Kwalitatieve en Kwantitatieve Testen voor detectie en karakterisering van proteïne Antimicrobials

Samenvatting

Hier presenteren we protocollen om snel enzymen te screenen en te karakteriseren op antimicrobiële activiteit. De microslide-diffusietest en de kleurstof-releasetest maken gebruik van doelbacteriële substraten voor kwalitatieve en kwantitatieve evaluatie van enzymatische activiteit.

Samenvatting

Eerste evaluaties van grote microbiële bibliotheken voor potentiële producenten van nieuwe antimicrobiële eiwitten vereisen zowel kwalitatieve als kwantitatieve methoden om te screenen op doelenzymmen voordat er meer onderzoeksmoeite en middelen worden geïnvesteerd. Het doel van dit protocol is om twee complementaire assays te demonstreren voor het uitvoeren van deze eerste evaluaties. De microslide-diffusie-assay biedt een initiële of eenvoudige detectiescherm om de kwalitatieve en snelle beoordeling van proteolytische activiteit tegen een reeks zowel levensvatbare als hittedode bacteriële doelsubstraten mogelijk te maken. Als tegenhanger biedt de verhoogde gevoeligheid en reproduceerbaarheid van de kleurstof-release-assay een kwantitatief platform voor het evalueren en vergelijken van omgevingsinvloeden die de hydrolytische activiteit van eiwitantimicrobiële stoffen beïnvloeden. De mogelijkheid om specifieke hittedode celcultuursubstraten te labelen met Remazol briljante blauwe R kleurstof breidt deze mogelijkheid uit om de kleurstof-release-assay aan te passen om enzymatische activiteit van belang te karakteriseren.

Inleiding

Antimicrobiële middelen spelen een essentiële rol bij het targeten van een breed scala aan micro-organismen zoals virussen, schimmels en bacteriën. De antimicrobiële activiteiten geproduceerd door verschillende bacteriën variëren in doelspecificiteit van breed-spectrum tot soortspecifiek, inclusief klinisch relevante bacteriële pathogenen ¹. In de natuur vertegenwoordigen eiwit-antimicrobiële verbindingen zoals bacteriocinen en lysines een microbiële arsenaal van hulpmiddelen voor zelfverdediging, replicatie en voedingsstoffenverwerving ^2,3. Als bemiddelaars van populatiedynamiek binnen microbiële gemeenschappen bieden eiwit-antimicrobiëlen een concurrentievoordeel voor het producerende organisme ten opzichte van niet-producerende, gevoelige soorten ⁴. Als recombinante enzymen en probiotica hebben deze eiwitten ook een economische en maatschappelijke betekenis, aangezien de behoefte aan nieuwe bronnen van pathogenencontrole toeneemt met elke nieuwe uitbreiding van antimicrobiële resistentie binnen de bacteriële populatie ⁵.

De eerste evaluaties van nieuw ontdekte eiwit-antimicrobiëlen omvatten het bepalen van de basisfysische kenmerken die inherent zijn aan het enzym. Methoden voor snelle screening van potentiële antimicrobiëlen maken selectie mogelijk van kandidaten met hydrolytische activiteiten tegen de gewenste doelsubstraten. De microslide-diffusie-assay en de kwantitatieve kleurstof-release-assay staan het gebruik van een verscheidenheid aan substraten toe bij de detectie van enzymatische hydrolyse. Voor eiwit-antimicrobiële enzymen met activiteit tegen de bacteriële celwand, staat de veelzijdigheid van deze assays snelle en effectieve, kwalitatieve en kwantitatieve screening mogelijk tegen levensvatbare bacteriële cellen (alleen microslide-assay), hittedoden gehele bacterieële celsubstraten of gezuiverd peptidoglycaan van de doelbacterie. Deze assays zijn nuttig bij de ontdekking van antimicrobiële enzymen voor gebruik in gebieden zoals alternatieve therapieën, voedingssupplementen en remmers van biofilmproductie.

De microslide-diffusie-assay en de kleurstof-release-assay zijn aangetoonde methoden voor detectie en karakterisering van nieuwe eiwit-antimicrobiëlen. De microslide-diffusie-assay biedt een relatieve (kwalitatieve) schatting van de antimicrobiële activiteit en staat minimale interferentie van enzymconcentratie en -activiteit toe. Met behulp van deze methode wordt activiteit gemakkelijk gevisualiseerd als de ontwikkeling van een lysezone met de afwezigheid van activiteit die resulteert in een gebrek aan zonevorming. De snelheid van zoneontwikkeling en de zonediameter zijn indicatief voor de hoeveelheid en zuiverheid van het enzym dat aanwezig is in het monster; deze snelheid en de kwaliteit van de substraatopruiming binnen de zone kunnen echter ook worden beïnvloed door de aanwezigheid van verontreinigingen, de volledigheid van de hydrolysereactie en het type substraat. Storende verontreinigingen kunnen de snelheid van enzymdiffusie uit de put beïnvloeden, terwijl onvolledige hydrolyse of variatie in het type substraat kan resulteren in een troebele lysezone ⁶.

