Methodenartikel

Mechanisme van de verordening van Adipocyte Numbers in volwassen organismen door differentiatie en apoptose Homeostasis

17.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53822

⸱

3 juni 2016

 , 
1Department of Medicine 3, Rheumatology and Immunology, Universitätsklinikum Erlangen, 2Nikolaus Fiebiger Center of Molecular Medicine, Universitätsklinikum Erlangen

In dit artikel

Samenvatting

Vetweefsel (AT) kan de homeostase van het hele lichaam beïnvloeden, daarom is het begrijpen van de moleculaire mechanismen van adipocytendifferentiatie en -functie van belang. We bieden een protocol voor het verkrijgen van nieuwe inzichten in deze processen door adipocytenhomeostase, differentiatie en blootstelling aan hypoxie te analyseren als een model voor geïnduceerde adipocytenapoptose.

Samenvatting

Aangezien vetweefsel (AT) een endocriene klier is, kan het de hele lichaamsmetabolisme beïnvloeden. Overmatige energieopslag leidt tot de verstoring van adipocyten, wat op zijn beurt abnormale secretie van adipokinen veroorzaakt, en metabolische syndromen zoals obesitas, dyslipidemie, hyperglykemie, hyperinsulinemie, insulineresistentie en type 2 diabetes veroorzaakt. Daarom kan het onderzoeken van de moleculaire mechanismen achter adipocytenverstoring helpen bij het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën. Ons protocol beschrijft methoden voor het evalueren van de moleculaire mechanismen die worden beïnvloed door hypoxische omstandigheden van het AT, wat correleert met adipocytenapoptose bij volwassen muizen. Dit protocol beschrijft hoe AT in vivo te analyseren door middel van genexpressieprofilering evenals histologische analyse van adipocytendifferentiatie, proliferatie en apoptose tijdens blootstelling aan hypoxie, vastgesteld door middel van kleuring van hypoxische cellen of HIF-1α proteïne. Verder voltooit in vitro analyse van adipocytendifferentiatie en de reacties hierop bij verschillende stimuli de karakterisering van de moleculaire paden achter mogelijke adipocytendysfunctie die tot metabolische syndromen leidt.

Inleiding

Volgens het rapport van de World Health Organization 2014, 39% van 's werelds volwassen bevolking lijdt aan overgewicht en 13% zwaarlijvig is 1. In de nabije toekomst zullen mensen met overgewicht een belangrijk deel van de oudere bevolking omvatten. Een belangrijk kenmerk van obesitas en veroudering ontregeling van vet in relatie tot morbiditeit en mortaliteit 2. Adipokines, eiwitten gesecreteerd door vetweefsel (AT), kan leiden metabool syndroom, zoals obesitas en type 2 diabetes 3. Stofwisselingsziekten worden meestal veroorzaakt door overmatige energieopslag in de vetdruppels van adipocyten, waardoor AT expansie 4. Het is daarom van belang om de oorzaken en de moleculaire mechanismen van AT expansie te bepalen met het oog op de mogelijkheden om het onder controle te vinden.

Over-voeding leidt tot AT uitbreiding, die wordt geregeld door twee gebeurtenissen: overmatige opslag van energie in de vetdruppels van adipocyten, een proceswaardoor hypertrofie (toename van adipocyten grootte) en verhoogde adipogenese, ook bekend als adipocyten hyperplasie 5. Adipogenese is een proces van differentiatie van multipotente mesenchymale stamcellen (MSC) tot adipocyten. Ten eerste, MSC's zich ontwikkelen tot preadipocyten tijdens de inzet fase. In de tweede plaats, preadipocyten verder te differentiëren naar de kenmerken van de volwassen en functionele adipocyten 6 te verwerven. Verscheidene transcriptiefactoren zijn geïdentificeerd als master regelaars voor preadipocyt bepaling, zoals zinkvingereiwit 423 (Zfp423) en vroege B-cel factor 1 (Ebf1). Overwegende Zfp423 induceert vroege betrokkenheid, is Ebf1 nodig is voor het genereren van adipocyten voorlopers 6. Terminale differentiatie wordt streng gecontroleerd door een transcriptionele cascade, waarbij peroxisoom proliferator geactiveerde receptor γ (PPARy) is de essentiële transcriptiefactor 7. Andere belangrijke factoren zijn de transcriptie CCAAT / enhancer-bindend eiwit (C/ EBP) familieleden (dat wil zeggen, C / EBPα, C / EBPB en C / EBPδ), Krüppel-achtige factoren (KLFs), cAMP responsief element-bindend eiwit (CREB) en vroege groei respons 20 (Krox20) 6.

Recentelijk is aangetoond dat de activator proteïne-1 (AP-1) familie is betrokken bij de adipocyten differentiatieproces 8,9. De AP-1 familie wordt gevormd door een dimeer eiwitcomplex, samengesteld Fos, Jun en / of activerende transcriptiefactor (ATF) leden. Fos-gerelateerde antigen 1 en 2 (Fra-1 en Fra-2) kunnen adipocytdifferentiatie regelen. Fra-1 schaadt adipocytdifferentiatie door remming van C / EBPα 8, terwijl Fra-2 controles adipocyten omzet 9. Fra-2 daarbij niet alleen vermindert het aantal vetcellen door het onderdrukken van PPARγ2 expressie tijdens differentiatie van adipocyten, maar vermindert ook adipocyten apoptose door middel van directe onderdrukking van hypoxie-induceerbare factoren (HIFs) expressie. Het HIF familie is een heterodimeric transcriptiefactor complex, bestaande uit HIF-1α HIF-2α en HIF-1β. De heterodimeren bestaan ​​uit een zuurstofgevoelige HIF-α eiwit (HIF-1α en HIF-2α) en het zuurstof-ongevoelige HIF-1β subeenheid 10. Tijdens normoxia, HIF-α eiwitten poly-ubiquitinylated en worden uiteindelijk afgebroken door proteasomen 11. Onder hypoxische omstandigheden bij ten tijdens expansie, HIF-α eiwitten niet meer gehydroxyleerde. Zij derhalve gestabiliseerd en dimeren vormen met constitutief tot expressie HIF-1β worden. Transcriptionele activering van genen beheerst door de HIF responselementen is betrokken bij de regulatie van angiogenese, metabolisme en ontsteking 12. Inderdaad, HIF-1α bevordert AT dysfunctie door het induceren glucosetolerantie remmen energieverbruik en perifere gebruik van lipide, en door verhogen leptinespiegel en HFD-geïnduceerde hepatische steatosis 13. Bovendien HIF-1α regelt adipocyte apoptose in vivo en in vitro 9.

