Methodenartikel

Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden Xenopus Kidney

DOI:

10.3791/53799

⸱

3 mei 2016

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Pediatric Research Center, University of Texas McGovern Medical School, 2Program in Genes & Development, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 3Program in Cell & Regulatory Biology, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 4Department of Genetics, University of Texas MD Anderson Cancer Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om bestemmingskaarten en lijntracers te gebruiken om injecties in individuele blastomeren te richten die aanleiding geven tot de nier van Xenopus laevis embryo's.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De embryonale nier van Xenopus laevis (kikker), de pronephros bestaat uit een nefron en kan worden gebruikt als model voor nierziekte. Xenopus embryo's groot extern ontwikkelen, en kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd door micro-injectie of chirurgische procedures. Daarnaast zijn lot kaarten vastgesteld voor vroege embryonale ontwikkeling. Gerichte micro-injectie in individuele blastomere die uiteindelijk leiden tot een orgaan of weefsel van belang geven kan worden gebruikt om selectief overexpressie of neerslaan van genexpressie in deze beperkte regio afneemt neveneffecten in de rest van de ontwikkelende embryo. In dit protocol beschrijven we hoe u gebruik maken van gevestigde Xenopus lot toegewezen aan de ontwikkeling van Xenopus nier (de pronephros), door middel van micro-injectie te richten op specifieke blastomeren van 4- en 8-cellige embryo. Injectie van lineage tracers maakt verificatie van de specifieke targeting van de injectie.Na embryo's ontwikkeld stadium 38-40, whole-mount immunokleuring gebruikt om pronephric ontwikkeling visualiseren, en de bijdrage van doelcellen om het pronephros kan worden beoordeeld. Dezelfde techniek kan worden aangepast aan targeten andere weefseltypen naast de pronephros.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Xenopus embryonale nier, de pronephros, is een goed model voor het bestuderen nier ontwikkeling en ziekte. De embryo's ontwikkelen extern, zijn groot, kan worden geproduceerd in grote aantallen, en zijn gemakkelijk te manipuleren door middel van micro-injectie of chirurgische procedures. Bovendien worden de betreffende genen nierontwikkeling in zoogdieren en amfibieën geconserveerd. Zoogdieren nieren verder komt in drie fasen: de pronephros, mesonephros en metanefros 1, terwijl embryonale amfibieën hebben een pronephros en volwassen amfibieën hebben een metanefros. De basis filtering eenheid van deze nier vormen is het nefron, en beide zoogdieren en amfibieën vereisen dezelfde signaling cascades en inductieve evenementen om nefrogenese 2, 3 ondergaan. De Xenopus pronephros bevat één nefron bestaat uit proximale, tussengelegen, distale en buisjes verbinden, en een glomus (analoog aan het zoogdier glomerulus) 1, 4-6 (figuur 1 ). De enkele, grote nefron in de Xenopus pronephros maakt het geschikt als een eenvoudig model voor de studie van genen betrokken bij nier- ontwikkeling en ziekteprocessen.

