Een vereenvoudigde methode voor de Ultra-Low Density, Long-Term Primaire hippocampus Neuron Cultuur

Samenvatting

Cultures met lage dichtheid van primaire hippocampale neuronen vereisen meestal een glia-feederlaag om neurotrofe factoren te leveren en hun levensduur te ondersteunen. We beschrijven hier een vereenvoudigde methode om ultra-lage dichtheidsneuronen op glazen dekglasjes te kweken in de aanwezigheid van een neuronale feederlaag met hoge dichtheid, wat de onderzoek naar specifieke neuronaal-autonome mechanismen vergemakkelijkt.

Samenvatting

Het kweken van primaire hippocampus neuronen in vitro vergemakkelijkt mechanistische ondervraging van de vele aspecten van neuronale ontwikkeling. Gedissocieerde embryonale hippocampale neuronen groeien vaak succesvol op dekglaasjes met hoge dichtheid onder serumvrije omstandigheden, maar lage dichtheid kweken vereisen typisch een toevoer van trofische factoren door co-kweken ze met een glia voedsterlaag, bereiding kan tijdrovend zijn en moeizaam. Bovendien kan de aanwezigheid van glia interpretatie van de resultaten en te vermijden studies op neuron-specifieke mechanismen verwarren. Hier wordt een vereenvoudigde werkwijze voorgesteld voor ultralage dichtheid (~ 2000 neuronen / cm ^2), lange termijn (> 3 maanden) primaire hippocampale neuron cultuur die onder serumvrije omstandigheden en zonder glia Celdrager. Lage dichtheid neuronen gekweekt op poly-D-lysine beklede dekglaasjes en knipte hoge dichtheid neuronen gekweekt in een 24-wells plaat. In plaats van paraffine punten om een ​​ruimte te creëren between de twee neuronale lagen, kunnen de onderzoekers eenvoudig etsen plastic bodem van de put, waarop de hoge dichtheid neuronen bevinden, een microspace tot een lage dichtheid neuron groei. De co-kweek kan gemakkelijk worden gehandhaafd gedurende> 3 maanden zonder aanzienlijk verlies van lage dichtheid neuronen, waardoor de morfologische en fysiologische studie van deze neuronen vergemakkelijken. Om deze succesvolle cultuur aandoening te illustreren, worden de gegevens verstrekt aan overvloedig synapsvorming in lage dichtheid cellen na langdurige cultuur te laten zien. Deze co-cultuur systeem vergemakkelijkt ook het voortbestaan ​​van schaarse individuele neuronen gekweekt in eilanden van poly-D-lysine substraten en dus de vorming van autaptic verbindingen.

Inleiding

Groeiende hippocampale neuronen onder in vitro omstandigheden maakt waarneming en experimentele manipulatie van deze neuronen die in vivo anders mogelijk niet. Deze experimentele benadering wordt veel gebruikt om neuronale mechanismen van groei, polariteit, neuriet specificatie, handel en subcellulaire lokalisatie van eiwitten, synapsvorming en functionele rijping ¹ onthullen. Deze in vitro gekweekte hippocampale neuronen, wanneer geoogst late embryonale fase, relatief zuiver (> 90%) glutamaterge cellen piramidale morfologie ^2. Omdat neuronen in een 2-D oppervlak werden gekweekt onder in vitro omstandigheden, maakt deze werkwijze het observeren, zoals live imaging of immunocytochemie (ICC) kleuring via één brandvlak ^3; of manipulaties, zoals de behandeling met geneesmiddelen en transfecties ^3-6. Wanneer ze groeien bij hoge dichtheid, neuronen hebben de neiging om hoge tarieven van de overleving als gevolg van hogere co hebbenncentrations uitgescheiden groeifactoren naast voedings steun van de groeimedia, en vanwege neuriet contact-afhankelijke mechanismen ^7. Echter, een lage dichtheid hippocampus neuronen zijn wenselijk voor morfologische studies, waarbij een individueel neuron in zijn geheel kan worden afgebeeld of gekleurd voor ICC-analyse. Lage dichtheid neuronen zijn moeilijk te handhaven in kweek door gebrek aan ondersteuning paracriene en dus vereisen vaak trofische ondersteuning van een gliale (typisch corticale astrocyten) voedsterlaag, die moet worden opgemaakt voor neuron cultuur ^2. Als co-gekweekt met een gliale cel voedsterlaag worden lage dichtheid neuronen gekweekt op dekglaasjes en vervolgens omgedraaid bovenop de glia laag, zodat het lage dichtheid neuronen en glia tegenover elkaar. Een kleine afgesloten ruimte tussen glia en neuronen wordt gecreëerd door het plaatsen van paraffine stippen op de hoeken van de dekglaasjes derhalve tot een 'sandwich' layout ^2,8,9. De lage dichtheid neuronen zal groeien wedurende de beperkte ruimte tussen glia en het dekglaasje, die een tolerante micro-omgeving met geconcentreerde factoren uitgescheiden door neuronen en glia creëert. Deze aanpak levert een lage dichtheid, volledig ontwikkeld neuronen die redelijk uit elkaar geplaatst zijn, dus het vergemakkelijken van etikettering ICC of live-imaging studies.