Het huidige protocol beschrijft methoden voor het bestuderen van AT status aan de moleculaire eigenschappen van adipocyten homeostase te ontrafelen in volwassen muizen. Het laat zien hoe apoptosis, proliferatie en differentiatie van adipocyten in vivo en in vitro kan worden gereguleerd door hypoxie. Om dit te doen, maken we gebruik van muizen met adipocyten specifieke deletie van Fra-2 geproduceerd door het kruisen van muizen die het Fra-2 floxed allelen met Fabp4-CreERT muizen 9. Door het gebruik van Fabp4-Cre ERT muizen, de verwijdering is adipocyten specifiek en geïnduceerd door tamoxifen injectie 14. Voor de volwassen model worden intra peritoneale injecties van tamoxifen uitgevoerd meer dan 5 opeenvolgende dagen vanaf de leeftijd van 6 weken. Aldus worden de muizen onderworpen aan een normaal dieet of een vetrijk dieet gedurende 6 weken voordat de analyse wordt uitgevoerd. De muizen gebruikt in deze studie werden mannelijke gebaseerd op een C57Bl6 achtergrond vrouwelijke hormonen zoals estrogenen voorkomen, Aangetoond dat de verdeling van lichaamsvet 15 reguleren. Een andere genetische achtergrond Ook veranderen de metabole fenotype, door stam-gerelateerde verschillen in lipide beheer 16.

Dit protocol laat zien hoe AT analyseren onder hypoxie met behulp van histologie en hoe adipocyten apoptose, proliferatie en differentiatie in vivo te kwantificeren met behulp van immunohistochemie en gen profilering analyses. Het onderzoek is voltooid door in vitro experimenten laten zien hoe primaire adipocyten differentiatie en apoptose veranderd door blootstelling aan hypoxie analyseren.

Protocol

ETHIEK STATEMENT: dieren zijn ondergebracht in gestandaardiseerde omstandigheden volgens de richtlijnen van de Duitse Animal Welfare Act. Dieren worden gevoed met een standaard dieet en water ad libitum en hield met een 12 uur dag / nacht cyclus. Alle experimenten met dieren worden goedgekeurd door de lokale ethische commissie.

1. In vivo analyse van Adipocyte Homeostasis bij volwassen mannen

  1. Hypoxie kwantificeren in vivo, eerst bepalen het lichaamsgewicht van de muizen, injecteer 60 mg / kg lichaamsgewicht vast pimonidazole hydrochloride intraperitoneaal (bijvoorbeeld: injecteer 1,5 mg in een 25 g muis). Pimonidazole is een effectieve hypoxische marker, die adducten vormen met thiolgroepen in eiwitten, peptiden en aminozuren en wordt gedetecteerd door een specifiek antilichaam.
  2. Offer muizen en verwijder de perigonadal vetkussentjes (figuur 1).
    1. 45 min na injectie, offeren muizen door CO 2 stikken en daaropvolgende cervicale dislocatie.
    2. Vastpinnen de benen van muizen (zie figuur 1) en open de buikholte. Verwijder de linker en rechter perigonadal (epididymaire) vetkussentje in de peritoneale holte.
      Noot: vetkussentje zijn gebonden aan de bijbal de peritoneale bladen zoals getoond in figuur 1 (perigonadal vetkussentjes zijn aangegeven met pijlen).
    3. Zorg ervoor dat de gonadale weefsels uit het vet pad te verwijderen. Bepaal vetkussentje gewichten om de verhouding te berekenen: vetkussentje gewicht (g) per lichaamsgewicht (g).

figure-protocol-1
Figuur 1: Plaats van de perigonadal vetkussentjes in de peritoneale holte van muizen. Beeld van perigonadal vet lokalisatie in volwassen muizen na offer. Perigonadal vetkussentjes worden aangegeven door de pijlen. Klik hier om vIEW een grotere versie van deze figuur.

  1. Om een ​​kwantitatieve genexpressie profiel samen te stellen, gebruikt u een perigonadal vet pad om RNA te isoleren. Opmerking: Tot het weefsel wordt verwerkt, opslag weefselmonsters in RNA stabilisatie oplossing bij -80 ° C of in vloeibare stikstof.
    1. Om het vet pad te homogeniseren, voeg de vetkussentje tot 1 ml éénfase oplossing van guanidine isothiocyanaat en fenol. Gebruik buisjes met keramiek kralen (1,4 mm) om het weefsel in een homogenisator bij 6500 rpm verpletteren (2 maal 20 seconden met 30 sec pauze).
    2. Isoleer de RNA als (single-step methode Chomczynski en Sacchi 17) volgt.
      1. Om de fasen te scheiden, overdragen gehomogeniseerd vetkussentje tot microcentrifugebuis, voeg 0,2 ml volume chloroform, schud gedurende 15 sec, incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer 12.000 xg gedurende 5 minuten. Breng de bovenste waterige fase (ongeveer 400 ui), waarin het RNA bevat, in een nieuwe microcentrifugebuis. Laat de niet omvatten DNA-bevattening interfase of het eiwithoudende fenol fase.
      2. Aan het RNA te precipiteren, voeg 1 volume isopropanol, meng en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C (het is ook mogelijk om te incuberen bij -20 ° C gedurende de nacht). Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 10 min. Verwijder isopropanol supernatant voorzichtig. Was tweemaal met 75% ethanol centrifugestappen van 12.000 xg gedurende 10 min.
      3. Na drogen van de geprecipiteerde RNA ongeveer 10 minuten bij kamertemperatuur oplossen in 50 ui H2O (RNase-vrij). Om dit te vergemakkelijken, incubeer gedurende 2 minuten bij 65 ° C.
        Opmerking: Bewaar RNA in 75% ethanol bij -80 ° C of in vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
      4. Kwantificeren van de RNA voorbereidingen door A 260/280 (optimale quotiënt is tussen 1,8 en 2,2) en bereken de concentratie door A 260:
        figure-protocol-2
    3. DNA verontreiniging te voorkomen, te verteren 1 ug van het RNA preparaatmet 1 U DNase I gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een volume van 10 pl. Inactiveren bij 65 ° C gedurende 10 minuten.
      Opmerking: Deze stap is optioneel.
    4. Gebruik 10 pl RNA preparaat dat 1 ug RNA voor de reverse transcriptase reactie enkelstrengs cDNA geschikt voor kwantitatieve PCR applicatie versturen. De componenten en hun hoeveelheden worden in tabel 1.
    5. Gebruik een PCR Master Mix van kwantitatieve real-time PCR reactie. Metabole veranderingen in de gehele vetkussentje bepalen gebruiksspecifieke primers voor genen betrokken bij homeostase AT (tabel 2) en de in tabel 3 vermelde PCR-omstandigheden.
    6. Real-time PCR data-analyse.
      1. Definieer de basislijn (figuur 2), gewoonlijk cyclus 1 tot 15, waarbij er geen verandering in fluorescentiesignalen. De real-time PCR software normaliseert specifieke fluorescentie signalen naar de basislijn fluorescentie en de interne referentie kleurstof, ROX, waardoorde grootte van de specifieke signalen van de primers, delta Rn (ΔRn).
      2. Stel de drempel in de exponentiële fase van de amplificatiecurve. Het snijpunt definieert de drempelcyclus (Ct). Op basis van de CT waarde, berekent de relatieve expressie (ACt) en de veelvoudverandering (ΔΔCt):
        figure-protocol-3
        figure-protocol-4
bestanddeel Volume ul / reactie
10x RT Buffer 2.0
25x dNTP Mix (100 mM) 0.8
10x RT Random Primers 2.0
MultiScribe Reverse Transcriptase 1.0
Nuclease-vrij H2O 4.2
1 ugRNA 10
Totaal per reactie 20

Tabel 1: Bestanddelen met respectieve volume voor de reverse transcriptase reactie enkelstrengig cDNA te genereren.