De kleurstof-release-assay beoordeelt kwantitatief de hoeveelheid covalent gebonden Remazol brilliant blauw R-kleurstofproducten die vrijkomt in het reactiesupernatant uit het enzymatisch gehydrolyseerde substraat. De methode heeft slechts een lichte variabiliteit geassocieerd met een verschil in substraat, waardoor de methode een grotere gevoeligheid heeft voor detectie van hydrolyse in vergelijking met de microslide-diffusie-assay. Deze eigenschappen maken de methode nuttig in de karakterisering van biochemische eigenschappen van het enzym en in de standaardisatie van de assay voor vergelijking tussen verschillende antimicrobiële enzymen.

In dit protocol bieden we methoden om de basismicroslide-diffusie-assay en kleurstof-release-assay uit te voeren, terwijl we de schaal van detectielimieten en variabiliteit voor elk aantonen. De assays worden gebruikt om basisevaluatie uit te voeren van een onbekend eiwit-antimicrobieel gezuiverd uit de cultuursupernatant van een ongekarakteriseerd bodembacterieel isolaat. Waarneembare activiteiten tegen bacteriële celsubstraten binnen de assays staan vergelijking van reactieactiviteiten toe tussen een voorheen ongekarakteriseerd eiwit-antimicrobieel en α-chymotrypsine, een controle-proteolytisch enzym. Deze protocollen bieden een basis voor de toepassing van de twee technieken die kunnen worden uitgebreid en aangepast om aan verschillende toepassingen te voldoen.

Protocol

1. Bereiding van Bacteriële en peptidoglycan Substrates

Opmerking: Hele cel bacteriële substraten en gezuiverd peptidoglycanen worden gebruikt als enzymsubstraten in zowel het microscoopglaasje diffusie assay en de kleurstof-afgifte test. Deze substraten vereisen voorbereiding voorafgaand aan het uitvoeren van de enzymreacties. Het volgende protocol beschrijft de bereiding.

1. Hele bacteriële cel Substrate
   1. Produceren bacteriële cel substraat door inoculeren van 500 ml voedingsbouillon met 2 ml overnacht cultuur van Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection, ATCC 23857). Incubeer bij 30 ° C onder schudden (125 rpm) totdat de kweek een exponentiële groeifase, gedefinieerd als een snelle groeifase resulteert in de verdubbeling van de bacteriecultuur bereikt. Voor de teelt van Salmonella enterica subsp. Enterica (ATCC 10708), gebruikt als voedingsbodem groeimedium bij 37 ° C onder schudden (125 rpm).
   2. Warmte-doden elke cultuur autoclaaf gedurende 10 minuten bij 121 ° C onder 3 atm druk.
   3. Oogst de hitte gedode bacteriële substraat door centrifugatie gedurende 20 minuten bij 5000 x g. Was de pellet driemaal met type 1 water en resuspendeer in een minimale hoeveelheid water. In deze studie, schorten de substraten in 1200 pl.
   4. Aliquot 300 pi van de bacteriële cel substraten 1,5 ml microfuge buizen en bewaren bij 20 ° C.
2. Gezuiverd peptidoglycaan Substrate
   1. Zuiver peptidoglycan van het doel substraat bacterie ^7-10 of het verwerven van een leverancier (zie materialen en apparatuur Table). Zuiver ruwe peptidoglycan voorbereidingen van accessoire celwandpolymeren.

2. Kwalitatieve microscoopglaasje Diffusion test [Aangepast van Lachica, et al. ^11]

Opmerking: De microscoopglaasje diffusie assayeen kwalitatieve methode om de aanwezigheid van antimicrobiële enzym in een monster. Aangezien het enzym door een agarose matrix substraat diffundeert, een zone van clearing ontwikkelt als het enzym hydrolyseert het substraat. Het volgende protocol beschrijft de voorbereiding en uitvoering van het microscoopglaasje diffusie assay voor kwalitatief detecteren van de aanwezigheid van eiwit antimicrobiële middelen.

