De alkalische komeet-assay meet DNA-strengbreuken in eukaryotische cellen. Door een digestiestap met Endonuclease III of humane 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase toe te voegen, kan de assay efficiënt oxidatieve DNA-schade detecteren. We beschrijven methoden voor het gebruik van deze assays om DNA-schade in rattenlever te detecteren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vivo Alkaline Comet Assay en Enzyme-gemodificeerde Alkaline Comet Assay voor het meten van DNA-breuken en oxidatieve DNA-schade in Rat Liver
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ongerepareerde DNA-schade kan leiden tot genetische instabiliteit, wat op zijn beurt de ontwikkeling van kanker kan bevorderen. Daarom is het belangrijk om mogelijke DNA-beschadigende stoffen te identificeren om de volksgezondheid te beschermen. De in vivo alkalische comet-assay, die DNA-schade detecteert als strengbreuken, is vooral relevant voor het beoordelen van de genotoxische gevaren van xenobiotica, omdat de reacties ervan de in vivo absorptie, weefselverdeling, metabolisme en uitscheiding (ADME) van chemicaliën weerspiegelen, evenals het DNA-reparatieproces. In vergelijking met andere in vivo DNA-schade-assays is de assay snel, gevoelig, visueel en goedkoop, en door oxidatieve DNA-schade om te zetten in strengbreuken met behulp van specifieke reparatie-enzymen, kan de assay oxidatieve DNA-schade op een efficiënte en relatief artefactvrije manier meten. Meting van DNA-schade met de comet-assay kan worden uitgevoerd met behulp van zowel acute als subchronische toxicologische studie-ontwerpen, en door de comet-assay te integreren met andere toxicologische beoordelingen, voldoet de assay aan de dierenwelzijnsvereisten door maximaal gebruik te maken van dierlijke hulpbronnen. Een ander groot voordeel van de assays is dat ze slechts een kleine hoeveelheid cellen vereisen, en de cellen hoeven niet te zijn afgeleid van proliferende celpopulaties. De assays kunnen ook worden uitgevoerd met een verscheidenheid aan menselijke monsters verkregen van klinisch of beroepsmatig blootgestelde individuen.
Inleiding
De alkalische komeettest meet DNA-breuken in de single-cell niveau. Suspensies van afzonderlijke cellen zijn ingebed in agarose op een microscoopglaasje en de cellen gelyseerd om nucleoiden, die sterk gedraaide lussen van DNA bevatten te vormen. Elektroforese bij pH> 13 resulteert in het verlies van supercoiling van DNA lussen met breuken, met de vrijgekomen DNA strengen migreren naar de anode, waardoor comet-achtige structuren die kunnen worden waargenomen door middel van fluorescentie microscopie. Gefragmenteerde DNA migreert van de "kop" van de komeet in de "staart" gebaseerd op de grootte van het fragment, en de relatieve fluorescentie van de komeetstaart opzicht....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethiek statement: procedures waarbij dieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) op de US FDA / Nationale Centrum voor toxicologisch onderzoek.
LET OP: De onderzoeksopzet die hier beschreven is gebaseerd op het protocol ontwikkeld door de Japanse Centrum voor de validatie van alternatieve methoden (JaCVAM) voor de validering van de in vivo knaagdier alkaline comet assay 18 en verder gewijzigd op basis van aanbevelingen in de OESO-richtsnoer TG489 19 .
1. Voorbereiding
- Slide voorbereiding
- Ontbinden regelmatige smeltende a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De in vivo alkaline comet assay werd uitgevoerd samen met de enzymgemodificeerd komeettest zowel directe en oxidatieve schade DNA in de lever van ratten behandeld met cyproteronacetaat (CPA) 5 meten. CPA is een synthetische hormonaal geneesmiddel dat rattenlever tumoren induceert in een sex-specifieke wijze, met vijfvoudig hogere doses nodig levertumoren bij mannelijke ratten dan bij vrouwen 24 induceren. We vonden dat directe DNA-schade door CPA in de leve.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft het gelijktijdig meten van zowel directe als oxidatieve DNA-schade in rat lever bij de single cell niveau. Het algemene protocol is toepasbaar op elk weefsel waarvan enkele cellen of kernen kunnen worden geïsoleerd met minimale procesgeïnduceerde DNA schade (bijv DNA schade geïnduceerd niet door het testmiddel, maar door de behandeling en verwerking van het dierlijk weefsel). In ons onderzoek hebben we alkaline comet tests uitgevoerd op de cellen uit het beenmerg 7,9, maag
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen van de auteurs heeft concurrentievermogen of tegenstrijdige belangen. De informatie in deze materialen is geen formele verspreiding van informatie door FDA en vertegenwoordigt niet het standpunt of beleid van het bureau.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse Food and Drug Administration. We erkennen de oorspronkelijke publicatie van de CPA-studie door Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Geslachtsspecifieke dosis-responsanalyse van genotoxiciteit bij cyproteronacetaat-behandelde F344-ratten. Mutation Research 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Chloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1,000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1,000 |
Referenties
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiati....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