Officiële volledige naam Symbool Sequence 3'-> 5'
vooruit Omgekeerde
adipogenese Delta-like 1 homoloog (pref-1) Dlk1 GACACTCGAAGCTCA
CCTGG 		GGAAGGCTGGGACGG
GAAAT
Vroege B-cel factor 1 Ebf1 CCACCATCGACTACGG
CTTC 		TCCTGGTTGTTGTGGGG
CATC
Zinkvingereiwit 423 Zfp423 GTGCCCAGGAAGAAGA
CGTA 		GGCGACGTGGATCTGA
ATCT
Vetzuur bindend eiwit 4 (Ap2) Fabp4 TCACCTGGAAGACAGCT
CCTC 		AAGCCCACTCCCACTTC
TTTC
CCAAT / versterker bindend eiwit (C / EBP), alfa Cebpa AAGAGCCGCGACA
AGGC 		GTCAGCTCCAGCACCT
TGTG
CCAAT / versterker bindend eiwit (C / EBP), beta Cebpb TTTCGGGACTTGATGC
AATC 		CCGCAGGAACATCTTT
AAGG
cAMP responsief element-bindend eiwit 1 Creb1 ACTCAGCCGGGTACT
ACCAT 		TTGCTGCCTCCCTGTT
CTTC
CCAAT / versterker bindend eiwit (C / EBP), delta Cebpd CAGCGCCTACATTGAC
TCCA 		GTTGAAGAGGTCGGCG
AAGA
Krüppel-achtige factor 4 Klf4 GCAGTCACAAGTCCCC
TCTC 		TAGTCACAAGTGTGGG
TGGC
Vroege groei reactie 2 (Krox20) Egr2 AGGCGGTAGACAAAATC
CCAG 		GATACGGGAGATCCAG
GGGT
Peroxisoomproliferator activated gamma PPARg AGAGGTCCACAGAGCTG
ATTC 		GATGCACTGCCTATGAGC
ACTT
lipogenese Acetyl-Coenzyme A carboxylase alpha Acaca TGGGGACCTTGTCTTCA
TCAT 		ATGGGCGGAATGGTCTC
TTTC
Vetzuur synthase FASN ACATCCTAGGCATCC
GAGA 		CCGAGTTGAGCTGGGT
TAGG
Stearoyl-Coenzyme A desaturase 1 SCD1 CGGGATTGAATGTTCTTG
TCGT 		TTCTTGCGATACACTCTG
GTGC
lipolyse Patatin-achtige fosfolipase domein containing 2 Pnpla2 AAGGACCTGATGACCA
CCCT 		CCAACAAGCGGATGGT
GAAG
Vetzuur opname lipoproteïne lipase LPL GTATCGGGCCCAGCAA
CATTATCC 		GCCTTGCTGGGGTTTTC
TTCATTC
CD36 antigen CD36 GTCTTCCCAATAAGCATGT
CTCC 		ATGGGCTGTGATCGGA
ACTG
hypoxie Hypoxie-induceerbare factor 1, alfa subeenheid HIF1a CCTGCACTGAATCAAGAG
GTGC 		CCATCAGAAGGACTTGCT
GGCT
Endotheel PAS-domeineiwit 1 (eveneens bekend als HIF-2alpha) EPAS1 CAAGCTGAAGCTAAAG
CGGC 		TTGGGTGAATTCATCG
GGGG
Von Hippel-Lindau tumor suppressor VHL ACCGAGGTCATCTTTG
GCTC 		TTCCGCACACTTGGGT
AGTC
Arylkoolwaterstofreceptor nucleaire translocator (eveneens bekend als HIF-1 beta) Arnt TGGGTCATCTTCTCGC
GGTT 		TGTCCTATCTGAGCAT
CGTG

Tabel 2: Lijst van genen met sequentie van de respectievelijke primers die voor de analyse van adipocyten homeostase.

Stap Temperatuur (° C) Tijd (min: sec)
polymerase activering Greep 95 10:00
PCR 40 cycli Denaturize 95 00:15
Annealing / Extension 60 01:00
smeltcurve 60-95 0,5 ° C / sec

Tabel 3: Real-time PCR-omstandigheden.