1. Bepaal de concentratie van het antimicrobiële enzym worden beoordeeld met behulp van een bicinchoninezuur (BCA) Protein Assay Kit volgens het protocol van de fabrikant.
2. Gebruik fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) een enzym buffer; echter empirisch bepalen de buffer geschikt is voor de gegeven enzym.
3. Voer een seriële verdunning van het antimicrobiële enzym met behulp van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) als reactiebuffer. De seriële verdunning gebruikt in deze microscoopglaasje diffusie assays geproduceerd laatste test eiwit massa van 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug, en 10 ug per reactievolume.
4. Verdeel eiwit massa in individuele microcentrifugebuizen en pas eiwit volumes 20 pl PBS gebruiken als voorbereiding voor toevoeging aan reactiewells microscoopglaasje.
5. Voeg een 0,5% agarose-oplossing door het oplossen van 0,25 g agarose in 50 ml PBS. Verwarm de oplossing tot kookpunt totdat de agarose volledig is opgelost. Bepaal waterverlies tijdens het smeltproces gewichtsprocent en weer toevoegen aan de oplossing.
6. Voeg 50 ul van 10% natriumazide in water om de agarose vloeistof en breng de temperatuur van de oplossing tot 50 ° C in een waterbad. Het natriumazide wordt toegevoegd aan verontreinigende remmen bacteriegroei tijdens de incubatie van het microscoopglaasje diffusie assay. Als levensvatbare cellen worden gebruikt als substraat, laat de natriumazide van de agaroseoplossing.
7. Ontdooi de hitte gedode bacteriële substraat op ijs.
8. Resuspendeer de bacteriële substraat in 12 ml van de agarose oplossing ongeveer overeenkomen met de troebelheid van een 2,0 McFArland gelijkwaardigheid norm (zie Materials tabel). Vergelijk de troebelheid van de oplossingen door visualiseren van een zwarte lijn op een witte achtergrond met de oplossingen, toevoeging bacteriële substraat om de agarose tot bij benadering troebelheid bereikt.
9. Onmiddellijk Pipetteer 3 ml agarose-substraatoplossing aan elk microscoopglaasje (25 x 75 x 1 mm ^3).
10. Na dia stollen, pons drie putten in de agarose-substraatlaag van elk microscoopglaasje met een kurkboor (4,8 mm diameter). Voeg 20 ul van elk eiwit gecorrigeerde seriële verdunning van hun respectievelijke putjes.
11. Met PBS (20 pl) of runderserumalbumine (5 ug in 20 pl PBS) in een negatieve controle ook. Met bekende bacteriolytische enzymen geschikt voor het substraat, zoals lysozym, als positieve controle.
12. Incubeer de dia in een vochtige kamer bij 37 ° C en de temperatuur optimale activiteit van het enzym. De lengte van de incubatie is afhankelijk van de concentratie enspecifieke activiteit van het antimicrobiële enzym. Een typische reactietijd ligt overnacht (ongeveer 16 uur).
13. Na incubatie, let op de dia's in het kader van indirect licht en foto's maken van de ontwikkeling van test met behulp van een digitale spiegelreflexcamera met een 60 mm lens op een brandpuntsafstand van ongeveer 30 cm.
    Noot: Enzymatische activiteit van het eiwit van de antimicrobiële bepaald substraat gecorreleerd is met de ontwikkeling van een heldere zone hydrolyse, welke vormen rond en het enzym in de agarose diffundeert.
14. Om de enzymatische activiteit in aanmerking komt, let op de afmetingen van de zones die vormen rond elk putje. Hoge enzymatische activiteit kwalitatief betrekking op een grotere zone, terwijl lage enzymatische activiteit kwalitatief betrekking op een kleinere zone.

3. Substrate Labeling - Remazol Brilliant Blue R Dye Labeling [Modified van Zhou ^12]

Opmerking: In de kleurstof-afgifte test, het substraat covalent linked om briljante blauwe kleurstof R Remazol. Het volgende protocol beschrijft de bereiding van geverfde enzymsubstraten.

1. Wordt 250 mM natriumhydroxide (NaOH) door het oplossen van 1 g NaOH in 99 ml type I water wordt gebruikt voor het maken van een 200 mM oplossing Remazol briljant blauw R kleurstof (RBB).
2. Wordt 200 mM RBB oplossing door het oplossen van 1,25 g RBB in 98,75 ml ± 1 ml van een verse 250 mM NaOH-oplossing (stap 3,1).
3. Resuspendeer hitte gedode bacteriële cellen bij een concentratie van 0,5 g versgewicht in 30 ml RBB oplossing. Voor gezuiverde peptidoglycaan, resuspendeer de peptidoglycaan in een concentratie van 0,3 g versgewicht in 30 ml RBB oplossing.
4. Incubeer het reactiemengsel in een Erlenmeyer fles op een roterend platform gedurende 6 uur bij 37 ° C onder zachtjes mengen.
5. Breng het reactiemengsel tot 4 ° C incubator en incubeer gedurende nog 12 uur onder zachtjes mengen.
6. Na incubatie, verzamel de geverfde substraat door centrifugatie bij 3000 xggedurende 30 min. Schenk de kleurstofoplossing van het substraat pellet.
7. Verwijder niet-covalent gebonden oplosbare kleurstof van het substraat door het wassen van de kleurstof gemerkte cellen of peptidoglycan herhaaldelijk (ongeveer 3-5 wasbehandelingen) met Type I water gevolgd door centrifugeren. Bij elke toevoeging van water, grondig resuspendeer de pellet.
   Opmerking: Als geconsolideerd, oplosbare kleurstof niet meer zichtbaar in het waswater na centrifugeren. De ondergrond moet worden gegeven een extra wasbeurt. Merk op dat de ondergrond blauw zal blijven, terwijl de bovenstaande vloeistof van de laatste wasbeurt zal duidelijk zijn.
8. Bewaar de geverfde substraten gesuspendeerd in een minimale hoeveelheid water bij -20 ° C voor later gebruik.

