Een vereenvoudigde methode voor de Ultra-Low Density, Long-Term Primaire hippocampus Neuron Cultuur

Summary

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Abstract

Het kweken van primaire hippocampus neuronen in vitro vergemakkelijkt mechanistische ondervraging van de vele aspecten van neuronale ontwikkeling. Gedissocieerde embryonale hippocampale neuronen groeien vaak succesvol op dekglaasjes met hoge dichtheid onder serumvrije omstandigheden, maar lage dichtheid kweken vereisen typisch een toevoer van trofische factoren door co-kweken ze met een glia voedsterlaag, bereiding kan tijdrovend zijn en moeizaam. Bovendien kan de aanwezigheid van glia interpretatie van de resultaten en te vermijden studies op neuron-specifieke mechanismen verwarren. Hier wordt een vereenvoudigde werkwijze voorgesteld voor ultralage dichtheid (~ 2000 neuronen / cm ^2), lange termijn (> 3 maanden) primaire hippocampale neuron cultuur die onder serumvrije omstandigheden en zonder glia Celdrager. Lage dichtheid neuronen gekweekt op poly-D-lysine beklede dekglaasjes en knipte hoge dichtheid neuronen gekweekt in een 24-wells plaat. In plaats van paraffine punten om een ​​ruimte te creëren between de twee neuronale lagen, kunnen de onderzoekers eenvoudig etsen plastic bodem van de put, waarop de hoge dichtheid neuronen bevinden, een microspace tot een lage dichtheid neuron groei. De co-kweek kan gemakkelijk worden gehandhaafd gedurende> 3 maanden zonder aanzienlijk verlies van lage dichtheid neuronen, waardoor de morfologische en fysiologische studie van deze neuronen vergemakkelijken. Om deze succesvolle cultuur aandoening te illustreren, worden de gegevens verstrekt aan overvloedig synapsvorming in lage dichtheid cellen na langdurige cultuur te laten zien. Deze co-cultuur systeem vergemakkelijkt ook het voortbestaan ​​van schaarse individuele neuronen gekweekt in eilanden van poly-D-lysine substraten en dus de vorming van autaptic verbindingen.

Introduction

Groeiende hippocampale neuronen onder in vitro omstandigheden maakt waarneming en experimentele manipulatie van deze neuronen die in vivo anders mogelijk niet. Deze experimentele benadering wordt veel gebruikt om neuronale mechanismen van groei, polariteit, neuriet specificatie, handel en subcellulaire lokalisatie van eiwitten, synapsvorming en functionele rijping ¹ onthullen. Deze in vitro gekweekte hippocampale neuronen, wanneer geoogst late embryonale fase, relatief zuiver (> 90%) glutamaterge cellen piramidale morfologie ^2. Omdat neuronen in een 2-D oppervlak werden gekweekt onder in vitro omstandigheden, ....

Protocol

Alle experimentele procedures waarbij muizen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Arizona, en gelijkvormig aan NIH richtlijnen.

1. Tissue Bron voor de hippocampus Neuron Cultuur

1. Prenatale muis pups voor hippocampus neuron cultuur te genereren, gebruiken time-zwangere muizen (C57Bl6 / J) die worden gefokt in huis ^17. De dag met een vaginale plug detectie wordt aangewezen als E0.5. De geplande oogsttijd voor cultuur is E16.5-E17.5.
   Opmerking: Dit protocol beschrijft kweken van twee 24-well platen van twee hoge dichtheid neuronen co-kweken met lage dichthe....

Results

De hier beschreven protocol maakt succesvolle ultra-lage dichtheid, langetermijnkweek zuivere glutamaat neuronen zonder de noodzaak van glia cellen dienen als voedsterlaag. Het protocol is schematisch weergegeven in figuur 1, die de bereiding van hoge dichtheid (op poly-D-lysine-gecoate 24 wells) en lage dichtheid neuronen (op poly-D-lysine beklede dekglaasjes) omvat afzonderlijk, en vervolgens co-cultuur kan worden maximaal drie maanden aangehouden.

Discussion

We presenteren een gedetailleerd protocol voor de lange termijn de cultuur van ultra-lage dichtheid hippocampale glutamaat neuronen onder serum-vrije omstandigheden. Bij ~ 2000 neuronen / cm ^2, de dichtheid ten minste twee maal lager dan de meeste lage dichtheid voor bereiding met of zonder glia steun van de bestaande literatuur ^2,3,11,13,14 gerapporteerd. Naast het feit dat ultra-lage dichtheid, dit protocol is nieuw en belangrijk in twee opzichten. Eerst wordt geen glia feeder layer nodig als lag.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049	Protect from light
B27 supplement	Life Technologies	17504-044	aliquot, store in 0.6ml size
GlutaMAX-I	Life Technologies	35050-061	dilute 100X
antibiotic-antimycotic (AA)	Life Technologies	15240-096	dilute 100X
Complete Culture medium			Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I
Wash medium			same as 'Neurobasal medium'
Feed medium			Neurobasal with 1X B27 supplement
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	prepare 100X stock at 0.6mg/ml
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	M.W. 70000-150000
borate buffer	Sigma-Aldrich	B6768 (boric acid); 71997(borax)	1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl
12-mm round glass coverslips	Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/12	No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply
proFection transfection kit	Promega	E1200	see  protocol for details
2X HEPES buffered saline (HBS)	Promega	E1200	see  protocol for details
Syringe filter	Pall Corporation	4192	0.2um pore size
Endofree plasmid prep kit	Qiagen	12362	for preparation of transfection grade plasmid DNA
anti-MAP2 antibody	Millipore	MAB3418	mouse antibody, clone AP20
anti-p-Tau antibody	Millipore	AB10417	rabbit polyclonal antibody
anti-NR1 antibody	Millipore	MAB1586	mouse antibody, clone R1JHL
anti-GluR1 antibody	Millipore	AB1504	rabbit polyclonal antibody
Hank's balanced salt solution	ThermoFisher	14025092	500ml size