figure-protocol-5
Figuur 2:. Kenmerken van de real-time PCR-amplificatie curve Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Om histologische analyse van de adipocyten homeostase te voeren, gebruikt u de tweede perigonadal vet pad. Mis het weefsel niet uitdrogen!
    1. Bevestig het vet pad in 3,7% PBS-gebufferde formaldehyde 's nachts, inbedden in paraffine (volg de instructies zoals elders 18 beschreven) en snijd de ingebedde weefsel in 2-5 pm dikke secties (maximaal 5 pm).
    2. Bepaal het aantal adipocyten per veld en adipocyten grootte in een bright-field microscoop na hematoxyline en eosine (H & E) kleuring:
      1. Deparaffinize secties door wassen 3 maal gedurende 5 minuten in xyleen en hydrateren sectie 2 keer gedurende 2 minuten in 100% ethanol en 2 maal gedurende 2 minuten in 96% ethanol. Tenslotte was het gedeelte in gedestilleerd H 2 O 5 min.
      2. Vlek met hematoxyline, verdund 1: 5 met gedestilleerd H2O, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en wassen in H2O gedurende 5 min. Vlek met eosine-oplossing (20 ml 5% eosine Y / 210 ml gedestilleerd H2 O / 25 ul ijsazijn) gedurende 30 sec en nawassen met H 2 O 5 min.
      3. Uitdrogen gebieden af ​​met 96% ethanol en 100% ethanol elk 2 maal gedurende 2 min, en xyleen 3 maal gedurende 5 min. Monteer de secties met watervrije montage middel.
      4. Evalueer de secties onder een stralend-veld microscoop. Een representatief voorbeeld van adipocyten analyseren ImageJ 1.48v 19 wordt getoond in Fig. 3: aantal cellen per gebied (um 2), mobiele omgeving (10 x 3 urn 2 ), celgrootte (pm).
        1. Open het beeld van de sectie met ImageJ 1.48v. Als de parameters van de afbeelding in pixels in plaats van een eenheid van lengte zijn aangegeven, de omvang.
        2. Selecteer * Rechte lijn * in de knoppenbalk en stel de lijn naar een bekende afstand aan de hand van de schaal bar. Ga naar Analyseren -> Set Schaal, de afstand van de lijn wordt weergegeven in pixels;. voeg de bekende afstand en de lengte-eenheid, bijvoorbeeld urn. Bevestig met OK. De grootte van het beeld en de analyse van de parameters zijn aangegeven in de lengte-eenheid gegeven.
        3. Om de parameters van de adipocyten te bepalen, passen de drempel. Ga naar Afbeelding -> Aanpassen -> Drempel om de drempel te openen. Selecteer de volgende instellingen: Thresholding: Standaard; Threshold kleur: B & W; Kleurruimte: HSB. De afbeelding wordt nu weergegeven in zwart-wit. Pas de .... aanHelderheid witte adipocyten wissen en zwarte intercellulaire ruimten te sluiten, zoals in Fig. 3b.
        4. Tel het aantal adipocyten per micrometer 2 (figuur 3e) met de * multi-point * selectie in de werkbalk en markeer elke cel voor het tellen.
        5. Om de adipocyten maat te bepalen, selecteert u * rechte lijn * opnieuw in de werkbalk en teken de diameter van een adipocyten (figuur 3c). Ga naar Analyseren -> Meten en een nieuw venster verschijnt, met de lengte van de diameter in micrometer.
        6. Om de adipocyten gebied te bepalen, selecteert u * Wand (tracing) gereedschap * en klikt u in de adipocyten. De binnenwand van de adipocyten is geselecteerd in rood (figuur 3d). Ga naar Analyseren -> Meten en een nieuw venster verschijnt, met de oppervlakte van deze vetcellen in um 2.
    3. voor immunohistochemistry, de voorbereiding van de sectie voor antilichaam en TdT-gemedieerde dUTP-biotine nick end labeling (TUNEL) kleuring als volgt:
      1. Deparaffinize secties door wassen 3 maal gedurende 5 minuten in xyleen en hydrateren sectie 2 keer gedurende 2 minuten in 100% ethanol en 2 maal gedurende 2 minuten in 96% ethanol. Tenslotte was het gedeelte in gedestilleerd H2O
      2. Voor antigen retrieval, verteren het gedeelte weefsel voor 30 min bij 37 ° C met proteïnase K werkoplossing (20 ug / ml in 10 mM Tris / HCl, pH 7,4-8) en spoelen met PBS.
    4. Voer antilichaam kleuring in natte kamers:
      1. De endogene peroxidase te blokkeren, gebruikt 3% waterstofperoxide in PBS gedurende 10 min, vervolgens wassen met 2 maal gedurende 5 min in PBS. Om de aspecifieke binding van antilichamen blokkeren, gebruikt 10% serum in PBS. Gebruik het serum van de gastheer van het secundaire antilichaam, in dit geval geit.
      2. Voor de kleuring gebruikt de antilichamen van apoptose, proliferatie en hypoxie detectie ( Tabel 4). Verdun antilichamen in PBS / 10% geit serum. Incubeer bij 4 ° C overnacht. Was de secties 3 keer voor 5 min in PBS.
      3. Ter verbetering van het signaal gebruikt een gebiotinyleerd secundair antilichaam, met de verdunning zoals vermeld in tabel 5. Voor hypoxia detectie Gebruik HRP geconjugeerd konijn anti-FITC als secundair antilichaam. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Was de secties 2 keer 5 min met PBS.
        Opmerking: Voor de hypoxie kleuring met FITC-MAb1, slaat u stap 1.4.4.4) en ga verder met stap 1.4.4.5).
      4. Voor elk objectglaasje, pre-incubeer 50 ul avidine-oplossing met 50 ul gebiotinyleerd peroxidase H gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (deze methode wordt ook wel avidine / biotine ABC complex formulering) en vervolgens aan de secties nog 45 min. Was 2 keer gedurende 5 min met PBS.
      5. Incubeer de secties peroxidase substraatoplossing tot kleuring intenser (5 tot 10 min). Wassen 5 minuten met gedestilleerdH 2 O.
      6. Voor tegenkleuring, kleuring met hematoxyline verdund 1: 5 met gedestilleerd H2O gedurende 10 min bij kamertemperatuur en wassen in H2O gedurende 5 min.
      7. Uitdrogen secties in 96% ethanol en 100% ethanol elk 2 maal gedurende 2 min, en xyleen 3 maal gedurende 5 min. Sluit de secties met dekglaasjes en watervrij montage middel. Evalueer de secties onder een stralend-veld microscoop.
    5. Bepaal apoptose door TUNEL-test en volg de instructies van de fabrikant:
      1. Voeg 50 ul enzymoplossing in 450 ul labeloplossing. Breng vervolgens 50 pi reactiemengsel TUNEL op histologische secties en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer in het donker. Was de secties 3 keer met PBS gedurende 5 minuten en monteer met fluorescentie montage medium met inbegrip van DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) voor tegenkleuring.
      2. Evalueer de afdeling onder een fluorescentiemicroscoop met 100-voudige magnificat ion. Voor het meten van fluoresceïne gebruik van een excitatiegolflengte van 488 nm en detecteert tussen 515-565 nm (groen laser); DAPI windt bij ongeveer 360 nm en emitteert bij ongeveer 460 nm wanneer gebonden aan DNA (blauwe laser).
      3. Kwantificeren van de overlays van DAPI en Fluoresceïne:
        figure-protocol-6

figure-protocol-7
Figuur 3:. Analyseren adipocyte kenmerken vetkussentje paneel- Foto de perigonadal vetkussentje van mannelijke muizen behandeld met een vetrijk dieet (HFD) of normaal dieet (ND) met een helder-veld microscoop (a); de drempel wordt aangepast in zwart en wit (b) en de adipocyten grootte (lengte, c), ruimte (d) en adipocyten aantal cellen per mm 2 (e) worden gekwantificeerd met ImageJ 1.48v.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

voorraadconcentratie verdunning
apoptose Gesplitst caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb 1: 2000
Proliferatie Gezuiverd Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) 01:50
hypoxie HIF-1 alpha Antilichaam 1: 100
FITC-MAb1 1: 100

Tabel 4: antilichamen met respectievelijke verdunning voor de immunohistologische kleuring van secties AT.

Antilichaam verdunning
gebiotinyleerde antimuis IgG (H + L) 1: 200
gebiotinyleerd anti-muizen IgG (H + L) 1: 200
HRP conjugaten konijn anti-FITC 1: 100

Tabel 5: Secundaire antilichamen met verdunningswater voor immunohistologische kleuring.