4. Kwantitatieve Dye-afgifte test

Noot: Tijdens de kleurstof afgifte assay, de hydrolyse van RBB gekleurd substraat in de enzymreactie releases geverfde producten in de reactie supernatant. Colorimetrie van de hoeveelheid vrijgemaakte kleurstof geeft de amount enzymatische activiteit aanwezig in het monster voor een gegeven enzym. De kwantitatieve werkwijze maakt de vergelijking van verschillende enzymen in substraten en maakt variatie van omgevingscondities beïnvloeden de enzymatische reactie (bijvoorbeeld temperatuur, zoutgehalte, pH). Het volgende protocol beschrijft de voorbereiding en uitvoering van de kleurstof afgifte assay voor het kwantitatief detecteren van de enzymatische activiteit van antimicrobiële eiwitten.

1. Voorbereiding van de Dye-afgifte test
   1. Laat de bevroren geverfde substraat op kamertemperatuur en tweemaal wassen met testbuffer (PBS), die empirisch wordt bepaald voor de gegeven enzym.
   2. Bereken de hoeveelheid substraat suspensie die nodig is voor de 200 ul reactievolume vermenigvuldigen met het aantal kleurstof afgifte assays uit te voeren.
   3. De ondergrond suspensie door toevoeging geverfde substraat om het volume testbuffer, bepaald 4.1.2, totdat een optische dichtheid (OD) van 2,0 wordt bereikt bij 595 nm met een spectrofotometer. In de functionele beperkingen van de spectrofotometer te blijven meten van de OD 2,0 1,0 ₅₉₅ als een 1: 1 verdunning van de geconcentreerde oplossing. Gebruik assay buffer als blanco.
      Opmerking: Het substraat troebelheid van de reactie kan worden verhoogd dan 2,0 om de activiteitsniveaus van zeer efficiënte enzymen passen.
   4. Schorsen de antimicrobiële eiwit te evalueren in assaybuffer bij een concentratie van ongeveer 1 mg / ml.
   5. Met de microplaat assay van een BCA Protein Assay Kit volgens het protocol van de fabrikant, werd de werkelijke concentratie van het eiwit te bepalen monster. Dient de concentratie van de voorraadsuspensie tot 1 mg / ml met behulp testbuffer.
2. Met behulp van de Dye-afgifte test om te bepalen van de optimale Incubation Voorwaarden voor een eiwit Antimicrobial
   1. Verdun de voorraad proteïne antimicrobiële schorsing tot 100 ng / ul. Deze concentratie geeft afspronkelijke reactiemassa van 1 ug eiwit per volume (10 ui) toegevoegd aan de reactie assay.
   2. Bepaal het thermische bereik te worden beoordeeld op de bacteriolytisch eiwit. De verbrandingswaarde in deze testen onder 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C en 65 ° C.
   3. Voer het reactiemengsel assays 0,5 ml microcentrifugebuizen. Voor iedere thermische toestand, voeg 10 ul van de voorraad eiwitten tot 200 ul van voorbereide ondergrond schorsing.
   4. Incubeer in een thermische cycler voor 8 uur onder mengen door omkeren eenmaal per uur.
   5. Na incubatie aanhouding van de reacties door het toevoegen van 25 ul van ethanol.
   6. Verwijderen onverteerd, onoplosbare substraat door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 2 minuten, en breng 150 ul van de supernatant per reactie reactiemengsel een 96 putjes met vlakke bodem microplaat, verzorgen de pellet onverteerd substraat niet te verstoren.
   7. Meet enzymatische activiteit van het eiwit Antimicrobial voor de gegeven substraat door de hoeveelheid van oplosbare kleurstof RBB losgemaakt van het substraat na enzymatische hydrolyse. Om de enzymatische activiteit te kwantificeren, meet de absorptie van de supernatant bij 595 nm onder toepassing van een microplaat spectrofotometer. Verhoogde absorptie door de oplosbare kleurstof afgegeven in de bovenstaande vloeistof van het gemerkte substraat een kwantitatieve meting van enzymatische activiteit.
      Opmerking: De verandering in absorptie wordt vertegenwoordigd door activiteitseenheden (AU), waarbij 1 AU resulteert in een 0,01 toename in de optische dichtheid van de kleurstof afgifte reactie supernatant bij 595 nm. Een blanco reactie, geïncubeerd met alle reactiecomponenten behalve enzym wordt gebruikt om kleurstof die loskomt uit de RBB-gemerkt substraat door de incubatie aftrekken. De optimale enzymatische temperatuur biedt de piek activiteit unit meting.
   8. Herhaal stappen 4.2.1 tot 4.2.7 middels verschillende incubatie buffers, de optimale bufferomstandigheden voor antimicrobiële enzym te bepalen. in tHese assays, gebruik PBS.
3. Met de Dye-afgifte test aan de minimale actieve concentratie de optimale incubatietemperatuur bepalen voor een eiwit Antimicrobial
   1. Voer een seriële verdunning van de voorraad antimicrobiële eiwitten suspensie op met assay buffer. De verdunningsreeks bereik zal variëren met de werkzaamheid van het antimicrobiële enzym. De seriële verdunning gebruikt in deze assays geproduceerd eindassayconcentratie eiwit hoeveelheden 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug en 10 ug.
   2. Voer elke reactie test in een 48-well vlakke bodem microplaat. Voor elke assay staat, voeg 10 ul van de respectievelijke eiwitsuspensie tot 200 gl voorbereide ondergrond suspensie. Stel dat veranderingen in het volume van de eiwitoplossing aan het reactiemengsel toegevoegd aan 10 ui reactiebuffer gebruik.
   3. Sluit de microplaat met plaat afdichting film om het volume te variëren door verdamping te voorkomen. Incubeer in een shaker incubator bij de bepaalde optimale incubation temperatuur voor de gegeven eiwit antimicrobiële gedurende 16 uur onder schudden.
   4. Na incubatie aanhouding van de reactie door toevoeging van 25 gl ethanol aan elk putje en verwijderen onverteerde substraat door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 2 minuten.
   5. Transfer 150 ul van de supernatant per reactie reactiemengsel een 96 putjes met vlakke bodem microplaat, verzorgen de pellet van de onverteerde substraat niet te verstoren.
   6. Om de enzymatische activiteit te kwantificeren, meet de absorptie van de supernatant bij 595 nm onder toepassing van een microplaat spectrofotometer. Een blanco reactie, geïncubeerd met alle reactiecomponenten behalve enzym wordt gebruikt om kleurstof die loskomt uit de RBB-gemerkt substraat door de incubatie aftrekken. Verhoogde absorptie door de oplosbare kleurstof afgegeven in de bovenstaande vloeistof van het gemerkte substraat een kwantitatieve maat voor enzymatische activiteit.
      Opmerking: De verandering in absorptie wordt vertegenwoordigd door activiteiten eenheden (AU), waarbij 1 AU resultaten ineen 0,01 toename in de optische dichtheid van de kleurstof afgifte reactie supernatant bij 595 nm.

