Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden Xenopus Kidney

Summary

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Abstract

De embryonale nier van Xenopus laevis (kikker), de pronephros bestaat uit een nefron en kan worden gebruikt als model voor nierziekte. Xenopus embryo's groot extern ontwikkelen, en kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd door micro-injectie of chirurgische procedures. Daarnaast zijn lot kaarten vastgesteld voor vroege embryonale ontwikkeling. Gerichte micro-injectie in individuele blastomere die uiteindelijk leiden tot een orgaan of weefsel van belang geven kan worden gebruikt om selectief overexpressie of neerslaan van genexpressie in deze beperkte regio afneemt neveneffecten in de rest van de ontwikkelende embryo. In dit protocol beschrijven we hoe u gebruik maken van gevestigde Xenopus lot toegewezen aan de ontwikkeling van Xenopus nier (de pronephros), door middel van micro-injectie te richten op specifieke blastomeren van 4- en 8-cellige embryo. Injectie van lineage tracers maakt verificatie van de specifieke targeting van de injectie.Na embryo's ontwikkeld stadium 38-40, whole-mount immunokleuring gebruikt om pronephric ontwikkeling visualiseren, en de bijdrage van doelcellen om het pronephros kan worden beoordeeld. Dezelfde techniek kan worden aangepast aan targeten andere weefseltypen naast de pronephros.

Introduction

De Xenopus embryonale nier, de pronephros, is een goed model voor het bestuderen nier ontwikkeling en ziekte. De embryo's ontwikkelen extern, zijn groot, kan worden geproduceerd in grote aantallen, en zijn gemakkelijk te manipuleren door middel van micro-injectie of chirurgische procedures. Bovendien worden de betreffende genen nierontwikkeling in zoogdieren en amfibieën geconserveerd. Zoogdieren nieren verder komt in drie fasen: de pronephros, mesonephros en metanefros ^1, terwijl embryonale amfibieën hebben een pronephros en volwassen amfibieën hebben een metanefros. De basis filtering eenheid van deze nier vormen is het nefron, en beide zoog....

Protocol

Het volgende protocol is goedgekeurd door de Universiteit van Texas Health Science Center in Houston's Center for Laboratory Animal Medicine Animal Welfare Committee, dat dient als de institutionele zorg en gebruik Comite (protocol #: HSC-AWC-13-135).

1. Identificatie en selectie van blastomeren voor-Kidney gerichte Injecties

1. Voorafgaand aan productie embryo Gebruik Normal Table of Xenopus Development ²¹ de oriëntatie van de eerste celdelingen in het embryo begrijpen. Als alternatief, de toegang schema's van de vroege ontwikkelingsstadia van Xenopus op Xenbase ^11.
2. Toegang tot de interactieve....

Results

Micro-injecties van 4- en 8-cell Xenopus embryo's met MEM-RFP mRNA tonen verschillende richten naar de pronephros. Figuur 4 toont stage 40 embryo's met correcte MEM-RFP mRNA expressiepatronen. Embryo's werden geïnjecteerd in de linker ventrale blastomeer (figuur 4A) en gesorteerd voor de goede expressiepatroon van MEM-RFP mRNA. Naast expressie MEM-RFP in de proximale, tussenliggende en distale tubuli van de nier verbinden, correct ge.......

Discussion

Gericht op de pronephros van het ontwikkelen van Xenopus embryo's baseert zich op het identificeren en het injecteren van de juiste blastomere. Injectie van de V2 blastomeer 8-cellige embryo richt zich op de linker pronephros ^18. Dit laat de contralaterale rechter pronephros als een interne controle. Als morfolino knockdown of RNA overexpressie wordt gebruikt om nierontwikkeling veranderen, kan de contralaterale rechter pronephros worden gebruikt om de effecten van gen knockdown of overexpressie .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Fisher	S271-3
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500
Calcium chloride	Fisher	C79-500
HEPES	Fisher	BP310-500
EDTA	Fisher	S311-500
Gentamycin solution, 50 mg/ml	Amresco	E737-20ML
L-Cysteine, 99%+	Acros Organics	52-90-4
Ficoll	Fisher	BP525-100
100 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875712
Mini Fridge II	Boekel	260009	Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmid			For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W.	Invitrogen	D1817	Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified water	Corning	46-000-CI
7" Drummond replacement tubes	Drummond	3-000-203-G/XL	Microinjection needles.
Needle puller	Sutter Instruments	P-30
Fine forceps	Dumont	11252-30	For breaking microinjection needle tip.
Nanoject II	Drummond	3-000-204	Microinjector.
Mineral oil, heavy	Fisher	CAS 8042-47-5	Oil for needles.
27 G Monoject hypodermic needle	Covidien	8881200508	For loading mineral oil into microinjection needle.
5 ml Luer-Lok syringe	BD	309646	For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875713A
800 micron Polyester mesh	Small Parts	CMY-0800-C
Transfer pipets	Fisher	13-711-7M	For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plate	Nest Biotechnology
MOPS	Fisher	BP308-500
EGTA	Acros Organics	67-42-5
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
15 mm x 45 mm Screw thread vial	Fisher	03-339-25B	For fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell Culture plate	Nest Biotechnology
Benzocaine	Spectrum	BE130
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Methanol	Fisher	A412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder	Fisher	BP661-50
Bovine serum albumen	Fisher	BP1600-100
Triton X-100	Fisher	BP151-500
3D Mini rocker, model 135	Denville Scientific	57281
Goat serum, New Zealand origin	Invitrogen	16210064
Sodium azide	Fisher	S227I-25
Monoclonal 3G8 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit	MBL	PM005	Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11001	Secondary antibody to label kidney tubules.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A21428	Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 Cavity spot plate	Corning	7220-85
Benzyl benzoate	Fisher	105862500	Optional - for clearing embryos
Benzyl alcohol	Fisher	A396-500	Optional - for clearing embryos