Lot van de cel kaarten zijn vastgesteld voor de vroege Xenopus embryo's, en zijn vrij bij Xenbase 11/7 online beschikbaar. We beschrijven een techniek voor micro-injectie van lineage tracers voor de ontwikkeling Xenopus pronephros gericht, hoewel dezelfde techniek kan worden aangepast aan andere weefsels zoals het hart of ogen targeten. Lineage tracers zijn labels (zoals vitale kleurstoffen, fluorescent gelabelde dextranen, histochemisch detecteerbare enzymen en mRNA coderend fluorescerende eiwitten) die kan worden geïnjecteerd in een vroeg blastomeer, waardoor de visualisatie van de nakomelingen van die cel tijdens de ontwikkeling. Dit protocol maakt gebruik van MEM-RFP mRNA coderend membraan gerichte rood fluorescerend eiwit 12, een lijn tracer. De beoogde micro-injectie technieken voor individuele blastomeren in de 4- en 8-cellige embryo beschreven kunnen worden gebruikt voor injectie met morpholinos te breken genexpressie, of exogene RNA een gen van belang tot overexpressie. Door injecteren in de ventrale, vegetale blastomeer, vooral de pronephros van het embryo zal gericht, waardoor de contralaterale pronephros als ontwikkelings controle. Co-injectie van een tracer controleert of de juiste blastomere werd geïnjecteerd, en laat zien welke weefsels in het embryo is ontstaan ​​uit de geïnjecteerde blastomere, het verifiëren van de gerichtheid van de pronephros. Immunokleuring van de pronephros maakt visualisatie van hoe goed de pronephric buisjes zijn gericht. Overexpressie en knockdown effecten kunnen dan worden gemaakt tegen de contralaterale zijde van het embryo, die als ontwikkelings- controle en kan worden gebruikt om de pronephric index 13 berekend. De beschikbaarheid die het lot maps toelaat gerichte micro-injectie technieken worden gebruikt om weefsels oth targetener dan pronephros en co-injectie van een fluorescente tracer kan de gerichte micro-injectie op elk weefsel vóór de analyse worden geverifieerd.

Tijdens embryo micro-injectie, dient ontwikkelings temperatuur strak gereguleerd, omdat de snelheid van Xenopus ontwikkeling sterk afhankelijk is 14. Embryo's worden geïncubeerd bij lagere temperaturen (14-16 ° C) voor de 4- en 8-cell injecties omdat de ontwikkeltijd wordt vertraagd. Bij 22 ° C, ontwikkeltijd uit stap 1 (1 cel) naar fase 3 (4 cellen) ongeveer 2 uur, terwijl bij 16 ° C ontwikkelingstijd naar fase 3 ongeveer 4 uur. Het duurt ongeveer 15 minuten om een ​​4-cel embryo een 8-cel (stap 4) embryo bij 22 ° C, maar duurt ongeveer 30 minuten bij 16 ° C. Evenzo, bij 22 ° C duurt slechts 30 minuten voor een 8-cellige embryo op weg naar een 16-cel embryo (stap 5). Ditmaal echter 45 minuten bij 16 ° C. Dewaardo or, is het nuttig om langzaam de ontwikkelingssnelheid van de embryo voldoende voor injecties in het 8-cellig stadium schakelen voordat de embryo's ontwikkelen tot het 16-cellig stadium. Bovendien kan groeitemperatuur gemoduleerd versnellen of vertragen van embryonale ontwikkeling tot de nier volledig is ontwikkeld.

De epidermis van kikkervisje stadium Xenopus embryo's is relatief transparant, zorgen voor gemakkelijke beeldvorming van de ontwikkelingslanden pronephros zonder dissectie of clearing van het weefsel 15. Door de relatieve transparantie van embryonale ontwikkeling, live cell imaging is ook mogelijk 16,17. Whole-mount immunokleuring aan de pronephros visualiseren is mogelijk met gevestigde antilichamen die de proximale, tussengelegen, distale en het aansluiten van buisjes van het podium 38 labelen - 40 embryo's die het mogelijk maken voor de beoordeling van pronephric ontwikkeling na gerichte manipulatie van genexpressie in Xenopus embryo's 18-20.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het volgende protocol is goedgekeurd door de Universiteit van Texas Health Science Center in Houston's Center for Laboratory Animal Medicine Animal Welfare Committee, dat dient als de institutionele zorg en gebruik Comite (protocol #: HSC-AWC-13-135).