Resultaten

De microscoopglaasje diffusie test en de kwantitatieve dye-afgifte test zijn effectieve methoden voor het screenen en het meten van de eerste onderzoeken van de nieuwe eiwitten antimicrobiële middelen. Elke test heeft voordelen en beperkingen; Echter, wanneer deze wordt uitgevoerd in combinatie, ze laten een snelle eerste screening en de basiskarakterisering van een antimicrobiële.

Het microscoopglaasje diffusie assay maakt efficiënt de snelle screening van bibliotheken microbiële, produceert proteïne antimicrobiële middelen. Als dit enzym concentraties van belang zijn, kunnen detectiegevoeligheid beperkingen de assay beperken, die een grotere hoeveelheid enzym worden toegevoegd aan het reactiemengsel en dan de kleurstof-afgifte test. Zoals weergegeven in figuur 1, de kwalitatieve eigenschappen van de assay die waarnemer om relatieve hoeveelheden enzym aanwezig in elk putje te vergelijken.

In ontwikkelzone lysis, geïllustreerd in figuur 1A (25 ug enzym), de voorrand van de zone wordt troebel of onvolledige lysis van het substraat, terwijl de zone die het dichtst bij de bron geeft een meer complete substraat lysis. Dit verschijnsel, een product van de afnemende concentratie van de diffuserende enzym aan de voorrand, compliceert de nauwkeurige meting van de zone diameter. Aangezien de putjes B (15 ug), C (10 ug), D (5 ug), E (1,0 ug) en F (0,1 ug) worden waargenomen in Figuur 1, de diameter van de zone van volledige lysis verdwijnt uitsterven correleren het verlaagde hoeveelheid enzym. Voor conditie F (0,1 ug), de enzymconcentratie in de agarose onder de limiet waarmee de diffunderende enzym worden gevisualiseerd als het door de agarose beweegt, hydrolyseren van het substraat. De microscoopglaasje diffusie test werd ook uitgevoerd met behulp van gezuiverde Bacillus subtilis Peptidoglycan als substraat (figuur 2). Terwijl de zone minder gedefinieerd dan waargenomen bij volledige cel Salmonella enterica vanwege de weerstand van de peptidoglycan gelijkmatig schorsen de agarose, de hydrolyse van het peptidoglycaan van de onbekende antimicrobiële enzym blijkt.

De kleurstof-afgifte assay is een assay gevoelig en flexibel dan het microscoopglaasje diffusie assay, waarbij een onderste detectielimiet en veranderingen in de milieufactoren die de enzymreactie. In de representatieve assays werd varieerde de optimale temperatuur voor de antimicrobiële enzym te bepalen, bepaald 35 ° C in PBS (figuur 3) zijn. Dit optimum is duidelijk te zien in de reactie supernatanten als verhoogde hoeveelheden blauwe kleur (figuur 3B) als weergegeven in activiteitseenheden afgeleid uit absorptiemetingen bij 595 nm (figuur 3A). Deveelzijdigheid van de kleurstof-afgifte test kan de onderzoeker niet alleen de temperatuur, maar ook de reactiebuffer en buffercomponenten snel bepalen optimale incubatieomstandigheden voor een gegeven enzym variëren.