2. In vitro Analyse van Adipocyte Homeostasis Beïnvloed door hypoxie

  1. Offer muizen en verwijder het onderhuidse vetweefsel.
    1. Offer de muizen door CO 2 stikken en de daaropvolgende cervicale dislocatie.
    2. Vastpinnen de benen van muizen weergegeven in figuur 4. Verwijder de huid van het bovenbeen, lendenen en vang en pin hem met pennen zo in figuur 4. Verwijder daarna het onderhuidse vetweefsel, dat zich posterieur aan de basis van de achterpoten, rond de inguinale lymfeknopen (zie figuur 4, nog subcutaan vetkussentjes aangeduid door de pijlen; rechts: inguinale lymfeklier aangegeven door de pijl).

figure-protocol-8
Figuur 4: Plaats van het onderhuidse vet pads. Beeld van onderhuids vet pad; de linker pijlen geven de onderhuidse vet pad en de juiste pijl geeft de lies lymfeklier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Isoleer adipeus afgeleide stamcellen (ADSC) zoals eerder beschreven 20.
  2. Zaad ADSC 4000 cellen / cm2 in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium-Ham's F-12 aangevuld met 10% normaal kalfserum, 1% penicilline / streptomycine, 0,5% amfotericine B, 16 pM biotine, 18 uM pantotheenzuur en 100 uM ascorbinezuur en cultuur groeien tot confluentie ongeveer 70 tot 80%, Die wordt bereikt na 4-6 dagen van de cultuur.
  3. Induceren adipogenic Differentiatie.
    1. Verwijder de hechtende ADSC van het oppervlak door trypsine behandeling.
      1. Verwijderen medium, wassen met PBS en voeg 0,025% trypsine-oplossing (voorverwarmd tot 37 ° C) gedurende 2 minuten (totdat cellen los van het oppervlak). Voeg onmiddellijk medium en was de cellen.
    2. Tel de cellen met behulp van een Neubauer kamer.
      1. Plaats het glazen deksel op de centrale ruimte van de Neubauer kamer. Verdun de celsuspensie 01:10 en laad de kamer met 10 pi verdunde celsuspensie. Tel de cellen in 4 vierkantjes gelegen op de hoeken, elk opgebouwd uit 16 kleine vierkanten. Bereken het aantal cellen per ml:
        figure-protocol-9
    3. Zaad ADSC (zoals beschreven in punt 2.2) in 12-putjes en te groeien cultuur tot confluentie ongeveer 70 tot 80% (bereikt na 4-6 dagen).
    4. induceren adipogenic differentiatie door toevoeging van 5 ug / ml insuline, 1 uM dexamethason en 5 uM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) aan de kweken. Vervang het medium elke 2 dagen. Cellen worden volledig gedifferentieerd na 7 dagen.
  4. Om de adipogene differentiatie, vlek met Oil Red O, die triglyceriden van mature adipocyten vlekken te analyseren.
    Opmerking: De werkzaamheden moeten worden uitgevoerd onder een zuurkast!
    1. Verwijder het medium, was de adipocyten voorzichtig met PBS en bevestig de cellen gedurende 60 minuten met 2 ml 10% formaline.
    2. Oil Red O kleuring te bereiden, meng 3 delen van de rode olie O voorraadoplossing (300 mg Oil Red O poeder opgelost in 100 ml 99% isopropanol) met 2 delen gedestilleerd H2O en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Filter de Oil Red O werkende oplossing door een 0,2 um injectie filter.
      Opmerking: De werkende oplossing is 2 uur.
    3. Voor de Oil Red O vlekken, verwijder de formaline, wassen adipocyten met H2 O incuberen met 2 ml 60% isopropanol gedurende 5 minuten, verwijder het isopropanol en voeg 2 ml Oil Red O werkoplossing gedurende 5 min. Spoel de cellen met kraanwater tot het water helder is. Tegenkleuring met hematoxyline als in punt 1.4.4.5).
    4. Evalueer de platen onder een fase contrast microscoop met 100-voudige vergroting. De lipiden van de adipocyten verschijnt rood en de kernen wordt blauw weergegeven.
  5. Optionele stap: Stilte het gen van belang door transfectie met shRNA.
    1. Verander het medium en voeg serum-vrij medium.
    2. Voor de transfectie van adipocyten, lipofectie gebruikt. Volg de instructies van de fabrikant en het gebruik van 1 ug shRNA per 12-well weefselkweek platen. Na toevoeging van het lipide-DNA-complex, adipocyten incubeer gedurende 48 uur bij 37 ° C.
  6. Om adipocyten onderworpen aan hypoxie te analyseren, gebruik dan een hypoxische werkstation of hypoxische incubator aan de cellen onder hypoxische condities te handhaven. Afhankelijk van de studie, hypoxie cOuld 0,5, 1 of 2% zuurstof.
    1. Analyseer apoptose door FITC-gemerkte Annexine V en daaropvolgende flowcytometrie geanalyseerd.
      1. Verzamel adipocyten met extra zachte celschraper, wassen met PBS en voeg 1 x 10 6 cellen 100 ui Annexine V-bindingsbuffer (10 mM Hepes / NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2). Voeg de hoeveelheid Annexine V-FITC aanbevolen door de fabrikant en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
      2. Voor flowcytometrie meting voeg 200 ul Annexine V-bindingsbuffer en 1 uM van nucleaire tegenkleuring. Bepaal de fluorescentie in het groen en violet kanaal. Annexine V + / nucleaire tegenkleuring + cellen worden gedefinieerd als secundaire necrotische en annexine V + / nucleaire tegenkleuring - cellen worden gedefinieerd als apoptotische cellen (figuur 5).
    2. Kwantitatief te analyseren adipocyten RNA-niveau om de homeostase onder hypoxische condities te bepalen.
      1. Toevoegen1 ml enkelfasige oplossing van guanidine isothiocyanaat en fenol aan elk putje en isoleren RNA [middels éénfasige methode Chomczynski en Sacchi 17 (stap 1.3.2)] en ga verder zoals in stappen 1.3.2.1) tot 1.3.5.2) .

figure-protocol-10
Figuur 5: Adipocyte apoptose analyse door flowcytometrie. Puntdiagram presentaties van de FACS voor annexine V-FITC en TO-PRO-3 kleuring van adipocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

We zien hoe adipocyten homeostase bepalen in vivo en in vitro gebruik van het voorbeeld van Fra-2 fl / fl Fabp4 CreERT-muizen in vergelijking met wildtype nestgenoten. Ons protocol definieert hoe verhoogde HIF expressie door hypoxie gecorreleerd is met adipocyten disfunctioneren, zoals aangegeven door de toegenomen adipocyten apoptose.

