Op subcellulair niveau worden signaleringsgebeurtenissen dynamisch gemoduleerd door ontwikkelings- en omgevingssignalen. Hier beschrijven we een protocol dat het tabaks-transiente expressiesysteem gebruikt om dynamische eiwit-eiwitinteracties te monitoren en om de ruimtelijke organisatie van signaaltransductie in plantencellen bekend te maken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Visualisatie dynamische signaleringsgebeurtenissen in levende cellen is een uitdaging. Breidden we een gevestigde transiënte expressie systeem, de biomoleculaire fluorescerende complementatie (BiFC) test in tabak epidermale cellen, uit het testen van eiwit-eiwit interacties aan het toezicht op de ruimtelijke verdeling van de signaaltransductie in plantencellen. In dit protocol, gebruikten we de BiFC test laten zien dat de interactie en de signalering tussen de Arabidopsis MAPKKK YODA en MAPK6 optreden op de plasmamembraan. Wanneer de scaffold eiwit BASL werd co-expressie, de YODA-MAPK interactie herverdeeld en ruimtelijk co-gepolariseerde van de GVB-BASL. Deze gemodificeerde tabak expressiesysteem maakt een snelle behandeling van signalering lokalisatie en dynamische veranderingen (minder dan 4 dagen) en is geschikt voor meerdere fluorescerende proteïne kleuren (ten minste drie). We hebben ook gepresenteerd gedetailleerde methodes om eiwit distributie (asymmetrische ruimtelijke lokalisatie, of "polarisatie" te kwantificeren;) In tabakscellen. Dit geavanceerde tabak uitdrukking systeem heeft het potentieel om op grote schaal worden gebruikt voor het snel testen van dynamische signalisatie gebeurtenissen in levende plantencellen.
Inleiding
Eiwitten interageren in een complex hiërarchisch netwerk en complexen vormen die een centrale rol in bijna alle biologische processen in een onvoorspelbare cellulaire omgeving spelen. Echter, van plantontwikkeling tot groeiresponsen, is er een gebrek aan handige hulpmiddelen die niet alleen snel maar ook efficiënt deze dynamische signaleringsgebeurtenissen op subcellulair niveau identificeren en controleren zijn.
De tijdelijke eiwitexpressie systeem tabaksblad epidermis heeft aantrekkelijke voordelen visualiseren fluorescerende eiwitten in levende cellen. Dit systeem biedt semi- in vivo omstandigheden die post-translationele eiwi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Plasmide Bouw
- Genereren van de constructen door klonering techniek zoals hiervoor beschreven 1,6.
- Gebruik eerst een high fidelity DNA polymerase met geschikte primers om de coderende sequenties van BASL amplificeren, YDA en MPK6 en subkloon ze in invoer vectoren. Vind de gedetailleerde protocol in 7.
- De dominante negatieve versies van MPK6 en YDA (DNmpk6 8 en DNyda 4 respectievelijk) genereert, gebruikt de datum van plasmiden MPK6 en YDA als template en introduceren puntmutaties door plaatsgerichte mutagenese methode 9.
- Om de constructen voor tabak voorbijgaand....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Celdood geïnduceerd door de hyperactieve MAPK signalering te voorkomen, werden de kinase inactieve versies van YDA (DNyda) en MPK6 (DNmpk6) van de co-expressie assay tabakscellen. Noch de interactie tussen DNyda en DNmpk6 onthuld door BiFC noch GVB-BASL zelf gegenereerde ongelijke verdeling patroon (figuur 3A-B). Wanneer echter CFP-BASL werd in de DNyda-DNmpk6 interactie pair, zowel CFP en YFP signalen werden herverdeeld om een sterk gepolariseerde wijze (Figuur .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Algemeen gebruik en mogelijke wijzigingen van de tabak Transient Expression System Signaaltransductie: Overexpressie van fluorescerend eiwit (FP) gemerkte eiwitten in de tabak epidermis met succes gebruikt voor het snel onderzoeken van eiwit subcellulaire lokalisatie in plantencellen. Echter, het bestuderen van dynamische signalisatie verdeling van eiwit complex in planta is een uitdagend onderwerp te ingewikkeld subcellulaire contexten, voorbijgaande eiwit-eiwit interacties en signaaltransduct.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
We danken Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) voor het bewerken van het manuscript. Het werk aan BASL-polariteitsvorming wordt ondersteund door subsidies van het U.S. National Institute of General Medical Sciences aan J.D. (R01GM109080) en Rutgers University.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40X objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
Referenties
- Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
- Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (200....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