Het activiteitsniveau van de onbekende antimicrobiële enzym (figuur 4) en de α-chymotrypsine control enzym (figuur 5) werden gemeten op de bepaalde optimale incubatietemperatuur van 35 ° C in PBS tegen RBB-gemerkte Bacillus subtilis hitte gedode substraat. Vergelijking van de resultaten van Figuur 4 en Figuur 5 geeft aan dat de onbekende antimicrobiële enzym bijna tweemaal de affiniteit voor de B. subtilis substraat. Bovendien heeft het α-chymotrypsine control niet volledig verteren het warmte gedode B. subtilis substraat in de put (gegevens niet getoond). De activiteit van de α-chymotrypsine controle begint plaatau ongeveer 0,3 ug vergelijking met de aanhoudende stijging van activiteitseenheden voor alle enzymen bedragen voor de onbekende antimicrobiële enzym (Figuur 4 en Figuur 5). Dit kan betekenen dat het onbekende enzym een hogere aanhoudende activiteit of dat er een groter aantal splitsingsplaatsen waarover het enzym in de B. subtilis substraat.

Figuur 1:. Enzymactiviteit tegen Salmonella enterica Totaal celsubstraat De microscoopglaasje diffusie assay werd gebruikt om de activiteit van een onbekend eiwit antimicrobieel tegen verhitting gedood Salmonella enterica subsp kwalitatief geëvalueerd enterica (ATCC 10.708).. Het eiwit massa van het onbekende antimicrobiële gesuspendeerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die aan de respectievelijke putjes van toegevoegdde dia's onder 25 ug (nou ja A), 15 ug (nou ja B), 10 ug (nou ja C), 5 ug (nou ja D), 1 pg (nou ja E), en 0,1 ug (nou F). PBS alleen werd gebruikt voor de negatieve controles van de testen. Zones van lysis werden afgebeeld na een 6 uur incubatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2:. Enzymactiviteit tegen Bacillus subtilis peptidoglycaan celwand De microscoopglaasje diffusie assay werd gebruikt om de activiteit van een onbekend eiwit antimicrobieel tegen peptidoglycan van Bacillus subtilis 168 kwalitatief geëvalueerd. Gesuspendeerd in 20 pi PBS, 10 pg van het onbekende antimicrobiële was goed A van de microslides toegevoegd. PBS alleen werd gebruikt als negatievecontrole voor de test (well B). De zone van lysis werd in beeld gebracht na een 6-uur incubatie bij 37 ° C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3:. Optimale reactietemperatuur voor een eiwit antimicrobiële De veelzijdigheid van de kleurstof afgifte assay maakt de variatie van fysische en chemische parameters, zoals incubatietemperaturen en buffers, hun invloed op de activiteit van het enzym plaats ⁶ bepalen. Zoals getoond in deze figuur, was de activiteit van het onbekende eiwit antimicrobiële (1 ug) in PBS geëvalueerd tegen RBB-gemerkte hitte gedode Bacillus subtilis onder uiteenlopende incubatietemperaturen. Weergegeven als activiteitseenheden (AU) in (A), de absorptie van RBB-bound producten die in de supernatant na hydrolyse werd gemeten bij 595 nm onder toepassing van een microplaat spectrofotometer. Bij elke temperatuur conditie, reactie zonder toegevoegd enzym werden gebruikt om de effecten van elke vrijgemaakte kleurstof die resulteerden uit incubatie bij verschillende temperaturen aftrekken. De reactie supernatanten overeenkomt met elke incubatietemperatuur werden voorafgaand aan de absorptie meting (B) afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4:. Activiteit bereik voor een eiwit antimicrobiële Het bereik activiteit het onbekende eiwit antimicrobiële werd gemeten als activiteitseenheden na overnacht incubatie voor 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 en 1000 ng , zoals gemeten met de BCA protein assay (A). Voor deze reacties, de RBB-gemerkte B. subtilis substraat verhoogd werd tot een optische dichtheid van 5,0 bij 595 nm te geven opdat de reactie met de grootste hoeveelheid enzym (1000 ng) niet volledig hydrolyseren beschikbare substraat in het reactiemengsel incubatieperiode. Controlereacties zonder toegevoegd enzym werden gebruikt om de effecten van elke vrijgemaakte kleurstof door de incubatie alleen aftrekken. De reactie supernatanten die overeenkomt met elk enzym bedrag werden voorafgaand aan de absorptie metingen (B) afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5:. Activiteit Range voor α-chymotrypsine Activiteit bereik voor α-chymotrypsine werd gemeten als activity eenheden na overnacht incubatie voor 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 en 1000 ng enzym (A). Voor deze reacties, de RBB-gemerkte B. subtilis substraat verhoogd werd tot een optische dichtheid van 5,0 bij 595 nm te geven opdat de reactie met de grootste hoeveelheid enzym (1000 ng) niet volledig hydrolyseren beschikbare substraat in het reactiemengsel incubatieperiode. Controlereacties zonder toegevoegd enzym werden gebruikt om de effecten van elke vrijgemaakte kleurstof door de incubatie alleen aftrekken. De reactie supernatanten die overeenkomt met elk enzym bedrag werden voorafgaand aan de absorptie metingen (B) afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het microscoopglaasje diffusie assay en de kleurstof-afgifte assay voordelen opleveren voor het detecteren en karakteriseren van eerder geïdentificeerde proteïne antimicrobiële middelen. Deze snelle en gevoelige methoden kunt high-throughput screening van het organisme source libraries voor de identificatie van enzymen die van belang zijn voorafgaand aan het investeren meer onderzoeksmiddelen. High profile doel enzymen zijn geïdentificeerd, kunnen variaties van de detectie-assays worden gebruikt om het enzym snel detecteren of biochemische eigenschappen van het enzym te bepalen. Bijvoorbeeld, tijdens een meerstaps eiwit zuiveringsschema, het microscoopglaasje diffusie assay kan snel fracties die het enzym van belang te detecteren. Bovendien kan de reactie optima voor het enzym worden bepaald door het veranderen van de reactie buffers en incubatietemperaturen in de kleurstof-afgifte test.