Toegenomen adipocyten grootte en het gebied in vetrijk dieet (HFD) behandelde muizen

Overvoeding, naast andere factoren, leidt tot vetcellen hypertrofie, veroorzaakt door overmatige energieopslag in de vetdruppels. De adipocyten grootte en omgeving is een indicator van hypertrofie. Delen van het vetkussentje van normaal (ND Figuur 6a) en vetrijk dieet (HFD Figuur 6b) muizen en kwantificering van de adipocyten grootte en oppervlakte duidelijk vetcellen hypertrofie na 6 wekens van HFD, hetgeen wordt aangegeven door verhoogde adipocyte grootte in de HFD behandelde muizen (figuur 6c en d).

Verhoogde hypoxie in het vetweefsel (AT) van de volwassen Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT muizen leidt tot verhoogde HIF-1α niveau en adipocyten apoptose

Om de in vivo status van hypoxie in AT, bepalen Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT muizen worden geanalyseerd 6 weken na Fra-2 deletie op de leeftijd van 12 weken en vergeleken met wild-type nestgenoten. Pimonidazole wordt toegediend aan de muizen intraperitoneaal als een effectieve hypoxie merker; Het is niet giftig en kan distribueren naar de AT. Hypoxische adipocyten in het AT in vivo worden bepaald door immunohistochemische antilichaam kleuring (Figuur 7a). Bovendien is de verhoogde hypoxische status van de AT in muizen gepaard met een verhoogde HIF-1α positieve ADIPocytes zoals aangegeven door de immunohistochemische kleuring Figuur 7b), hetgeen wordt bevestigd door kwantificering van HIF-1α expressieniveaus en de doelwitgenen 9. Bovendien, TUNEL kleuring van secties van AT Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT muizen en controle nestgenoten (Figuur 7c) laat zien dat verhoogde adipocyten apoptose gecorreleerd met de aanwezigheid van hypoxie en HIF-1α expressie.

Verhoogde HIF-1α expressie in primaire adipocyten door middel van hypoxie geïnduceerde apoptose adipocyten

Om adipocyten apoptose analyseren in vitro, maken we gebruik van adipocyten gegenereerd uit onderhuids vet pads zoals elders 20 beschreven. Zoals verwacht, is de HIF-1α expressie in adipocyten verhoogd na 24 uur van hypoxia (figuur 8a). Om verder te analyseren HIF-1α activiteiten, het RNA niveaus van HIF doelgenen zoals Inos (induceerbaar stikstofoxide synthase) worden gekwantificeerd door qPCR. Figuur 8b toont dat de verhoogde expressie van HIF-1α onder hypoxische omstandigheden leidt iNOS mRNA-niveau verhoogd. Aangezien we eerder in vivo (figuur 8) dat HIF-1α expressie in adipocyten verhoogd correleert met verhoogde adipocyten apoptosis gebleken, is apoptose ook gekwantificeerd in vitro kweken door Annexine V kleuring onder hypoxische omstandigheden. Consistent met in vivo-gegevens (figuur 7), wordt een verhoogde HIF-1α niveau vergezeld van verhoogde adipocyten apoptose geïnduceerd door hypoxische omstandigheden (figuur 8b). Bovendien bewijzen dat zuurstofgebrek geïnduceerde apoptose HIF-; HIF-1α of HIF-2α wordt het zwijgen opgelegd door RNA interferentie in adipocyten afgeleid van wild-type of Fra-2 deficiënte muizen. De verhoogde adipocyten apoptose wordt hersteld door silencing HIF-1α en HIF-2α zoals door Annexine V kleuring in figuur 8b, waaruit blijkt dat de hypoxie sensor HIF-α regelt de adipocyten apoptose.

figure-results-1
Figuur 6: Verhoogde adipocyten grootte en gebied vetrijk dieet (HFD) muizen (a, b) H & E-kleuring van secties van de perigonadal vetkussentje mannelijke wild-type muizen gevoed met normale voeding (ND) (a) of hoog. -vet dieet (HFD) (b) gedurende 6 weken. Bars vertegenwoordigen 500 urn. (C, d) De kwantificering van adipocyte grootte (c) en het gebied (d) vanaf het perigonadal vetkussentje van wildtype muizen gevoed met ND (a) of HFD (b) gedurende 6 weken. n = 10. Gegevens zijn getoond als gemiddelde waarden ± SEM. Statistische analyse werd uitgevoerd met individuele student t-test. *** P <0,0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 7: Verhoogde HIF-1α niveau en apoptose in adipocyten van de volwassen Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT muizen. Hypoxie (a) en HIF-1α (b) kleuring in de AT mannelijke Fra-2 fl / fl Fabp4-creERT muizen en mannelijke controle nestgenoten 6 weken na injectie tamoxifen. Vergroting 20X, plaatst 40X. Zwarte pijlen geven hypoxische gebieden en HIF-1α positieve cellen. (C) TUNEL kleuring in Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT muizen en controle nestgenoten AT 6 weken na tamoxifen injectie. Vergroting 20X, plaatst 40X. Zwarte pijlen geven TUNEL positieve cellen. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Luther etal. 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 8:. Verhoogde HIF-1α expressie en adipocyten apoptose in primaire adipocyten geïnduceerd door hypoxie (a) real-time PCR-analyse van HIF-1α en HIFs doel Inos mRNA in primaire adipocyten geplaatst hypoxische kamers geanalyseerd op de aangegeven tijdstippen. (B) Kwantificering van apoptose door annexine V FACS kleuring in primaire adipocyten geïsoleerd van Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT muizen of wild-type controles getransfecteerd met sh controle of sh plasmide tegen HIF-1α of HIF-2α en onder hypoxie geplaatst (1% O2) gedurende 24 uur. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Luther et al. 9. De gegevens worden getoond als gemiddelden ± SD Statistische analyse werd uitgevoerd onder toepassing van t-test van Student. * P <0,05 en ** p <0,01 werden als significant aanvaard. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Adipocyten worden fenotypisch gekenmerkt door hun grootte, aantallen en het gebied, het onthullen van vetcellen hyperplasie en hypertrofie, geïnduceerd door overmatige opslag van energie als gevolg van over-voeding 5. Deze gebeurtenissen leiden tot vetzuur dysregulatie en daaropvolgende metabool syndroom ook bepaald verhoogde vetmassa met gekonfijte metabolisme, die ook wordt aangeduid als "gezond" fat expansie. Bijvoorbeeld Kusminski et al. 21 aangetoond dat muizen met massieve dikke expansie blijven metabolisch gezonde, wat suggereert dat vet expansie niet beperkt hoeft te metabool syndroom en moet zorgvuldig bepaald om de eigenschappen van de adipocyten evalueren zijn. Het vetweefsel (AT) speelt een centrale rol in de regulering van de stofwisseling. AT is de grootste endocrien orgaan dat van invloed dyslipidemie, atherosclerose, hyperinsulinemie en hyperglycemie 3. Evalueren AT homeostase en moleculaire mechanisms reguleren het zou een beter begrip van de metabole aandoeningen mogelijk te maken. Daarom is het ontrafelen van de mechanismen tot regeling van adipocytdifferentiatie, adipocyten grootte en vet pad massa zou helpen om nieuwe therapeutische behandeling voor obesitas stoornissen te ontwikkelen. Gebruik in vivo en in vitro methoden, is het mogelijk om de rol van voeding en genexpressie effecten op differentiatie van adipocyten en activiteit te bepalen. Om de AT homeostase bepalen de afweging tussen adipocyte differentiatie, proliferatie en apoptose zoals door ons protocol is even belangrijk als het analyseren van glucose en insuline metabole respons 22-24.

