer van de mond.
   7. Pak de taps toelopende einde van de voorgevormde PE10 slang met behulp van een delicate pincet. Voorzichtig manipuleren van de punt van de canule in de ductale opening op de sublinguale papillen. Bevestig plaatsing van de canule door rijgen deze 3-5 mm in het kanaal; ervoor te zorgen dat het passeert zonder enige belemmering.
3. Submandibulaire Gland Instillation
   1. Injecteren atropine (0,5 mg / kg) subcutaan in het nekvel en wacht 10 minuten voor een verlaging van speeksel afscheidingen.
   2. Bevestig de canule op het kanaal opening met een druppel cyanoacrylaat (lijm), en laten drogen. Wekt de oplossing in de gland (200 gl / klier) door langzaam indrukken van de zuiger met een snelheid van ~ 50 pl / min.
   3. Plet de buis met een hemostat, en verwijder voorzichtig de spuit. Bewaar de buis in het kanaal voor 30 - 60 minuten totdat het dier bijkomt. Verwijder de hechtdraad die de tong bezit.
   4. Breng het dier naar een aparte kooi, en het gebruik van een warmtelamp om het warm te houden tijdens het herstel. Laat de dieren niet onbeheerd achter te laten totdat het is weer bij bewustzijn te borstbeen recumbence handhaven.
   5. Nadat het dier is volledig ambulant, het huis van het op het terrarium met onbeperkte toegang tot voedsel en water.

2. Gelokaliseerde Gefractioneerde Bestralingvan onderkaakspeekselklier

1. Zet het dier vast zoals eerder beschreven, en verdoven met intramusculaire toediening van ketamine (33 mg / kg) / xylazine (6 mg / kg) / acepromazine (1 mg / kg) mengen in de achterste ledematen. Bevestigen diepte van anesthesie en smeermiddel op de ogen.
2. Plaats het dier in rugligging op de lineaire versneller tafelblad, en uit te breiden zijn nek door het kantelen van de kop. Richt het stralingsveld (3 cm spleetbreedte) omvatten voor het gebied van de onderrand van de mandibula naar de top van het borstbeen.
3. Plaats een 1 cm weefsel equivalente bolus over het gebied en de afstand tussen de stralingsbron en de bovenkant van de bolus tot 100 cm passen.
4. Bestralen het dier (2,5 Gy) met een 6 MV foton bundel een lineaire versneller. De dosering, veldgrootte, en de afstand van de stralingsbron naar de oppervlakte bolus zal de belichtingstijd te dicteren. In de set-up huidige, werden de dieren bestraald met een dosis van ~ 1 Gy / min.
5. Herhaalde blootstelling; 2,5 Gy / dag voor een totaal van 8dagen; 4 dagen / week met een 2-dagen interval ertussen. Houd het dier warm tijdens het herstel. Breng het dier naar een vivarium nadat het volledig ambulant.
6. Verzamel gestimuleerde submandibulaire klier speeksel 8 weken na straling om klierfunctie ¹⁴ te meten. Euthanaseren dieren onder verdoving door cardiale perfusie van koude 4% paraformaldehyde / fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7,2. Roeien onderkaakspeekselklier voor histologische en immunohistochemische analyses ^14.

Resultaten

Aanpassen van een minimaal invasieve techniek sialografie, lokale behandeling van grote speekselklieren haalbaar. Retroductal toediening bij ratten submandibulaire speekselklier werd geprobeerd door intra-orale canulatie kanalen Wharton's (figuur 2). Het speeksel leidingen van Wharton open op de sublinguale papillen op de bodem van de mond, maar de openingen niet gemakkelijk toegankelijk. Het inbrengen van de canule werd dan ook gedaan door zachte sonderen. Om ongewe...

Discussie

Speekselklieren ontvangen vaak stralingsdoses boven de drempel van weefsel herstel bij patiënten die radiotherapie voor hoofd-halskanker, electieve ablatie van de nek knooppunten, of regionale hematologische maligniteiten. Hoewel de vloeistof afscheidende acinaire cellen van de klier gedifferentieerd zijn, zij paradoxaal stralingsgevoelige. De secretoire functie laat binnen de eerste weken van straling en onherstelbare schade klier leidt tot een chronische lage speeksel output. Ter bestrijding van slechte klierfunctie e...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Intramedic Polyethyleen buis (PE10)	Becton Dickson	427401
1/2 cc Insuline-sering U-100	Becton Dickson	309306
Kunstmatige tranen	Miller Vet Supply	5098-9840-64
Hot Bead Sterilisator	Fine Science Tools	18000-45
Perma-Hand zijden hechtdraad	Ethicon	K833H
Graefe pincet	Fine Science Tools	11051-10
Olympus SZX16 Stereo Microscoop	Hunt Optics and Imaging
6 MV Lineaire Versneller	Elekta
Bolus - Huidloos	Civco	MTCB410
Warmtelamp	Braintree Scientific	HL-1 110V