Het bereik enzym massa voor detectie in het microscoopglaasje diffusie assay is afhankelijk enzym karakteriStokjes. Detectie beperkingen van de assay algemeen vereisen het gebruik van grotere hoeveelheden enzym dan de kleurstof-afgifte test. In deze studie, vergelijking van de detectielimieten van het microscoopglaasje diffusie assay (figuur 1) om de kleurstof-afgifte assay (figuur 4) blijkt dat het microscoopglaasje diffusie assay is een minder gevoelige technieken dan de kleurstof-afgifte test. Wanneer enzymconcentratie is geen probleem, het microscoopglaasje assay maakt snelle initiële screening van bibliotheken voor de productie van eiwitten tegen antimicrobiële doelsubstraten met lage arbeidskosten en apparatuur vereist. Hoewel die meer inspanning en apparatuur, de kleurstof-afgifte test is gevoeliger en reproduceerbaar, waardoor kwantitatieve resultaten die vergelijking tussen kleurstof afgifte assays van dezelfde of verschillende enzymen voor een bepaald substraat mogelijk. Beide methoden worden gemakkelijk uitgevoerd in de meeste microbiologische laboratoria zonder de noodzaak van gespecialiseerde apparatuur. In de vertegentieve assays, de controle enzym, α-chymotrypsine werd gedetecteerd bij bedragen vanaf 100 ng (figuur 5) met de kleurstof-afgifte test, terwijl de gedetecteerde in het microscoopglaasje diffusie assay minimale bedroeg 1 ug (gegevens niet getoond).

Waardoor voorzieningen als kwalitatieve detectie assay voor antimicrobiële enzymen zijn een aantal variaties van de diffusie assay gemeld ^11,13. Bij de herziening van deze testen, werd het microscoopglaasje diffusie test ontwikkeld voor de relatief hoge gevoeligheid als een eerste scherm en voor het gemak van de reactie naleving. Modificatie van het werk van Lachica et al. ^11, waarin agarose overlays werden gebruikt voor de productie van nucleasen te detecteren door stammen van Staphylococcus aureus, het microscoopglaasje diffusie assay werkt vergelijkbaar met de radiale immunodiffusie werkwijze ¹⁴ als eiwit diffundeert uit de put in de agarose bevattende het substraat. De radiale immunodiffusie werkwijze stopt de uitbreiding van het gebied van immunoprecipitatie wanneer het systeem een ​​complexvorming evenwicht tussen de diffunderende antigeen en antistof in de agarose bereikt. Daarentegen wordt het substraat van het microscoopglaasje diffusie assay aanvankelijk verteerd door de diffunderende antimicrobiële eiwit in een voortdurend groeiende zones van lysis rond de put. De toenemende diameter van de zone gaat door totdat de enzym activiteit verliest of het substraat wordt bereikt. De snelheid van de productie van de zone van lysis wordt versneld als de zuiverheid en dus tot een specifieke activiteit van het enzym of de concentratie van het enzym toegevoegd aan de put toeneemt.

