Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Summary

Er bestaan verschillende zeldzame populaties van dendritische celsubpopulaties in lymfoïde organen en daarom zijn ze lastig te isoleren in voldoende aantallen en zuiverheid voor immunologische experimenten. Hier beschrijven we een methode met hoge efficiëntie en hoog rendement voor het isoleren van alle momenteel bekende belangrijke subpopulaties van dendritische cellen in de milt van muizen.

Abstract

Dendritische cellen (DCs) zijn professionele antigeen presenterende cellen hoofdzakelijk verantwoordelijk voor het verkrijgen, verwerken en presenteren van antigenen op antigeenpresenterende moleculen aan T-cellen gemedieerde immuniteit te initiëren. Dendritische cellen kunnen worden gescheiden in verschillende fenotypisch en functioneel heterogene subgroepen. Drie belangrijke subsets van milt dendritische cellen zijn plasmacytoide, CD8a ^Pos en CD8a ^Neg cellen. De plasmacytoïde DCs natuurlijke producenten van type I interferon en zijn belangrijk voor antivirale T cel immuniteit. De CD8a ^Neg DC deelverzameling is gespecialiseerd voor MHC klasse II antigeen presentatie en is centraal betrokken in priming CD4 T-cellen. De CD8a ^Pos DCs zijn primair verantwoordelijk voor cross-presentatie van exogene antigenen en CD8 T-cel priming. De CD8a ^Pos DC aangetoond efficiënt bij de presentatie glycolipide antigenen door CD1d moleculen om een specifieke T cell bevolking bekend als onveranderlijk natural killer T (iNKT) cellen. Toediening van Flt-3-ligand verhoogt de frequentie van migratie van dendritische cellen uit beenmerg progenitoren uiteindelijk resulteert in het vergroten van dendritische cellen in perifere lymfoïde organen in muizenmodellen. We hebben dit model aangepast aan grote aantallen functionele dendritische cellen te zuiveren voor gebruik in celoverdracht experimenten ter vergelijking in vivo vaardigheid van verschillende DC subsets.

Introduction

Dendritische cellen (DC) werden ontdekt bijna veertig jaar geleden als "grote stervormige (Griekse dendron) cel" in lymfoïde organen ^1. Vele studies hebben aangetoond dat DCs de enige antigeen presenterende cellen die effectief naïeve T-cellen ² kunnen stimuleren. Een belangrijke functie van deze cellen is de opname en presentatie van antigenen en de efficiënte verwerking en het laden van deze op antigeen presenterende moleculen. In muis milt, kan DC worden gescheiden in plasmacytoide en conventionele subsets. De plasmacytoide DCs worden gekenmerkt door lage expressie van CD 11 c en een hoog niveau van de B220 en Gr-1. Ze zijn ook positief voor de oppervlakte marker mPDCA1 en scheiden type I interferon in reactie op toll-like receptor 9 (TLR9) liganden. De conventionele DC's zijn hoog voor CD11c en MHC klasse II expressie. Zij kunnen worden verdeeld in drie subgroepen op basis van de oppervlakte-expressie van fenotypische merkers zoals CD4, CD8a, DEC205, CD11b en dendritische celtherapie remmende receptor 2 (DCIR2, erkend door de 33D1-antilichaam) eiwitten ^3,4. De CD8a ^Pos DCs worden ook wel CDC1, zijn positief voor DEC205, maar negatief voor myeloïde merkers zoals CD11b en 33D1. De CD8a ^Neg DC's, ook wel cdc2, zijn positief voor 33D1, CD11b en CD4, maar gebrek aan DEC205. De dubbele negatieve subgroep (dwz negatief voor zowel CD4 en CD8a) is relatief zeldzaam, en is negatief voor DEC205 en 33D1. Het de minst gekarakteriseerde subgroep en kunnen minder gedifferentieerde vorm van CD8a ^Neg gelijkstroom.