Een duidelijk nadeel van neuron-glia co-cultuur, afgezien van tijdrovend en moeizaam, is dat het voorkomt onderzoek neuron-specifieke of cel-autonome mechanismen. Hoewel dit systeem is veel minder complex dan in vivo zenuwweefsel, glia effect op neuron ontwikkeling door middel van uitgescheiden, nog-niet-helemaal-gedefinieerde factoren kunnen de experimenten ¹⁰ beschamen. Daarom is in experimenten die het onderzoek naar neuron specifieke mechanismen, gedefinieerd kweekomstandigheden die te verwijderen serum en gliacellen steunlaag nodig zijn nodig. Een eerdere studie heeft kunnen kweken lage concentraties van neuronen (~ 9000 cellen / ^cm2) met een eree dimensionale hydrogel matrix ^11. Omdat een relatief zuivere neuronale populatie kan worden gekweekt met hoge dichtheid onder serumvrije omstandigheden zonder glial steun Onze hypothese is dat ultra-lage dichtheid van hippocampale neuronen in serumvrij gedefinieerd kweekmedium worden gekweekt door co-kweken ze met hoge dichtheid neuronen, in een manier die analoog is aan de conventioneel aangenomen neuron-glia co-cultuur. Inderdaad, hoge dichtheid hippocampale neuron culturen in een "sandwich" configuratie zijn onlangs gebruikt om een klein aantal gespecialiseerde endocriene magnocellulaire neuronen ¹² ondersteunen.

Daarom kan co-kweek met hoge dichtheid neuronen mogelijk lage dichtheid neuronen trofische factoren ondersteuning die voldoende is om de overleving op lange termijn mogelijk ontvangen. Dit protocol van het kweken van ultra-lage dichtheid neuronen werd dus geformuleerd en gevalideerd. Het protocol kan worden uitgevoerd binnen een enkel experiment, door het bereiden van een hoge dichtheid (~ 250.000 cellen / ml) dispelde hippocampale neuronen, en dan het maken van een verdunning tot een dichtheid ~ 10.000 neuronen op / ml (~ 3000 neuronen / dekglaasje of ~ 2000 neuronen / cm ^2), die veel lager dan de meeste gerapporteerde lage dichtheid cultures ^{2,3,9 , 11,13.} Dit kweekomstandigheid is losjes aangeduid als "ultra-low density cultuur en worden met" lage dichtheid "onderling verwisselbaar. De hoge dichtheid neuronen uitgeplaat op poly-D-lysine beklede 24-putjesplaten; terwijl de lage dichtheid neuronen gezaaid op poly-D-lysine beklede 12-mm dekglaasjes die in een andere 24-wells plaat geplaatst. De dekglaasjes met hechtende lage dichtheid neuronen worden omgedraaid op de top van de hoge dichtheid neuronen 2 uur later nadat de neuronen zijn afgedaald en aan de dekglaasjes. Bovendien, in plaats van paraffinewas stippen op de dekglaasjes boven de hoge dichtheid laag neuron verhogen, werd een 18 G naald gebruikt om de bodem van de 24 well platen etsen met twee evenwijdige strepen. De resulterende DISPLAced, grenzend aan plastics zorgen voor een verhoogde steun voor de dekglaasjes. Deze ruimte wordt consequent gemeten bij 150-200 urn, die voldoende zuurstof en kweekmedium uitwisseling mogelijk maakt, terwijl een micro-omgeving met geconcentreerd trofische factoren. Onder deze voorwaarde, de lage dichtheid neuronen groeien op grote schaal, en kan overleven dan drie maanden in de cultuur. Wanneer deze neuronen worden getransfecteerd met GFP plasmide na drie weken in cultuur worden de dendrieten rijkelijk bezaaid met dendritische stekels. Als bewijs van principe worden gegevens die aantonen dat deze co-kweeksysteem ondersteunt ultralage dichtheid kweken van hippocampale neuronen gezaaid op poly-D-lysine micro-eilanden, waarbij neuronen vormen autaptic verbindingen die onderzoek cel kan vergemakkelijken -autonomous, netwerk-onafhankelijke mechanismen.