Voor het kwantitatief beoordelen van de enzymatische activiteit van proteïne antimicrobiële middelen tegen hitte gedode B. subtilis, de kleurstof-afgifte test werd gekozen. Colorimetrische assays met behulp van Remazol briljante blauwe kleurstof R (RBB) -gemerkte substraten toe veelzijdig en gevoelige evaluatie van eiwit antimicrobiële activity. Enzymatische hydrolyse van RBB-gemerkt substraat resulteert in de afgifte van oplosbare blauwe producten die gemakkelijk door een spectrofotometer kan worden gemeten bij 595 nm. Verscheidene variaties van de RBB kleurstof afgifte assay ontwikkeld om andere eiwitten antimicrobiële enzymen karakteriseren, tonen de flexibiliteit van deze assay voor toepassing met andere substraten. Bijvoorbeeld het bepalen van de effecten van lysostafine bacteriolytisch activiteit, Zhou, et al. Rapporteerde een kleurstof-afgifte assay met behulp RBB-geverfd Staphylococcus cellen en staphylococcen peptidoglycaan als substraten ^12. In een modificatie van de toepassing van deze RBB kleurstof-afgifte assay werd RBB-gemerkt Micrococcus luteus substraat voorgesteld voor gebruik als een snelle en gevoelige middelen voor de diagnose en het scherm van ziekten zoals bacteriële infectie en de aanwezigheid van een kwaadaardige carcinoom, dat kan worden gecorreleerd aan humane lysozym expressieniveaus in bloedserum ^15. Bovendien RBB-gelabelde bacteriële cel substraten eenlso gebruikt in een zymogram werkwijze voor de detectie van ¹⁶ lysozym.

We tonen de verlaagde detectielimiet, het gemak en reproduceerbaarheid van de kleurstof afgifte assay, om snelle screening van bibliotheken van enzymproductie. Modificaties van de assay mogelijk maken downstream kwantitatieve biochemische karakterisering assays, met inbegrip van effecten van temperatuur, pH, zoutgehalte en de effecten van andere proteolytische enzymen op de activiteit van antimicrobiële eiwitten ^6. Bovendien kan de kwantitatieve kleurstof afgifte assay worden gebruikt om de activiteiten van verschillende enzymen vergelijken voor een bepaald substraat. De RBB kleurstof-afgifte assay nut enzymen met activiteit tegen polysacchariden naast de karakterisering en detectie van eiwit antimicrobiële middelen beschreven. Pettersson en Eriksson rapporteerde een test voor het detecteren endoglycanase activiteit met amorf, RBB-geverfd polysaccharide kralen van cellulose, xylaan, mannan, en chit¹⁷ in. In een uitbreiding van deze bevindingen, een gevoelige detectiemethode voor chitinase enzymen die door Bacillus thuringiensis Bt-107 werd ontwikkeld met behulp van colloïdale chitine gemerkt met RBB ^18. Uit deze en andere studies, commercieel beschikbare bronnen van RBB-geverfde substraten ontstaan ​​voor gebruik bij detectie van glycolytische activiteit onder meer tegen keratine, amylopectine, amylose, glycogeen, laminarine, d-xylaan, Azo-glucaan gerst, en zetmeel.

In deze studie tonen we het nut van de kleurstof-afgifte test in een microplaat vorm, vermindering van de omvang van RBB-gemerkt substraat en enzym vereist om de colorimetrische resultaat. Zoals geïllustreerd in Figuur 4 en Figuur 5, de microplaat kleurstof-afgifte test levert een lagere detectiegrens dan microscoopglaasje diffusie assay voor enzymatische activiteit detectie. Met betrekking tot de snel gebruik, het behoud van de arbeid, en het gemak van interpretatie, de microfoonroslide diffusie assay biedt nut in eerste high-throughput schermen van antimicrobiële activiteit en de indicatie van antimicrobiële eiwitten aanwezig in downstream eiwitisolatie en zuiveringsstappen. De combinatie van deze twee assays vullen elkaar in de eerste screening en uiteindelijke karakterisering van nieuwe proteïne antimicrobiële

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid	Becton Dickinson	3078
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595)	Corning, Inc.	3595
agarose	Fisher Scientific	BP162-100
α-chymotrypsin	MP Biomedicals	215227205
Bacillus subtilis 168	American Type Culture Collection	23857
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad
cork borer	Humboldt	H-9661
lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876-1G
McFarland equivalence standard (2.0)	Fisher Scientific	R20412
microslides	Fisher Scientific	22-38-103
nutrient broth	Fisher Scientific	S25959B
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168	Sigma-Aldrich	69554-10MG-F
phosphate-buffered saline (1x)	Teknova	P0200
Pierce BCA Protein Assay Kit	Life Technologies	23227
Synergy HT microplate spectrophotometer	BioTek Instruments, Inc.
Remazol brilliant blue R dye (RBB)	Sigma-Aldrich	R8001
Salmonella enterica subsp. enterica	American Type Culture Collection	10708
sodium azide	Fisher Scientific	S227-100
sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318-500
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film	Diversified Biotechnology	T-TOPS-50
UltraPure distilled water	Invitrogen	10977-015
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Oplossing
agarose-oplossing 50 ml PBS 0,25 g agarose			Voeg 10% natriumazide toe aan de gesmolten PBS/agarose-oplossing
voedingsbouillonmedium 4 g voedingsbouillon 500 ml Type I water
250 mM natriumhydroxide (NaOH) -oplossing 1 g NaOH 99 ml Type I water
200 mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 1,25 g RBB 98,75 ml 250 mM NaOH-oplossing