Fenotypische verschillen in de verschillende DC subsets worden uitgebreid tot de in vivo functies. De CD8a ^Neg DCs sterk fagocytische en men denkt dat exogeen antigen zetten vooral via MHC klasse II aan CD4 T-cellen ^3. In tegenstelling, de CD8a ^Pos DCs zijn gespecialiseerd voor het aanbrengen van oplosbaar eiwit antigeen op MHC klasse Ieen mechanisme genaamd cross-presentatie. Het resultaat van cross-presentatie is afhankelijk van de activeringsstatus van deze DCs ^5, en kan zowel leiden tot uitbreiding van cytotoxische T-cellen (CTL's) of de ontwikkeling van regulerende T-cellen ^{6 2,7.} Targeting van antigeen aan CD8a ^Pos DCs met behulp van anti-DEC205-antilichaam-gemedieerde levering resultaten grotendeels in de verwijdering van T-cellen ^8, terwijl de presentatie van de antigenen afkomstig van geïnfecteerde apoptotische cellen een sterke CTL-respons ⁹ induceert.

Naast herkenning van peptide-antigenen is het immuunsysteem van zoogdieren ontwikkeld om lipide en glycolipide antigenen herkennen. Deze antigenen worden door CD1 moleculen, die MHC klasse I-achtige celoppervlakte-eiwitten die bestaan ​​in verschillende verwante vormen in diverse zoogdieren. In muizen, één soort sterk geconserveerde CD1 molecuul genaamd CD1d is verantwoordelijk voor de presentatie glycolipide antigenen ^10. De burgemeester populatie van T-cellen die CD1d / glycolipide complexen herkennen heet invariante NKT cellen (iNKT cellen). Deze cellen brengen een semi-invariante T-celreceptor (TCR), bestaande uit een invariant TCRα keten die is gekoppeld aan TcR ketens met een beperkte diversiteit ^11. In tegenstelling tot conventionele T-cellen die moeten groeien en te differentiëren tot geactiveerde effector-T-cellen, iNKT cellen bestaan ​​als een effector bevolking en begint snel te reageren na glycolipide toediening ^12. Identificatie van fysiologisch relevante lipide antigeenpresenterende cellen is een actief gebied van onderzoek en een aantal verschillende celtypes zoals B-cellen, macrofagen en DC's zijn voorgesteld voor deze functie. Er werd aangetoond dat de CD8a ^Pos subset van DC is de primaire cel medieert opname en presentatie van lipide antigenen muizen- iNKT cellen ¹³ en glycolipide gemedieerde cross-priming van CD8 T-cellen ^14.

ove_content "> Om de efficiëntie van antigeenpresentatie vergelijken met andere antigeenpresenterende cellen, een eenvoudige aanpak is om verschillende gezuiverde APCs gepulst met equivalente hoeveelheden van antigeen in naïeve gastheer. celoverdracht experimenten van dit type worden vaak uitgevoerd voor immunologische studies te dragen. echter, het uitvoeren van overdracht studies ex vivo antigeen behandelde DCs uitdaging, aangezien deze cellen bestaan ​​zeldzame populaties in lymfoïde organen, waar ze minder dan 2% van de totale cellen ¹⁵ vormen. daarom moet de ontwikkeling van deze cellen in donordieren verbeteren de efficiëntie van isolatie protocollen te verhogen.