Protocol

Alle experimentele procedures waarbij muizen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Arizona, en gelijkvormig aan NIH richtlijnen.

1. Tissue Bron voor de hippocampus Neuron Cultuur

1. Prenatale muis pups voor hippocampus neuron cultuur te genereren, gebruiken time-zwangere muizen (C57Bl6 / J) die worden gefokt in huis ^17. De dag met een vaginale plug detectie wordt aangewezen als E0.5. De geplande oogsttijd voor cultuur is E16.5-E17.5.
   Opmerking: Dit protocol beschrijft kweken van twee 24-well platen van twee hoge dichtheid neuronen co-kweken met lage dichtheid neuronen (48 dekglaasjes totaal). Voor meer platen en reagentia kunnen dienovereenkomstig worden geschaald.

2. 24-well platen Voorbereiding voor High Density Neuron culturen

Opmerking: Voer de volgende stappen (2-3) de dag vóór de geplande oogst embryo.

1. Breng twee 24 goedplaten in de celkweek kap, opent u de individuele verpakking.
2. Sluit een 18 G naald in een 1 ml plastic voor eenmalig gebruik spuit.
3. Houd de spuit en richt de naaldpunt ~ 1 mm links naar het midden van de bodem van de put. Toepassen matige kracht (~ 250 g) aan de bodem van de put (~ 1 mm) te etsen. Een groef wordt gevormd en de kunststoffen verplaatst zal een verhoogde ondersteuning boven de vlakke bodem goed oppervlak te vormen. Etch andere ~ 1 mm lange parallelle groef ~ 1 mm rechts van het midden van de bodem op een gelijkaardige manier.
4. Herhaal deze stap voor alle putjes van de twee 24-well platen. De twee 24-well platen voor hoge kweekdichtheid zijn nu klaar voor bekleden met poly-D-lysine (zie stap 3.8 hieronder).

3. Coverslips Voorbereiding voor Low Density Neuron culturen

1. Gebruik 12-mm diameter # 1 ronde glazen.
2. Plaats 50 dekglaasjes in een diameter van 100 mm steriele plastic petrischaaltje, en dompel dekglaasjesin 20 ml 70% ethanol. Plaats deze petrischaal op een roterend platform met matige (70 rpm) rotatiesnelheid voor een uur. Verwijder 70% ethanol en vervolgens vervangen door een verse partij van 70% ethanol. Roteren en was nog een uur.
3. Gooi 70% ethanol reinigingsmiddel. Voeg steriel water (gefilterd door 0,2 um filter eenheid). Spoel de dekglaasjes rigoureus door het draaien van de petrischaal met de hand. Spoel drie keer, telkens vervangen door vers steriel water.
4. Plaats de petrischaal met dekglaasjes in een steriele celkweek kap met laminaire stroming. Zuig het spoelwater door het vacuüm lijn, en voeg 10 ml gefilterd steriel water om de dekglaasjes onder te dompelen. De dekglaasjes moet steriel zijn en het oppervlak moet voldoende schoon zijn voor poly-D-lysine coating.
5. Open twee 24-wells platen uit hun individuele verpakking en plaats ze in de kap.
6. Zet het vacuüm lijn in de kap. Sluit een 200 ul pipet tip om het vacuüm lijn, en gebruik maken van een GCBsor de punt snijden om een ​​grotere opening te creëren.
7. Gebruik een fine-tip # 5 pincet te halen dekglaasjes van de petrischaal, een voor een, en gebruik het vacuüm lijn naar de dekglaasje drogen. Plaats dan een dekglaasje in elk van de putjes van de 24-well plaat. Het 50 gereinigde dekglaasjes moet genoeg zijn om elk van de putjes van de twee 24-well platen vullen.
8. Verdun het poly-D-lysine stockoplossing (1 mg / ml) in werkoplossing (0,1 mg / ml) met boraatbuffer (pH 8,5). Voor de vier 24-wells platen (waaronder twee high density platen met geëtst onder), bereid 30 ml totaal werkoplossing.
9. Voeg 300 pi 0,1 mg / ml poly-D-lysine work oplossing in elk putje met dekglaasjes. Zorg ervoor dat de dekglaasjes worden volledig ondergedompeld in oplossing. Zo niet, gebruik dan de # 5 pincet tip naar beneden te drukken dekglaasjes tegen de bodem van de put, en gebruik de tip om poly-D-lysine oplossing voor al het oppervlak van de dekglaasjes te dekken te begeleiden. Visueel te inspecteren alle dekglaasjes om su te makenre geen lucht gevangen zat tussen de plaat en dekglaasjes.
10. Voeg 300 pi 0,1 mg / ml poly-D-lysine work oplossing in elk putje van de hoge dichtheid kweekplaat met geëtste bodem. Hand gedraaid om de oplossing te verspreiden naar de gehele bodem van de put omvatten.
11. Het geven van de vier platen met poly-D-lysine om de incubator en incubeer O / N.