1. Identificatie en selectie van blastomeren voor-Kidney gerichte Injecties

  1. Voorafgaand aan productie embryo Gebruik Normal Table of Xenopus Development 21 de oriëntatie van de eerste celdelingen in het embryo begrijpen. Als alternatief, de toegang schema's van de vroege ontwikkelingsstadia van Xenopus op Xenbase 11.
  2. Toegang tot de interactieve Xenopus lot van de cel kaarten op Xenbase 11 om te selecteren welke blastomere zal worden gericht voor micro-injectie.
  3. Merk op dat de enkele cel embryo heeft een donkergekleurde dier paal en een vegetatieve pool, die is wit en Yolky. Merk op dat een beschermend membraan, bekend als de vitelline envelope, heeft het embryo.
  4. Merk op dat de eerste klieving treedt meestal tussen de linker- en rechterkant van het embryo. Deze cellen in gelijke mate bijdragen aan de pronephric afstamming.
  5. Merk op dat de tweede splitsing verdeelt de dorsale en ventrale helften van het embryo, waardoor een 4-cel embryo. De dorsale cellen zijn kleiner en hebben minder pigment dan de ventrale cellen (Figuur 2A en Figuur 3A).
    1. Identificeer de ventrale blastomeren (V, de grote donkere cellen) links en rechts, waarbij meer de ontwikkelende nier dragen dan de dorsale (D, kleine, lichte cellen) blastomeren (Figuur 2A).
    2. Als het injecteren in een 4-cel embryo, injecteer de linker ventrale blastomeer naar de linker nier (figuur 3A en deel 3) richten.
  6. De derde splitsing doorsnijdt de dierlijke en plantaardige kanten, waardoor een achtcellige embryo. Op dit moment zijn er vier dieren blastomeren [linker en rechter ventrale(V1) en dorsale (D1)] en vier plantaardige blastomeren [linker en rechter ventrale (V2) en dorsale (D2)] (Figuur 2B en Figuur 3B).
    1. Zoek het ventrale, plantaardige blastomeren (V2). Deze blastomeren meer bijdragen aan de ontwikkeling van nieren andere cellen in deze fase (Figuur 2B). Om de linker nier van een 8-cel embryo te richten, te injecteren in de linker V2 blastomere (Figuur 3B en hoofdstuk 3).
  7. Merk op dat de vierde en vijfde breuklijnen halveren van het dier en plantaardige blastomeren. Twee nageslacht wordt geproduceerd uit elk blastomeer, resulterend in een 16-cel embryo. De cellen worden genoemd naar hun voorganger. Bijvoorbeeld, de V2 blastomeer van het 8-cellig stadium ontstaat V2.1 en V2.2 nakomelingen op de 16-cellig stadium (figuur 2C). De V2.2 cel aan het 16-cellig stadium geeft de meerderheid van de cellen die bijdragen tot de ontwikkeling van nieren.
  8. Let op de zesde en zevende breuklijnen resulteren in een 32-cel embryO. Nogmaals, twee nakomelingen worden geproduceerd uit elk blastomere, die genoemd na hun voorganger. Bijvoorbeeld, de V2.2 blastomeer van de 16-cellig stadium leidt tot V2.2.1 en V2.2.2 bij de 32-cellig stadium. Er is een alternatieve naamgeving systeem de 32-cellig stadium waarin geïdentificeerd zijn in vier rijen A, B, C en D (van dieren bij plantaardig), en vier kolommen 1, 2, 3 en 4 ( van dorsale ventrale). Dus de V2.2.2 blastomeer, waarvan de meest bijdraagt ​​aan de ontwikkeling pronephros, heet C3 onder deze alternatieve naamgeving (figuur 2D).