Het is bekend dat de gemeenschappelijke lymfoïde en myeloïde voorlopercellen gemeenschappelijke, die nodig zijn voor het genereren van pDC, CD8 en CD8 ^{Pos Neg} DC subsets, express fms-gerelateerde tyrosine kinase receptor 3 (Flt-3). Bij het ​​in vivo Flt-3-ligand (Flt-3L) administratie, emigration van Flt-3 tot expressie stamcellen uit beenmerg wordt verhoogd, leidt tot een toegenomen zaaien van perifere lymfoïde organen en de uitbreiding van de rijpe DC ¹⁶ nageslacht. Expressie van Flt-3 is verloren tijdens betrokkenheid bij de B, T of NK-celdifferentiatie paden. Daarom worden slechts minimale veranderingen waargenomen in deze cellen op Flt-3L administratie. Vertaald expansie DC populaties waargenomen in muizen die tumoren opgewekt door implantatie van B16-melanoom cellijn afscheidende muis Flt-3L, welke een eenvoudige en economische methode voor het verschaffen van langdurige systemische niveaus van Flt-3L ^17,18 bepaalt. Met deze benadering hebben we een protocol gebaseerd op de implantatie van B16-melanoom cellen die Flt-3L de uitbreiding van alle normale DC subsets in muismilt stimuleren, waardoor aanzienlijke verhoging van de opbrengst van deze cellen kunnen worden geïsoleerd voor verdere experimenten ontwikkeld . We consequent vinden dat binnen 10 - 14 dagen na subcutane implantage van de Flt-3 afscheidende tumor, muizen ontwikkelen splenomegalie met duidelijke verrijking van DC tot 40 vormen - 60% van de totale miltcellen. Uit deze milt kunnen verschillende DC subsets worden geïsoleerd met hoge zuiverheid met behulp van standaard in de handel verkrijgbare cel zuivering kits die subgroep-specifieke fenotypische markers in dienst.

Protocol

Dierproeven worden gedaan in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen van de institutionele dierlijke zorg en gebruik commissie (IACUC). Alle procedures die de steriliteit worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast.

1. Implantatie van B16.Flt3L Melanoma in Muizen

1. Cultuur de Flt-3 expressie brengende B16 melanoma cellijn T25 weefselkweek flessen in een dichtheid van 0,5 x 10 ⁶ cellen / ml in compleet DMEM medium met _10% CO2 bij 37 ° C. Opgroeien tot de cellen te bereiken ~ 90% confluentie (~ 20 uur).
2. Oogst de cellen door trypsine digestie. Zuig celcultuur media en was de hechtende cellen met PBS. Voeg 5 ml 0,05% trypsine en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Voeg 20 ml koud volledige DMEM medium (4 ° C) bevattende foetaal kalfsserum (FCS) voor de protease digestie blussen. Til de cellen uit door lichtjes op te tikken, gevolgd door voorzichtig en neer te pipetteren.
3. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 300xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Tel de cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde cellevensvatbaarheid teller. Resuspendeer tot een dichtheid van 10 ⁸ cellen / ml in PBS.
4. Implant muizen (C57BL / 6 of een andere histocompatibel stam) met tumorcellen subcutaan zoals beschreven door Machholz et al. ¹⁹ aan de basis van de hals met 100 ul celsuspensie (10 ⁷ cellen).
5. Laat de tumor te groeien tot voelbare of zichtbare (2-10 mm in diameter, gewoonlijk 7-12 dagen) voor dieren opgeofferd oogstbare organen.

2. Voorbereiding van de milt enkele celsuspensie van Tumor-dragende muizen

1. Verdoven muizen met een overdosis van isofluraan (pas stroomsnelheid van isofluraan> 5% en verder exposure minstens 2 minuten na ademhaling stopt). Offer de Flt-3 melanoom tumor dragende muizen door cervicale dislocatie volgens de institutionele richtlijnen voor euthanasie.
2. disinfect de huid met 70% ethanol en de oogst milt met behulp van aseptische techniek met behulp van een steriele schaar ^20.
3. Plaats de milt in een steriele petrischaal voor transport naar de bioveiligheid kast. Voer alle stappen vanaf nu onder steriele omstandigheden.
4. Transfer milt om een ​​nieuwe petrischaal en wassen met RPMI medium. Snijd de milt in kleine (~ 0,2 cm ²⁾ delen met een scalpel. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C met 10 ml collagenase / DNase oplossing.
5. Giet het gedeeltelijk gedigereerde suspensie van miltweefsel op een 70 um cel zeef. Comprimeer het resterende weefsel fragmenten door de mazen van de zeef met een 5 ml spuit zuiger.
6. Was het filter met 10 ml vers medium en gooi het filter. Centrifugeer de suspensie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om de cellen te pelleteren.
7. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 2 ml RBC lysis buffer. Incubeer bij kamertemperatuur fof 10 min. Quench RBC lysisbuffer door toevoeging van 10 ml van volledig RPMI medium.
8. Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer in geschikte volume celdichtheid van 10 ⁸ cellen / ml bereiken celsortering buffer (bijv MACS) bevattende 20 ug / ml Fc-block antilichaam (2.4G2).