4. Wassen en Pre-conditioning Platen voor Cultuur

Opmerking: De volgende stappen (4-9) worden uitgevoerd op de dag van de oogst weefsel uitgevoerd.

1. Na incubatie / bekleding van dekglaasjes en 24-well platen O / N, brengen alle vier platen (twee dekglaasjes met donor, acceptor twee high density platen met geëtst kunststof bodem) in de cultuur kap. Gebruik het vacuüm lijn naar de poly-D-lysine oplossing te verwijderen.
2. Onmiddellijk na het verwijderen van de poly-D-lysine oplossing, voeg ~ 1 ml steriel water aan elk putje met een plastic pipet overdracht. Nadat alle putjes gevuldmet water, laat staan ​​voor 10 min. Water verwijderen door vacuüm, voeg 300 ul wasmedium in elk putje om de bodem van de put bedekken (met of zonder dekglaasjes). Laat niet de poly-D-lysine coating uitdrogen.
3. Geeft alle vier platen om de celincubator. De platen zijn klaar voor gebruik zodra de verspreide hippocampus neuronen worden bereid.

5. Bereiding van compleet kweekmedium en trypsine oplossing voor enzymatische digestie

1. Bereid 60 ml Compleet Cultuur medium door het mengen van de bestanddelen (zie Materials). Gebruik een 50 ml spuit verbonden met een 0,2 urn poriegrootte spuitfilter, filtreer de complete kweekmedium in twee 50 ml conische buizen. Elke buis bevat 30 ml compleet cultuurmedium.
2. In een afzonderlijke 50 ml conische buis, voeg -30 ml wasmedium (zie Materialen) en verwarm tot 37 ° C. Deze wordt gebruikt om het weefsel te wassen na enzymatische digestie.
3. Bereid de enzymdigestie medium. In een 15 ml conische buis, voeg 4,5 ml wasmedium en 0,5 ml 2,5% trypsine-oplossing en 50 gl 100X DNase I.
4. Plaats de complete cultuur medium, Wash medium, en enzym spijsvertering medium in een 37 ° C waterbad.

6. Voorbereiding van de chirurgische instrumenten

1. Steriliseren alle chirurgische instrumenten in een sterilisatie zakje: twee kleine schaar, een pincet en twee # 5 pincet.