Expressieprofiel analyse van genen betrokken bij adipogenese, lipogenese, lipolyse, vetzuur opname, hypoxie, apoptose en proliferatie in primaire adipocyten en viscerale AT is een hoge doorvoer werkwijze voor het verkrijgen van een overzicht van adipocyt homeostase en de mogelijke dysfunctie.Interessante kandidaten kunnen verder worden geanalyseerd op eiwitniveau door Western blot of immunohistologische kleuring. Optimale resultaten door real-time PCR systeem aanvragen met symmetrische cyaninekleurstoffen moeten de concentraties van cDNA variërend van 1 tot 10 ng en de optimale primer concentraties van 50 tot 900 nm worden getest om specifieke amplificatie te minimaliseren. De kritische componenten zijn de primers; Voor elke serie hebben de smeltcurven strikt worden gecontroleerd om de specificiteit te waarborgen en om de vorming van primer dimeren te sluiten. Daarom worden bij een negatieve controle met H2O plaats van cDNA wordt aanbevolen. Verder worden in de handel verkrijgbare niet-symmetrische cyaninekleurstoffen verschaft als mastermengsels dat een passieve referentie kleurstof bevatten (zoals ROX) een interne referentie signaal. De cDNA signaal wordt genormaliseerd tijdens de data-analyse van de ROX signalen naar well-to-well signaal schommelingen te corrigeren. Een ander punt dat moet worden overwogen om een ​​goo vestigend qPCR systeem is de keuze van het huishoud-gen. Voor elke voorwaarde, worden meerdere housekeeping genen gebruikt, bijvoorbeeld HPRT, β-actine, GAPDH, β-2-MG of HSP90.

HIF eiwitten gestabiliseerd door hypoxische condities meester regulatoren bepalen niet alleen adipocyten overleving, maar ook metabole veranderingen, zoals glucose, insuline tolerantie en vetmetabolisme 11,25,26. Om hypoxische gebieden vast te stellen in het vet pad, wordt HIF-1α bepaald AT secties door immunohistochemie. Omdat HIF eiwitten snel binnen 5 tot 10 minuten onder normoxische omstandigheden worden afgebroken, moet de procedure en de vastlegging van het vet pad voor de histologische analyse strak worden gecontroleerd om wachttijd te voorkomen. Daarom, om hypoxie zorgen niet alleen door HIF kleuring wordt pimonidazole gebruikt om hypoxische gebieden in de AT bepalen. Pimonidazole kan gedistribueerd naar weefsels, zoals reeds in de botten 27 kreegEn effectief markeer hypoxische gebieden door binding aan thiol bevattende eiwitten specifiek in hypoxische cellen, die verder in histologische secties wordt gedetecteerd door specifieke antilichaambinding 28. Maar ook andere markers en methoden worden toegepast om de hypoxie pad analyseren. Bijvoorbeeld, de betrokkenheid van de prolyl hydroxylase (PHD) enzym dat hydroxylatie van proline residuen onder normoxie induceren, alsook het Von Hippel-Lindau (VHL) eiwit, dat gehydroxyleerd prolinen herkennen en induceren de poly-ubiquitinering om proteasomale HIF bemiddelen degradatie, moeten worden geanalyseerd voor een volledig overzicht van de route 29,30. Bovendien zou overal detectie van HIFs ook de eiwitstabiliteit en afbraak welke veranderen 31,32 bepalen.

Bovendien proliferatie door Ki67 en apoptose door de TUNEL kleuring worden bepaald in vivo door middel van kleuring van AT histologische secties. Kwantificering van proliferatie door Ki67 enpoptosis door TUNEL of annexine V-kleuring door middel van flowcytometrie-analyse wordt ook uitgevoerd 33. Proliferatie kan uiteraard worden gemeten met andere technieken, zoals analyses van de celcyclus adipocyten, die niet bij de meting van Ki67-positieve cellen is gericht. Bovendien kan apoptose studie van TUNEL worden ingevuld door FACS analyses van annexine V en TOP-PR-3, die het niveau van necrose versus de apoptosis celdood proces zal bepalen. Apoptose is een fundamenteel proces voor het programma van celdood, die belangrijk is voor AT homeostase. Inderdaad, ontregeling van apoptosis adipocyten is eerder betrokken bij processen die bijdragen tot zwaarlijvigheid en lipodystrofie 34. Bovendien, in 2011, Keuper et al. Verbonden vetweefsel ontsteking adipocyten apoptose. Zij toonden aan dat macrofagen geïnduceerde apoptose in preadipocyten en adipocyten, waardoor macrofagen trekken. De werving van macrofagen versnelt ontsteking, die contributes om metabool syndroom, zoals glucose en insuline tolerantie 35. Echter, adipocyten apoptose is nog steeds een slecht bestudeerde fenomeen, ondanks de hypothese dat geïnduceerde apoptose adipocyten zou kunnen leiden tot een verminderde gewicht.

Het huidige protocol maakt gebruik van immunohistochemische benaderingen voor verschillende fenomeen te bestuderen, zoals proliferatie, apoptose en hypoxie in vivo. Daarom werd het weefsel gefixeerd met 4% formaldehyde, wat een kritische stap. Een uitgebreide weefsel fixatie tijd leidt tot verandering van de epitopen, die niet toegankelijk zijn voor het antilichaam worden. Daarentegen korte fixatietijd verhoogt de gevoeligheid van epitopen reagentia. De aanbevolen optimale tijd van fixatie is 24 uur. Bovendien is de dikte van de secties beïnvloedt ook de antilichamen binden aan hun epitopen; optimale dikte tussen 2 en 5 urn. Secties dikker dan 5 micrometer zal vals-positieve resultaten als gevolg van verhoogde binding sites. Daarentegen isitingen dunner dan 2 micrometer bevatten minder binding sites en positieve gebieden zijn niet goed gedefinieerd. Zijn kritische factoren zijn het antilichaam zelf, incubatietijd, concentratie en gelijkmatige temperatuur, waarbij de kwaliteit van de specifieke binding aan de epitopen te beïnvloeden. Daarom valideren antilichaam concentratie en incubatietijd nodig voor elke conditie.

