Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Summary

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Abstract

Dendritische cellen (DCs) zijn professionele antigeen presenterende cellen hoofdzakelijk verantwoordelijk voor het verkrijgen, verwerken en presenteren van antigenen op antigeenpresenterende moleculen aan T-cellen gemedieerde immuniteit te initiëren. Dendritische cellen kunnen worden gescheiden in verschillende fenotypisch en functioneel heterogene subgroepen. Drie belangrijke subsets van milt dendritische cellen zijn plasmacytoide, CD8a ^Pos en CD8a ^Neg cellen. De plasmacytoïde DCs natuurlijke producenten van type I interferon en zijn belangrijk voor antivirale T cel immuniteit. De CD8a ^Neg DC deelverzameling is gespecialiseerd voor MHC klasse II antigeen presentatie en is centraal betrokken in priming CD4 T-cellen. De CD8a ^Pos DCs zijn primair verantwoordelijk voor cross-presentatie van exogene antigenen en CD8 T-cel priming. De CD8a ^Pos DC aangetoond efficiënt bij de presentatie glycolipide antigenen door CD1d moleculen om een specifieke T cell bevolking bekend als onveranderlijk natural killer T (iNKT) cellen. Toediening van Flt-3-ligand verhoogt de frequentie van migratie van dendritische cellen uit beenmerg progenitoren uiteindelijk resulteert in het vergroten van dendritische cellen in perifere lymfoïde organen in muizenmodellen. We hebben dit model aangepast aan grote aantallen functionele dendritische cellen te zuiveren voor gebruik in celoverdracht experimenten ter vergelijking in vivo vaardigheid van verschillende DC subsets.

Introduction

Dendritische cellen (DC) werden ontdekt bijna veertig jaar geleden als "grote stervormige (Griekse dendron) cel" in lymfoïde organen ^1. Vele studies hebben aangetoond dat DCs de enige antigeen presenterende cellen die effectief naïeve T-cellen ² kunnen stimuleren. Een belangrijke functie van deze cellen is de opname en presentatie van antigenen en de efficiënte verwerking en het laden van deze op antigeen presenterende moleculen. In muis milt, kan DC worden gescheiden in plasmacytoide en conventionele subsets. De plasmacytoide DCs worden gekenmerkt door lage expressie van CD 11 c en een hoog niveau van de B220 en Gr-1. Ze zijn ook posit....

Protocol

Dierproeven worden gedaan in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen van de institutionele dierlijke zorg en gebruik commissie (IACUC). Alle procedures die de steriliteit worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast.

1. Implantatie van B16.Flt3L Melanoma in Muizen

1. Cultuur de Flt-3 expressie brengende B16 melanoma cellijn T25 weefselkweek flessen in een dichtheid van 0,5 x 10 ⁶ cellen / ml in compleet DMEM medium met _10% CO2 bij 37 ° C. Opgroeien tot de cellen te bereiken ~ 90% confluentie (~ 20 uur).
2. Oogst de cellen door trypsine digestie. Zuig celcultuur media en was de hechtende cellen m....

Results

Het resultaat van deze procedure is gebaseerd op de groei van DC subsets van murine Flt-3L door de geïmplanteerde melanoomcellen expressie. De B16.Flt3L tumor werd afgeleid van een C57BL / 6 muis en worden geïmplanteerd in dieren die stamachtergrond om falen van de tumor te vestigen door afstoting te voorkomen. In sommige gevallen kan het gewenst zijn genetisch gemodificeerde muizen om DCs met bekende defecten leiden in signaalwegen of receptoren van belang. Het is belangrijk om in gedac.......

Discussion

Dendritische cellen worden toegelaten tot de grootste professionele antigenpresenterende cellen betrokken bij het priming van T-cel responsen zijn. Hun belangrijkste functie is om het weefsel micro onderzoek van opnemen en verwerken van antigenen voor presentatie aan T-cellen. Om de functie van specifieke DC subsets bestuderen, moeten deze in voldoende aantallen te isoleren Daarbij moet misschien hun normale fenotype en functie handhaaft. De meeste protocollen vertrouwen op de isolatie van specifieke subgroep van DC naï.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (dry powder)	QIAGEN	79254
200 proof ethanol	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030081
MEM non-essential amino acids	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM essential amino acids	Life Technologies	11130-051
β-mercaptoethanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution	Life Technologies	15575-020
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11050
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Trypan blue (dry powder)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotech	130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit	Miltenyi Biotech	130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-mouse CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anti-mouse CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Anti-mouse B220-PE	BD Biosciences	553090
1 ml syringes	BD	26048
23 G1 needle	BD	305145
100 mm Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	875712
Surgical instruments	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm)	BD	352350
Large Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm))	Corning	431097
LS columns	Miltenyi	130-042-401
Magnetic stand MACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips	PerkinElmer	111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates	Corning	CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice	Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line			described by Mach et al., 2000
Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)			Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media			Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer			Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).
FACS staining buffer			Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml.			This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use.