7. Verwijdering van Brains uit E16.5-E17.5 muizenembryo's en Dissection van Hippocampi

1. Bereid twee 10-cm petrischalen gevuld met ijskoude steriele Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS).
2. Euthanaseren de muis dam met een intraperitoneale injectie van natrium fenobarbital (100 mg / kg in een volume van ~ 0,5 ml). Na injectie, zodra de dam reactie op teen knijpen verliest, offeren met cervicale dislocatie.
3. Spray buik gebied van de dam met 70% ethanol, en een 2-cm lange incisie langs de middellijn van de buik bloot te leggende baarmoeder.
4. Verwijder de embryo's en plaats individuele die in een 10-cm diameter petrischaal met koude ontleden HBSS buffer.
5. Houd de embryo bij de nek met behulp van een tang, en gebruik een kleine schaar om de eerste snede goed te maken in de middellijn onder het cerebellum niveau en de sectie over het hersenweefsel. Mis het embryo niet onthoofden.
   1. Steek de rechterzijde topje van de kleine schaar uit caudale regio die open wordt gesneden, helemaal door de rostrale deel van de embryonale hersenen (niet cross middellijn), en maak een snee aan de linkerkant op het niveau van de schedelbasis.
   2. Steek de linkerkant schaar tip opnieuw om een ​​snee aan de rechterkant te maken. Laat een smalle band van ongesneden schedel bot en huidweefsel aan de rostrale einde, zodat het hele brein opzij kan worden omgedraaid voor eenvoudige extractie.
   3. Gebruik de punt van de schaar om schep de embryonale hersenen in de HBSS oplossing. Inspecteer de hersenen onder een stereomicroscoop. De hersenen moet intact zonder bruto cut-o zijnff regio's.
   4. Herhaal deze stappen om alle embryo hersenen te verzamelen.
6. Verzamel alle intact hersenen in een nieuwe petrischaaltje met 20 ml koud HBSS buffer. Plaats de petrischaal onder een dissectie microscoop.
7. Bekijk de hersenen van buikzijde. Houd de hersenen met een tang aan het caudale einde, plaatst u een scherpe # 5 pincet schuin naar een snee tussen het midden rostrale punt en de staartvin-temporale regio. Herhaal dit voor het andere halfrond. Na het snijden afzonderlijke twee hemisferen met intacte hippocampus van de rest van de hersenstam weefsels.
   1. Herhaal deze procedure voor elk van de hersenen.
8. Zwembad alle ontleed hemisferen, en verwijder de hersenvliezen met behulp van twee paren van # 5 pincet.
9. Identificeer de ontwikkeling hippocampus als een gebogen structuur die is opgevouwen in de temporale kwab. Wissel de twee paren van pincet om de hippocampus te scheiden van aangrenzende corticale weefsels. Verzamelen en bundelen alle hippocampi weefsel (zie figuur 1).

8. enzymatische afbraak, scheiden in Single Neuronen

1. Met een plastic overdracht pipet alle ontleed hippocampus in de enzymatische digestie oplossing die 5 ml wasmedium met 0,25% trypsine + 1X DNase I in een 15 ml conische buis.
2. Plaats de buis in een waterbad en incubeer bij 37 ° C gedurende 25 min met tussenpozen voorzichtig omkeren van de buis eenmaal per 5 minuten.
3. Na 25 min, verwijder voorzichtig het enzym oplossing met behulp van een hand gehouden plastic pipet door aspiratie. Voeg warm Wash medium tot 10 ml en voorzichtig het weefsel te wassen door langzaam het buisje 5 keer. Verwijder de Wash medium, en voeg 10 ml Wash medium opnieuw voor een extra wasbeurt.
4. Verwijder de Wash medium, en voeg 3 ml vers warm Wash medium weer. Schud de buis met de hand rigoureus voor 15 keer aan de verteerde neuronen te verjagen uit het weefsel. Het medium moet troebel nadat de cellen een gewordenopnieuw gescheiden van het weefsel in het wasmedium. Verzamel de celsuspensie in een nieuwe 15 ml conische buis terwijl de resterende weefsel in de buis.
5. Voeg nog eens 2 ml Wash medium aan het weefsel, en voorzichtig de resterende weefsel te scheiden door tritureren door een plastic pipet voor ~ 15 keer. Laat zitten voor 5 min. Verzamel de celsuspensie in de nieuwe 15 ml conische buis die bevat verzamelde 'shake-off' cellen.
6. Tel de dichtheid van neuronen met een hemocytometer. Meestal kan 3000-5000 cellen per microliter worden verkregen afhankelijk van het aantal embryo's ontleed. Een gemiddeld aantal van 2,5 x 10 ⁷ neuronen worden geschat als de veronderstelling zes embryo's worden ontleed.
7. Bereken het benodigde volume van de celsuspensie tot een dichtheid van 250.000 neuronen / ml werd verkregen na toevoeging 30 ml compleet cultuurmedium. Voeg dit volume op een van de twee conische buizen met 30 ml compleet kweekmedium hoge dichtheid neuron plating medium verkregen.
8. Overdracht 1,2 ml van deze hoge dichtheid neuron oplossing nog 30 ml compleet kweekmedium tot een concentratie van ~ 10.000 neuronen / ml verkregen. Gebruik deze verdunning om de low-density dekglaasjes zaad.