Om het onderzoek te voltooien, geven we een in vitro adipocytdifferentiatie protocol, die kan worden verlengd met verschillende behandelingen, stimulatie of co-culturen. Gebruikmakend van in vitro kweken van adipocyten, is het mogelijk om defecten in adipocytdifferentiatie en functies bepalen. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen, als voor alle primaire cellen, het gezond gedrag en het uiterlijk van de ADSCs en adipocyten is heel belangrijk. De granulariteit, cytoplasmatische vacuolations en / of loslaten zijn tekenen van achteruitgang, wijst op een onvoldoende medium, microbiële besmetting of veroudering van de primairecellen. Dit protocol wordt gebruikt geïsoleerde adipocyten van het vetkussentje weefsel, terwijl het ook mogelijk om mesenchymale stamcellen geïsoleerd uit beenmerg zoals beschreven door 36 andere protocollen gebruiken. De laatste omvat stromale voorlopercellen cellen, die extra differentiatie problemen die zich voordoen bij de zeer vroege stap van adipocytdifferentiatie afbreuk zouden kunnen doen, kan dit worden gemist in onze huidige protocol. Bovendien kan snel ADSCs (meer dan 10 keer binnen één week) uitgebreid en langdurig gekweekte ADSCs na passages steeds hun pluripotentie mesenchymale 37,38 behouden. Een ander voordeel van het gebruik ADSCs is dat men gemakkelijk kan overschakelen naar menselijke, aangezien ADSCs van patiënten door liposuctie die een eenvoudige en minimaal invasieve wijze kunnen worden geoogst.

Zoals AT beïnvloedt verschillende andere organen in een endocriene wijze, moet het protocol worden uitgebreid tot adipokines. Adipokines, zoals leptine, adiponectine, tumornecrosefactor-α (TNF) and resistine, afgescheiden door adipocyten is bekend dat metabole ziekten beïnvloeden door het regelen van de vetstofwisseling, energie homeostase en insulinegevoeligheid 39. Daarom moet serum en adipocyten secretoom analyses worden uitgevoerd. Bij AT dysfunctie, adipokines en pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-6, kan leiden tot ontregeling van organen zoals de lever en de pancreas, en spierfunctie 4. Om systemische orgaanfalen uitgesloten, terwijl diermodellen of celculturen worden getest op hun reactie op stimulatie en glucose opname.

Hier hebben we een protocol voor de analyse de basistoestand van AT en adipocyten in vivo en in vitro moleculaire mechanismen van adipocyten homeostase en functionaliteit onthullen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag vriendelijk bedanken Dr. J. Luther en K. Ubieta voor het bereiden van de gegevens en Dr. B. Grötsch voor proeflezen het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RNAlater solutionAmbionAM7021RNA stabilisatieoplossing
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitApplied Biosystems4368813
SYBR Select Master Mix4472908
Gezuiverd muis Anti-Mens Ki-67BD Biosciences550609Clone B56 (RUO)
Gezuiverd muis Anti-Mens Ki-67 Clone B56 (RUO)550609Proliferatiemarker
FITC Annexin VBioLegend640906
Gekloven Caspase-3 Konijn mAbCell signalling9664SClone 5A1E
Gekloven Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Konijn mAb9664Apoptosemarker
Lipofectamine2000 Reagent Invitrogen11668-027
TO-PRO-3 JodideT3605Nucleaire tegendye, Monomere cyanine nucleïnezuurkleurstof, Excitatie⁄Emissie: 642⁄661 nm
Mayer’s hemalumMerck109249hemotoxylin
pegGOLD TriFastPeqlab30-2030TRIzol, eenfasige oplossing van guanidine isothiocyanate en fenol
Percellys Keramisch Kit 1,4 mm91-PCS-CK14buisjes met keramische kralen (1,4 mm)
Precellys 2491-PCS24homogenisator
HIF-1 alfa AntilichaamPiercePA1-16601
HIF-1 alfa Antilichaam, 16H4L13700505Hypoxiemarker
In Situ Celdood Detectie Kit, FluoresceinRoche11 684 795 001TdT-gemedieerde dUTP-biotine nick end labeling (TUNEL) 
EosineSigma318906
DNase I Oplossing (1 eenheid/µl)Thermo ScientificEN0525
gebiotinyleerd anti muis IgG (H+L)Vector LaboratoriesBA-9200
gebiotinyleerd anti muis IgG (H+L)BA-1000
Vectastain ABC KitPK-4000
VECTASHIELD Montage Medium met DAPIH-1200

Referenties

  1. Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).
  2. Gong, Z., Muzumdar, R. H. Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging. Int J Endocrinol. , 320482(2012).
  3. Deng, Y., Scherer, P. E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).
  4. Rezaee, F., Dashty, M. Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases. J Diabetes Metab. , 008(2013).
  5. Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. The cell biology of fat expansion. J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).
  6. Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1(2015).
  7. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metab. 4, 263-273 (2006).
  8. Luther, J., et al. Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy. J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).
  9. Luther, J., et al. Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia. Cell Death Differ. , (2014).
  10. Semenza, G. L. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).
  11. Kim, W., Kaelin, W. G. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer. Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).
  12. Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. Oxygen sensors at the crossroad of metabolism. Cell Metab. 9, 11-22 (2009).
  13. Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction. Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).
  14. Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).
  15. Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin. Diabetes. 55, 978-987 (2006).
  16. Haluzik, M., et al. Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).
  17. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
  18. Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).
  19. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  20. Planat-Benard, V., et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 109, 656-663 (2004).
  21. Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).
  22. Trajcevski, K. E., et al. Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model. PLoS One. 8, 71747(2013).
  23. Montgomery, M. K., et al. Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding. Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).
  24. de Queiroz, K. B., et al. Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet. Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).
  25. Ye, J. Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance. Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).
  26. Xiong, Y., et al. The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue. Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).
  27. Bozec, A., et al. Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia. Nature. 454, 221-225 (2008).
  28. Varia, M. A., et al. Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma. Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).
  29. Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability. Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).
  30. Tennant, D. A., et al. Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death. Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).
  31. Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool. Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).
  32. Amelio, I., et al. TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).
  33. Suga, H., et al. Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells. Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).
  34. Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. J Diabetes Res. 2015, 970375(2015).
  35. Keuper, M., et al. An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).
  36. Sera, Y., et al. Hematopoietic stem cell origin of adipocytes. Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).
  37. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).
  38. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).
  39. Scherer, P. E. Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ. Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Adipocytdifferentiatieadipocytapoptoseblootstelling aan hypoxiehistologische analysegenexpressieprofileringpimonidazole-kleuringHIF-1 alfaRNA-interferentievetweefselmetabool syndroom
Mechanisme van de verordening van Adipocyte Numbers in volwassen organismen door differentiatie en apoptose Homeostasis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.