2. Voorbereiding van embryo's

  1. Bereid 50 ml Dejelly oplossing (2% cysteine, NaOH tot pH 8,0).
  2. Isoleer beide testes van een mannelijke kikker volgens standaardprotocollen 14. Plaats de testes in een 60 mm petrischaal gevuld met 10 ml testes opslagoplossing (1x Marc's gemodificeerd Ringers [MMR; 0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4, 2 mMCaCl2, 5 mM HEPES pH 8, 0,1 mM EDTA] 12, 1% runderserumalbumine, 50 ug / ml gentamycine). Bewaar de testes bij 4 ° C.
    Opmerking: Testes kan worden opgeslagen gedurende ongeveer 7-10 dagen bij 4 ° C, maar bevruchting efficiëntie zal afnemen hoe langer de testes werden vastgelegd.
  3. Knijp een vrouwelijke kikker om eieren volgens standaardprotocollen 14 te verkrijgen. Verzamel de eieren in een 100 mm petrischaal. Giet het overtollige water.
  4. Snijd ¼ van een testis terwijl deze in Testikels Storage Solution behulp van een tang en een scheermesje. Transfer het stukje testis aan de petrischaal met eieren. Pas de grootte van de testis gebruikte gedeelte rekening voor de grootte van de testis, hoe lang de testis is opgeslagen, en hoeveel eieren worden bevrucht. Over het algemeen gebruiken ¼ tot 1/3 van een vers ontleed testis een koppeling van de eieren te bevruchten.
  5. Snijd de testis gedeelte in kleine stukjes met behulp van een tang en een scheermesje. Voeg genoeg 0.3x MMR+ 30 mg / ml gentamycine de petrischaal om de eieren te dekken. Swirl de BMR in de schaal te mengen.
  6. Wacht ongeveer 30 min voor de bevruchting te laten plaatsvinden bij kamertemperatuur. Merk op dat het dier hemisfeer (de gepigmenteerde zijde van het embryo) bovenop het embryo op effectieve bevruchting zitten. Verwijder vervolgens de BMR van de petrischaal met behulp van een overdracht pipet. Voeg genoeg Dejelly Solution om de schotel naar de embryo's te dekken.
  7. In de komende paar minuten zachtjes wervelen de schotel met tussenpozen. Krachtig schudden van de schotel op dit moment kunnen defecten as veroorzaken.   De gelei laag op de embryo's zal oplossen, en de embryo's zullen samenkomen in het midden van het gerecht tijdens de wervelende. Zodra de embryo's sterk op elkaar raken in het midden van de schaal, verwijdert het Dejelly oplossing met een transferpipet. Niet embryo's in de Dejelly Solution vertrekken langer dan 5 minuten, of de embryo's kunnen worden beschadigd.
  8. Was de dejellied embryo 3-5 keer in 0.3xMMR + 30 mg / ml gentamycine door voorzichtig te gieten of pipetteren uit de BMR en het vullen van de schaal met nieuwe MMR. Niet alle MMR uit de schotel of het embryo kan worden beschadigd.
  9. Verwijder eventuele onbevruchte eieren of stukjes van testis van de petrischaal met behulp van een overdracht pipet.
  10. Incubeer embryo's tussen de 14 en 22 ° C.
    Opmerking: Embryo's gekweekt bij lagere temperaturen langzamer ontwikkelen dan embryo's gekweekt bij hogere temperaturen. Timing van de ontwikkelingsstadia is te vinden op Xenbase 22.
    1. Om ruimte hun ontwikkeling plaats helft van de embryo's van een enkele bevruchting in een petrischaal bewaard bij 14 ° C, en de andere helft van de embryo's in een petrischaal bewaard bij 18 ° C. Dit maakt twee injecties in 4-cel of 8-cel embryo's van een enkele bevruchting.