3. Zuivering van plasmacytoïde DCs, CD8a ^Pos DCs en CD8a ^Neg DC's van de milt enkele celsuspensie

Opmerking: Isolatie van milt DC subsets van eencellige suspensie is een meerstaps werkwijze als geïllustreerd in figuur 1 Voer alle stappen met voorgekoelde buffer en een ijswaterbad op temperatuur houden 4 - 8 ° C.. Alle reagensvolumes in het volgende deel van het protocol worden berekend voor een eerste ingang van 200 pl milt celsuspensie bij 10 ⁸ cellen / ml). Dit kan worden opgeschaald ofneer basis van uw probleem door het veranderen van het volume van celsuspensie (altijd in een dichtheid van 1 x 10 ⁸ cellen / ml) en andere reagentia proportioneel in de eerste stap (3.1.1 en 3.2.1). Pas reagens volumes in alle latere stappen dienovereenkomstig. Als bijvoorbeeld beginnend met 100 pl milt celsuspensie bij 1 x 10 ⁸ / ml, gebruikt helft vermelde reagensvolumes bij alle stappen.

1. Isolatie van plasmacytoide DCs (PDC)
   1. Voeg 300 ul met biotine gemerkt antilichaam cocktail die in de plasmacytoide DC isolatie kit 200 gl celsuspensie milt.
   2. Meng goed en incubeer in ijs waterbad gedurende 15 min. Tik op de buis om de 3 minuten om de cellen in suspensie te houden, en om antilichamen te maximaliseren bindend.
   3. Voeg 12 ml celsortering buffer en pellet de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Zuig supernatant om niet-gebonden gebiotinyleerde antilichamen te verwijderen.
   4. Resuspendeer de celpellet in 500 pl buffer celsortering. Voeg 300 gl anti-biotine antilichaam-geconjugeerde kralen. Herhaal stap 3.1.2 en 3.1.3.
   5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 2 ml buffer celsortering. Voer alle stappen van dit punt bij KT met behulp van pre-gekoelde buffers.
   6. Plaats een nieuw magnetisch geactiveerde celsortering LS kolom in de magnetische stand. Was en equilibreren kolom met 5 ml buffer celsortering.
   7. Pipetteer de celsuspensie op de kolom, de toepassing voorzichtig naar het midden van het oppervlak van het kolombed. Verzamel de doorstroming.
   8. Was de kolom met 10 ml buffer celsortering. Verzamelen deze stroom door combineren met doorstroming uit stap 3.1.7. De pDCs zijn verrijkt in deze kolom doorstroom (FT1).
   9. Pellet de cellen van FT1 door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, resuspendeer in 2 ml celsortering buffer en laat de cellen door een nieuw LS columndoor herhalen van de stappen 3.1.6 - 3.1.8. Dit gebruik van twee opeenvolgende kolommen levert verbeterde zuiverheid van geïsoleerde cellen.
   10. Pellet cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en resuspendeer met 2 ml compleet RPMI. Plaats op ijs totdat het nodig is.
2. Isolatie van CD8a ^Pos en CD8a ^Neg DCs
   Opmerking: De eerste stap in deze procedure depletie van B pDC, T- en NK-cellen.
   1. Beginnend met het volledige milt celsuspensie (1 ml 10 ⁸ cellen / ml verkregen in stap 2,8), voeg 100 ul met biotine geconjugeerd antilichaam cocktail die in de CD8a ^Pos DC isolatiekit.
   2. Meng goed en incubeer in ijs waterbad gedurende 15 min. Tik de buis voorzichtig elke 3 min binding van biotine-gelabelde antilichamen maximaliseren hun doelcellen.
   3. Voeg 12 ml celsortering buffer en pellet van de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. aspireren supernatant om niet-gebonden gebiotinyleerde antilichamen te verwijderen.
   4. Voeg 150 ul van celsortering buffer en 100 pl anti-biotine korrels die in de CD8a ^Pos DC isolatiekit. Meng goed en incubeer in ijs waterbad gedurende 15 min.
   5. Voeg 10 ml celsortering buffer en pellet van de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
   6. Resuspendeer cellen in 1 ml celsortering buffer en gaat over een nieuwe LS kolom volgens de procedure in de stappen 3.1.6 tot 3.1.8.
   7. Verzamel de ongelabelde stroom door 2 (FT2) en gooi de kolom retentaat. Dit ongelabelde fractie wordt verrijkt CD8a ^Pos en CD8a ^Neg DCs.
   8. Pellet de cellen in FT2 door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
   9. Resuspendeer de cellen in 1 ml celsortering buffer en voeg 200 pl anti-CD8a geconjugeerde magnetische korrels die in de CD8a ^Pos DC isolatiekit.
   10. Repeet stappen 3.2.2 tot 3.2.6. De doorstroom van de kolom wordt verrijkt CD8a ^Neg DCs en verarmd voor CD8a ^Pos DCs. Dit wordt aangeduid stroming door 3 (FT3).
   11. Elueerde het CD8a ^Pos DCs vastgehouden in de kolom, verwijder de kolom uit de magneet, voeg 5 ml celsortering buffer en zuiveren de kolommatrix met de plunjer voorzien van de LS kolom.
   12. Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zuig supernatant en resuspendeer in 1 ml celsortering buffer. Om de zuiverheid te verhogen, voert de geëlueerde cellen opnieuw door een nieuwe LS column van herhalen van de stappen 3.1.6 tot 3.1.8, met uitzondering gooi de stroom door en verzamel vastgehouden cellen als in 3.2.11.
   13. De CD8a ^Neg DCs zuivert van de FT3 suspensie pellet de FT3 door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en resuspendeer in 300 ul buffer celsortering.
   14. Voeg 100 ul van anti-CD 11 c magmagnetische kralen. Meng goed en incubeer in ijs waterbad gedurende 15 min.
   15. Voeg 10 ml celsortering buffer en pellet cellen door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C.
   16. Herhaal de stappen 3.1.5 tot 3.1.8. De CD8a ^Neg DCs positief geselecteerd met CD11c kralen en zijn gebonden aan de kolom. De doorstroming kan worden weggegooid.
   17. Elueer de cellen in de kolom vastgehouden zoals beschreven in stap 3.2.11 de gezuiverde CD8a ^Neg DCs verzamelen.