9. Plating van neuronen en lange termijn Co-cultuur

1. Breng de twee 24-well platen met geëtst bodems voor hoge dichtheid neuronen in de celkweek kap. Verwijder de 300 pi medium voorwaarde van vacuüm. Plate 0,6 ml high density celsuspensies op 250.000 neuronen / ml.
2. Breng de andere twee 24-well platen met dekglaasjes in de cultuur kap en verwijder de voorwaarde 300 ul medium met vacuüm. Plaat 0,6 ml lage dichtheid celsuspensies bij 10.000 neuronen / ml op de dekglaasjes in de twee 24-well platen.
3. Terug vier 24-well platen in de incubator. Laat zitten voor 2 uur.
4. Flip de lage dichtheid dekglaasjes met het naleven neuronen aan de hoge cultuur dichtheid. Zorg ervoor dat de neuronen worden tegenover elkaar (dat wil zeggen, not gescheiden door de glazen dekglaasje). Plaats dan de twee platen met co-cultuur aan de incubator.

10. Co-cultuur Sustaining

1. Feed co-kweken door toevoegen 300 ul vers voedingsmedium (zie Materialen) op dag in vitro (DIV) 5. Het is niet nodig om 50% van de oorspronkelijke complete kweekmedium te verwijderen, zoals door veel andere studies. Het voedingsmedium bevat ook 15 uM cytosine arabinoside (Ara-C, tot een uiteindelijke concentratie van 5 uM opbrengst) om de kans op verontreiniging glia en proliferatie minimaliseren.
2. Na deze eerste voeden, voeg 300 ul vers Feed medium zonder Ara-C naar de put elke week. Indien de kweek gedurende meer dan één maand worden bewaard, vervangen de helft van het medium met vers voedingsmedium wekelijks na één maand tijdspunt (het eerste medium halve vervanging op DIV33). Morfologisch, zowel hoge dichtheid en lage dichtheid neuronen zien er gezond uit tot drie maanden (de langste tijd waargenomen door de experimenters).

11. Illustratie van een experimentele manipulatie-Low Density Neuron Transfectie

Opmerking: Wanneer transfectie in lage dichtheid neuronen gewenst is, kan een eenvoudige calciumfosfaat protocol worden vastgesteld. We hebben gevonden dat lage dichtheid culturen betere transfectie-efficiëntie met calciumfosfaat protocol voor DIV12, maar kunnen worden getransfecteerd met veel lagere efficiëntie bij DIV21 of ouder, gedurende welke tijd dendritische prominent. De haalbaarheid van de transfectie van gekweekte neuron lage dichtheid illustreert neuronen transfecteren met een plasmide pEGFP-C3 (zie hieronder).