3. Bereiding van injectieoplossingen en Micro-injectie van embryo

  1. Bereid de injectie oplossing die 0,01ng / nl membraangebonden rood fluorescerend eiwit (RFP-MEM) mRNA 9 terwijl de embryo's ontwikkelen om de 4-cel of 8-cellig stadium. Bewaar de injectie-oplossing op ijs pas klaar om te injecteren.
  2. Laad een 7 "vervangingsglas capillaire buis in een naald trekker, waarbij de bovenkant van de vervangende buis uitgelijnd met de top van de naald trekker geval. Zet de warmte # 2 waarde 800, en uitschuifbare waarde 650. Druk de" pull "toets om de naald te trekken. Dit zal 2 naalden te maken van een enkele 7" glazen capillaire buis.
  3. Knip de punt van een naald getrokken met een paar Dumont tang.
    Let op: Na het trekken van de naald, is de tip dichtgemaakt en moet worden opengesneden. Hoe dichter bij het punt van de naald die het uitsnijden hoe kleiner de diameter van de naald zijn. Hoewel de diameter van de punt niet van invloed op de injectievolume de micro-injectie systeem hier gebruikt, een tip met een grotere diameter is waarschijnlijk een embryo beschadigen.
  4. Zet de micropipette Collet op de achterkant van de naald. Vervolgens zet de grote gat O-ring op de achterkant van de naald achter de kraag.
  5. Vul de naald met minerale olie met behulp van een 27 gauge injectienaald, zorg dat u luchtbellen in de naald niet te krijgen.
  6. Zet de naald op de plunjer van de microinjector, het plaatsen van de naald in het grote gat van de witte plastic spacer op de plunjer geïnstalleerd. De plunjer moet een kleine O-ring dichtst bij het lichaam van de microinjector, gevolgd door de blanke afstandhouder groot gat O-ring en spantang. Zet de naald door het aandraaien van de kraag. Trek voorzichtig aan de naald om ervoor te zorgen dat deze goed is beveiligd.
  7. Houd de "lege" knop op de microinjector regelkast tot er twee piepjes.
  8. Pipetteer 3 pi injectieoplossing op een stuk Parafilm. Steek de punt van de naald in de parel injectieoplossing op de Parafilm. Houd de "vullen" knop op de microinjector schakelkast aan de injectie oplossing in de naald te trekken.
  9. Vul een 60 mm petrischaal bekleed met 500 micron polyester gaas met 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycine. Zorgvuldig pipetteren 20-30 april-cel of 8-cellige embryo in de schaal.
  10. Met behulp van een haar lus 14, manipuleren van de embryo's, zodat de blastomere te injecteren wordt geconfronteerd met de naald. Om de linker nier te richten, line-up van de embryo's, zodat de linker ventrale blastomeren van 4-cellige embryo's of links V2 blastomeren van 8-cellige embryo gezicht van de naald.
  11. Injecteer 10 nl injectieoplossing in de geselecteerde blastomeren van elk embryo in de schaal.
    Opmerking: De mazen onderaan de petrischaal stabiliseert het embryo en stopt de rollen, waardoor ze worden geïnjecteerd zonder het gebruik van een haar lus te stabiliseren.
  12. Transfer geïnjecteerde embryo's in putjes van een kweekplaat die worden opgevuld met 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycine. Incubeer de geïnjecteerde embryos bij 16 ° C gedurende ten minste één uur, om het geïnjecteerde blastomeren te genezen.
  13. Breng de genezen embryo's in putjes van een nieuwe kweekplaat die worden opgevuld met 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycine per stadium 9 (voor gastrulatie).
  14. Incubeer de embryo's bij 14-22 ° C totdat het embryo bereiken stadium 38-40 21.