4. Pulsing APC's met antigenen en Cell Transfer

1. Tel de levende cellen na zuivering met behulp van trypan blauw uitsluiting ²¹ tot levende en dode cellen te onderscheiden.
2. Incubeer de cellen met het antigeen gekozen. Gebruik analogen glycolipide antigeen alfa-galactosyl ceramide (αGalCer) en 100 nM concentratie ^13. Typisch, plaat 10 ⁶ levensvatbare cellen / putje in compleet RPMI-medium met behulp van ultra-low Attachment U-bodem 96 wells platen op celhechting minimaliseren. Incubeer de cellen in een 5% _CO2 atmosfeer bij 37 ° C gedurende 1-4 uur.
3. Oogst cellen door enkele malen zachtjes pipetteren. Gebruik wijde boring pipet tips om celbeschadiging van dwarskrachten een minimum te beperken. Was de putjes met PBS en bundelen deze wasbeurten naar cel oogst te maximaliseren.
4. Pellet de cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de gewenste dichtheid in PBS. Gewoonlijk Injecteer 1 miljoen cellen in 200 gl per ontvanger dier. Houd de cellen op ijs om de levensvatbaarheid voor de toediening te maximaliseren in gastheer dieren.
5. Injecteren cellen intraveneus in muizen hetzij via de laterale staart ijdel en de retro-orbitale veneuze plexus ^19. Gebruik een 27 G naald op een 1 ml injectiespuit, en injecteer een maximaal volume van 0,1 ml per muis.