1. Bij DIV21, verwijder 600 ul geconditioneerde medium van elk putje van de co-cultuur, en over te dragen aan een nieuwe 24-well plaat. Voeg vervolgens 600 ul vers voedingsmedium aan de co-kweek om het terug naar het oorspronkelijke volume te brengen.
   1. Breng de dekglaasjes in de nieuwe 24-well plaat met 600 pl geconditioneerd medium. Zorg ervoor dat delage dichtheid neuronen naar boven. Plaats de hoge dichtheid platen en de nieuwe platen met dekglaasjes opnieuw in de incubator.
2. Bereid twee 1,5 ml steriele buizen. In één buis, voeg 600 ul 2X HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS). Bereken het volume van 12 ug pEGFP-C3 DNA basis van plasmideconcentratie. In de andere buis, voeg 74 ui _CaCl2 (2 M voorraad) en de hoeveelheid water die na het toevoegen van 600 pi plasmide maakt. Meng goed door pipetteren en voeg dan plasmide-DNA. Langzaam meng goed. Laat beide buizen zitten 5 minuten bij kamertemperatuur.
3. Terwijl de hand houden van de 2X HBS buis en matig schudden van de oplossing op een mixer, voeg alle van de 600 pi van het _DNA-CaCl2 oplossing druppel voor druppel op de 600 pi 2X HBS buis. Het is cruciaal dat het gevormde precipitaat in de vorm van korrels fijn zand. Mengen te sterk en te snel is niet wenselijk, omdat het meer waarschijnlijk zal produceren grote 'snow flake'-achtige neerslagen, which heeft drastisch lagere transfectie-efficiëntie op basis van onze waarnemingen.
4. Laat het neerslag nog steeds gevormd worden in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
5. Voeg 100 ul neerslag in elk putje dat een lage dichtheid neuron op de dekglaasjes bevat, druppelsgewijs en gelijkmatig. Zet de plaat incubator en incubeer gedurende 2 uur. Uitgaande meeste CaCl ₂ in vrije vorm, resulteert dit in een concentratie van ~ 17,6 mM Ca2 ^+, die toxisch voor neuronen na langdurige incubatie kan zijn.
6. Bereid een 50 ml conische buis met ~ 50 ml Wash medium, warm het op tot 37 ° C.
7. Aan het eind van 2 uur, breng de lage dichtheid neuron met DNA-calciumfosfaat precipitaten in de kap. Pick-up elke individuele dekglaasje met een scherp # 5 pincet, en dompel het drie keer in de 50 ml Wash medium om het kort te wassen. Dan terug naar de hoge dichtheid neuronen in de oorspronkelijke co-kweekplaten met lage dichtheid neuronen naar beneden.
8. Ga door met de cultuur totde lage dichtheid cultuur neuronen op dekglaasjes worden geoogst voor studies.

Resultaten

De hier beschreven protocol maakt succesvolle ultra-lage dichtheid, langetermijnkweek zuivere glutamaat neuronen zonder de noodzaak van glia cellen dienen als voedsterlaag. Het protocol is schematisch weergegeven in figuur 1, die de bereiding van hoge dichtheid (op poly-D-lysine-gecoate 24 wells) en lage dichtheid neuronen (op poly-D-lysine beklede dekglaasjes) omvat afzonderlijk, en vervolgens co-cultuur kan worden maximaal drie maanden aangehouden.

Discussie

We presenteren een gedetailleerd protocol voor de lange termijn de cultuur van ultra-lage dichtheid hippocampale glutamaat neuronen onder serum-vrije omstandigheden. Bij ~ 2000 neuronen / cm ^2, de dichtheid ten minste twee maal lager dan de meeste lage dichtheid voor bereiding met of zonder glia steun van de bestaande literatuur ^2,3,11,13,14 gerapporteerd. Naast het feit dat ultra-lage dichtheid, dit protocol is nieuw en belangrijk in twee opzichten. Eerst wordt geen glia feeder layer nodig als lag...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049	Bescherm tegen licht
B27 supplement	Life Technologies	17504-044	aliquot, bewaar in 0,6ml formaat
GlutaMAX-I	Life Technologies	35050-061	verdun 100X
antibiotic-antimycotic (AA)	Life Technologies	15240-096	verdun 100X
Complete Cultuur medium			Neurobasal medium met 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I
Was medium			hetzelfde als 'Neurobasal medium'
Voedings medium			Neurobasal met 1X B27 supplement
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	bereid 100X stock op 0,6mg/ml
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	M.W. 70000-150000
boraat buffer	Sigma-Aldrich	B6768 (boorzuur); 71997(borax)	1,24g boorzuur & 1,9g borax in 400ml H2O, pH tot 8,5 gebruik HCl
12-mm ronde glazen deksels	Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/12	No. 1 glas, koop bij Carolina Biological Supply
proFection transfectie kit	Promega	E1200	zie  protocol voor details
2X HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS)	Promega	E1200	zie  protocol voor details
Spuitfilter	Pall Corporation	4192	0,2um poriegrootte
Endofree plasmide prep kit	Qiagen	12362	voor bereiding van transfectiekwaliteit plasmide DNA
anti-MAP2 antilichaam	Millipore	MAB3418	muis antilichaam, clone AP20
anti-p-Tau antilichaam	Millipore	AB10417	konijn polyklonaal antilichaam
anti-NR1 antilichaam	Millipore	MAB1586	muis antilichaam, clone R1JHL
anti-GluR1 antilichaam	Millipore	AB1504	konijn polyklonaal antilichaam
Hank's gebalanceerde zout oplossing	ThermoFisher	14025092	500ml formaat