4. Fixatie en Immunokleuring van embryo's

  1. Bereid 50 ml MOPS / EGTA / Magnesiumsulfaat / formaline Buffer [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7,4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 3,7% (v / v) formaldehyde].
  2. Met behulp van een overdracht pipet, zet 10-20 stadium 38-40 embryo's in een glazen flacon. Voeg 10 ul 5% benzocaïne in 100% ethanol aan de flacon en flacon omkeren om te mengen. Wacht 10 minuten om de embryo verdoven.
  3. Verwijder de MMR uit de flacon met behulp van een glazen pipet. Indien voor flesjes met meerdere tegelijk, kan de flesjes rechtop gehouden in een 24-well celcultuur plaat.
  4. Met een glas pijptte, vul de flacon met MEMFA. Plaats de flacon op een driedimensionale rocking platform gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  5. Verwijder de MEMFA uit de flacon met een glazen pipet. Vul het flesje met 100% methanol. Plaats de flacon op een driedimensionale schudapparaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze wasstap nog een keer, en de embryo's in 100% methanol gedurende de nacht opgeslagen bij -20 ° C.
  6. Bereid 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing-runderserumalbumine-Triton (PBT): 1x PBS, 2 mg / ml bovine serum albumine, 0,1% Triton X-100.
  7. Bereid de primaire antilichaamoplossing: 1x PBT met 10% geit serum met een 1: 5 verdunning van monoklonaal antilichaam 4A6, een 1:30 verdunning van muis monoklonale antilichaam 3G8 (aan de membranen van de tussenliggende en distale tubuli verbinden 20 label) (etiket lumen van de proximale tubuli 20), en een 1: 250 verdunning van konijn polyklonaal antilichaam RFP (de MEM-RFP tracer label). Bewaren bij 4 ° C.
  8. Bereid de secondary antilichaamoplossing: 1x PBT met 10% geit serum, 1: 500 Alexa 488 geit anti-muis IgG (stock concentratie 2 mg / ml; labelen 4A6 en 3G8), en 1: 500 Alexa 555 geit anti-konijn IgG (stock concentratie 2 mg / ml, om de MEM-RFP tracer label). Bewaren bij 4 ° C, die de buis folie ter bescherming tegen licht.
  9. U kunt ook het verzamelen van de primaire en secundaire antilichamen na kleuring, en op te slaan bij 4 ° C voor hergebruik in toekomstige experimenten. Als het antilichaam moet worden opgeslagen voor hergebruik, voeg 0,01% natriumazide.
  10. Immunostain de embryo behulp vastgestelde protocollen 18.