Results

Het resultaat van deze procedure is gebaseerd op de groei van DC subsets van murine Flt-3L door de geïmplanteerde melanoomcellen expressie. De B16.Flt3L tumor werd afgeleid van een C57BL / 6 muis en worden geïmplanteerd in dieren die stamachtergrond om falen van de tumor te vestigen door afstoting te voorkomen. In sommige gevallen kan het gewenst zijn genetisch gemodificeerde muizen om DCs met bekende defecten leiden in signaalwegen of receptoren van belang. Het is belangrijk om in gedac...

Discussion

Dendritische cellen worden toegelaten tot de grootste professionele antigenpresenterende cellen betrokken bij het priming van T-cel responsen zijn. Hun belangrijkste functie is om het weefsel micro onderzoek van opnemen en verwerken van antigenen voor presentatie aan T-cellen. Om de functie van specifieke DC subsets bestuderen, moeten deze in voldoende aantallen te isoleren Daarbij moet misschien hun normale fenotype en functie handhaaft. De meeste protocollen vertrouwen op de isolatie van specifieke subgroep van DC naï...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05% Trypsin-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (droge poeder)	QIAGEN	79254
200 proof ethanol	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Wordt gebruikt om 70% ethanol te bereiden
RBC lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 medium met L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM medium met L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030081
MEM niet-essentiële aminozuren	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM essentiële aminozuren	Life Technologies	11130-051
β-mercaptoethanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Natriumpyruvaat	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Fosfaatbuffer oplossing (PBS Ca2+ en Mg2+ vrij pH 7,2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS met Ca2+ en Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0,5 M Ethyleendiaminetetraacetaat (EDTA) oplossing	Life Technologies	15575-020
Bovien serum albumine (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Foetaal kalfs serum	Atlanta Biologicals	S11050
Penicilline/streptomycine	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Trypanblauw (droge poeder)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Bereid 0,08% met PBS
Plasmacytoid Dendritische Cel Isolatiekit II, muis	Miltenyi Biotech	130-092-786
Magnetische kralen geconjugeerd met anti-muis CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8αPos muis DC isolatiekit	Miltenyi Biotech	130-091-169
Fc-gamma receptor blokkerende antilichaam (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-muis CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anti-muis CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Anti-muis B220-PE	BD Biosciences	553090
1 ml spuiten	BD	26048
23 G1 naald	BD	305145
100 mm Petri schotels	Thermo Fisher Scientific	875712
Chirurgische instrumenten	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Celstrainer (70 µm)	BD	352350
Grote Petri schotels	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Vacuum filtratie systeem (500 ml (0,22 µm))	Corning	431097
LS kolommen	Miltenyi	130-042-401
Magneetstand MACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Brede 200 μl pipetpunten	PerkinElmer	111623
Corning ultra-lage binding 96-well platen	Corning	CLS3474-24EA
6-8 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen	Jackson Research Laboratories, Jax
Muis B16.Flt3L melanoomcel lijn			beschreef door Mach et al., 2000
Serum vrij DMEM en RPMI media 500 ml DMEM met L-glutamine, of 500 ml RPMI-1640 met L-glutamine 5 ml MEM niet-essentiële aminozuren (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0,5 ml 2-mercaptoethanol (5,5 x 10-2 M)			Meng alle ingrediënten in een bioveiligheidskast met ofwel DMEM of RPMI media, afhankelijk van uw behoefte. Filter steriliseer de media door het door een 0,22 µm vacuümfiltratie systeem te laten lopen.
Complete RPMI en DMEM media			Voeg 50 ml verhit inactieve foetaal kalfs serum toe aan serumvrij RPMI of DMEM media om compleet media te verkrijgen.
MACS buffer			Voeg 2 ml van 0,5 M EDTA en 10 ml van verhit inactieve foetaal kalfs serum toe aan 500 ml van fosfaat-gebufferde oplossing (PBS, Ca2+ en Mg2+ Vrij, pH 7,2) en 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antilichaam).
FACS kleuring buffer			Los natrium azide op tot 0,05% (0,25 g per 500 ml) in MACS buffer om FACS kleuring buffer te verkrijgen
10x Collagenase D en DNase 1 stock oplossing Los 1 g