5. Visualisatie van embryo's en analyse van Gerichte Pronephric Tissue

  1. Zeef de immunostained embryo's om te controleren of de juiste blastomere werd geïnjecteerd door het bekijken van de fluorescentie van de tracer onder een tl-stereomicroscoop bij 1X (op hele embryo te zien) en 5X vergroting (tot nier bekijken). Plaats embryo in een multi-well glasplaat met de weLLS gevuld met 1x PBT met behulp van een overdracht pipet met de tip afgesneden. Manipuleren van de embryo's met een haar loop. Gebruik alleen embryo's die de co-geïnjecteerde tracer in de pronephros aan de linkerzijde van het embryo hebben (figuur 3C, F en figuur 4C, F) overexpressie of knockdown analyse.
  2. Als alternatief duidelijk de embryo's in Murray's Clear (2 delen benzylbenzoaat: 1 deel benzylalcohol) door het plaatsen van de embryo's in een glazen flesje en het vullen van de flacon met Murray's Clear. Visualiseer de embryo's met behulp van een glazen plaat goed.
    Opmerking: Murray's Clear is een organisch oplosmiddel, en moet met zorg worden behandeld. Draag handschoenen, en alleen gebruik maken van glazen flesjes en pipetten met Murray's Clear.
  3. WINKEL embryo bij 4 ° C in 1x PBT gedurende 2-3 weken. Voor langdurige opslag van embryo, dehydrateren de embryo's door tweemaal in 100% methanol wassen bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Bewaar de embryo's bij -20 ° C in 100% methanol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Micro-injecties van 4- en 8-cell Xenopus embryo's met MEM-RFP mRNA tonen verschillende richten naar de pronephros. Figuur 4 toont stage 40 embryo's met correcte MEM-RFP mRNA expressiepatronen. Embryo's werden geïnjecteerd in de linker ventrale blastomeer (figuur 4A) en gesorteerd voor de goede expressiepatroon van MEM-RFP mRNA. Naast expressie MEM-RFP in de proximale, tussenliggende en distale tubuli van de nier verbinden, correct ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gericht op de pronephros van het ontwikkelen van Xenopus embryo's baseert zich op het identificeren en het injecteren van de juiste blastomere. Injectie van de V2 blastomeer 8-cellige embryo richt zich op de linker pronephros 18. Dit laat de contralaterale rechter pronephros als een interne controle. Als morfolino knockdown of RNA overexpressie wordt gebruikt om nierontwikkeling veranderen, kan de contralaterale rechter pronephros worden gebruikt om de effecten van gen knockdown of overexpressie ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health subsidie ​​NIDDK (K01DK092320) en het opstarten van de financiering van de afdeling Kindergeneeskunde aan de Universiteit van Texas McGovern Medical School.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sodium chlorideFisherS271-3
Potassium chlorideFisherP217-500
Magnesium sulfate FisherM63-500
Calcium chlorideFisherC79-500
HEPESFisherBP310-500
EDTAFisherS311-500
Gentamycin solution, 50 mg/mlAmrescoE737-20ML
L-Cysteine, 99%+Acros Organics52-90-4
FicollFisherBP525-100
100 mm x 15 mm Petri dishFisherFB0875712
Mini Fridge IIBoekel260009Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmidFor making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W.InvitrogenD1817Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified waterCorning46-000-CI
7" Drummond replacement tubesDrummond3-000-203-G/XLMicroinjection needles.
Needle pullerSutter InstrumentsP-30
Fine forcepsDumont11252-30For breaking microinjection needle tip.
Nanoject IIDrummond3-000-204Microinjector.
Mineral oil, heavyFisherCAS 8042-47-5Oil for needles.
27 G Monoject hypodermic needleCovidien8881200508For loading mineral oil into microinjection needle.
5 ml Luer-Lok syringeBD309646For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dishFisherFB0875713A
800 micron Polyester meshSmall PartsCMY-0800-C
Transfer pipetsFisher13-711-7MFor transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plateNest Biotechnology
MOPSFisherBP308-500
EGTAAcros Organics67-42-5
FormaldehydeFisherBP531-500
15 mm x 45 mm Screw thread vialFisher03-339-25BFor fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell Culture plateNest Biotechnology
BenzocaineSpectrumBE130
EthanolFisherBP2818-4
MethanolFisherA412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1x powderFisherBP661-50
Bovine serum albumenFisherBP1600-100
Triton X-100FisherBP151-500
3D Mini rocker, model 135Denville Scientific57281
Goat serum, New Zealand originInvitrogen16210064
Sodium azideFisherS227I-25
Monoclonal 3G8 antibodyEuropean Xenopus Resource CentrePrimary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibodyEuropean Xenopus Resource CentrePrimary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbitMBLPM005Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgGLife TechnologiesA11001Secondary antibody to label kidney tubules.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgGLife TechnologiesA21428Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 Cavity spot plateCorning7220-85
Benzyl benzoateFisher105862500Optioneel - voor het ophelderen van embryo's
Benzyl alcoholFisherA396-500Optioneel - voor het ophelderen van embryo's

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
  2. Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
  3. Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).
  4. Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
  5. Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
  6. Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84(2008).
  7. Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
  8. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
  9. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
  10. Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
  11. Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
  12. Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
  13. Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  15. Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).
  16. Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
  17. Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
  18. Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
  19. Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. Development of the Xenopus pronephric system. Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).
  20. Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).
  21. Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
  22. Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
  23. Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
  24. Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
  25. Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
  26. Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
  27. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).
  28. Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
  29. Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
  30. Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Xenopus embryomicro injectietechniekontwikkeling van de pronefrostargeting van blastomerengebruik van fate mapswhole mount immunostainingconfocale microscopiemembraangebonden rood fluorescerend eiwitstadi ring van embryo sweefselspecifieke injectie

Gerelateerde artikelen