Isolatie en Canulatie van Cerebral Parenchymale Arteriolen

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een eenvoudig en reproduceerbaar protocol voor het isoleren van intracerebrale arteriolen (een groep bloedvaten die omvat parenchymale arteriolen, penetrerende arteriolen en precapillaire arteriolen) van muizen, te gebruiken in drukmyografafie, immunofluorescentie, biochemie en moleculaire studies.

Samenvatting

Intracerebrale parenchymale arteriolen (PA's), die parenchymale arteriolen, indringende arteriolen en pre-capillaire arteriolen omvatten, zijn hoge weerstand bloedvaten vertakking van pial slagaders en arteriolen en duiken in de hersenen parenchym. Individuele PA perfuseren een discrete cilindrische grondgebied van het parenchym en de neuronen in ons systeem. Deze arteriolen zijn een centrale speler in de regulatie van de cerebrale doorbloeding zowel wereldwijd (cerebrovasculaire autoregulatie) en lokaal (functionele hyperemie). PA's maken deel uit van de neurovasculaire eenheid, een structuur die overeenkomt doorbloeding metabole activiteit in de hersenen en ook neuronen, interneuronen en astrocyten. Perfusie met PA is direct gekoppeld aan de activiteit van neuronen in dat gebied en een toename van neuronale metabolisme leiden tot een verhoging in lokale perfusie veroorzaakt door dilatatie van de voeding PA. Regulatie van PA verschilt van die beter gekarakteriseerdepiale slagaders. -Druk-geïnduceerde vaatvernauwing is groter in de Pas en vaatverwijdende mechanismen variëren. Daarnaast hebben PA niet extrinsieke innervatie ontvangen van perivasculaire zenuwen - innervatie is intrinsieke en indirect in de natuur door contact met astrocytische uiteinde. Dus, gegevens met betrekking tot contractiele regulering opgebouwd door studies met pial slagaders niet direct te vertalen naar het begrijpen van PA-functie. Verder blijft onbepaald hoe pathologische toestanden, zoals hypertensie en diabetes, beïnvloeden PA structuur en reactiviteit. Deze leemte is deels het gevolg van de technische problemen in verband met PA isolatie en canule. In dit manuscript presenteren we een protocol voor isolatie en infusen van knaagdieren PA's. Verder tonen we voorbeelden van experimenten die zijn uitgevoerd met deze arteriolen, waaronder agonist veroorzaakte vernauwing en myogene reactiviteit. Hoewel de focus van dit manuscript is op de PA infusen en de druk myography, geïsoleerde PAB kan ook worden gebruikt voor biochemische, biofysische, moleculaire en beeldvormende studies.

Inleiding

De cerebrale circulatie is uniek georganiseerd om de metabolische behoeften van centrale neuronen, cellen die energieopslag beperkte en daardoor zeer gevoelig voor veranderingen in de zuurstofspanning en aanvoer van noodzakelijke voedingsstoffen ondersteunen. De bijzondere neuronale subpopulaties actief wordt wanneer specifieke taken worden uitgevoerd, het vaatstelsel bevordert een sterk gelokaliseerde toename van perfusie plaatselijke hypoxie en uitputting van voedingsstoffen ¹ voorkomen. Dit is een vorm van functionele hyperemie bekend als neurovasculaire koppeling, en is afhankelijk van de goede werking van de neurovasculaire eenheid, bestaande uit actieve neuronen, astrocyten en cerebrale arteriën ^2. Intracerebrale parenchymale arteriolen, een groep van bloedvaten omvat parenchymale doordringende en precapillaire arteriolen, zijn centraal belang voor deze reactie en het is dan cruciaal bij de losse bestuderen om neurovasculaire koppeling ³ onderzoeken.

Parenchymale arteriolen zijn klein (20-70 urn inwendige diameter) hoge weerstand bloedvaten die verschillende neuronale populaties in de hersenen perfuseren. Vertakking van pial slagaders op het oppervlak, parenchymale arteriolen doordringen in de hersenen parenchym in een bijna 90 ^ᵒ hoek met de ondergrond microcirculatie (figuur 1) te voeden. Deze arteriolen spelen een cruciale rol bij het handhaven van de juiste perfusiedruk zoals ze zijn de meest distale gladde spier opslagvaten de bescherming van de haarvaten. In tegenstelling tot het oppervlak pial circulatie parenchymale arteriolen gebrek zijtakken en anastomosen, en zijn daarom "knelpunten" van de cerebrale circulatie ^4. Hierdoor disfunctie van parenchymale arteriolen bijdraagt ​​tot de ontwikkeling van cerebrovasculaire ziekten zoals vasculaire cognitieve stoornissen en kleine ischemische beroerte (ook bekend als stille of lacunaire beroerte). studies indicate dat parenchymale arteriolen disfunctie kan worden geïnduceerd door ⁵ essentiële hypertensie, chronische stress ^6, en is een vroege gebeurtenis in SVD genetisch muismodel ^7. Verder experimenteel geïnduceerde occlusie van één penetrerend arteriolen bij ratten voldoende kleine ischemische beroerte die cilindrisch van vorm, vergelijkbaar die waargenomen bij oudere mensen ⁸ veroorzaken.

Naast deze anatomische verschillen, mechanismen reguleren contractiele functie verschillen pial arteriën en arteriolen parenchym. Myogene vasoconstrictie groter in parenchymale arteriolen ^9, mogelijk vanwege het gebrek aan extrinsieke innervatie ^10, verschillende modi van mechanotransductie ^11, en ​​verschillen in intracellulaire Ca2 ⁺ signalering ^12,13 in vasculaire gladde spiercellen. Er zijn aanwijzingen dat endotheel-afhankelijke vasodilator mechanismen ook verschillen tussen deze VascuLAR segmenten, met parenchymale slagaders vertonen grotere afhankelijkheid van mechanismen die Ca ²⁺ geactiveerde K ⁺ kanalen en elektrotone communicatie binnen de vaatwand in vergelijking met diffundeerbare factoren zoals stikstofoxide en prostacyclinen ^14. Daarom verzamelde gegevens in experimenten met pial slagaders kan niet noodzakelijk van toepassing op arteriolen parenchymale, waardoor er een gat in onze kennis van de lokale controle van de hersendoorbloeding.

Ondanks het belang ervan, parenchymale arteriolen zijn enorm onder bestudeerde, voornamelijk als gevolg van de technische uitdagingen met isolatie en bevestiging voor ex vivo studie. In dit manuscript beschrijven we een methode voor het isoleren en canule cerebrale parenchym arteriolen, die kan worden gebruikt voor druk- myography of om weefsel te isoleren voor immunokleuring, elektrofysiologie, moleculaire biologie en biochemische analyse.

Protocol

1. canule en de Kamer Voorbereiding

1. Plaats schoon borosilicaatglas capillairen (buitendiameter: 1,2 mm, binnendiameter: 0,69 mm, 10 mm lang) in de groeven van een pipet trekker met een platina draad (diameter: 100 pm).
2. Met behulp van de juiste instellingen, trek de capillaire om een canule met een lange en dunne tip (figuur 2) met behulp van een micropipet trekker te genereren. De gebruikte instellingen zijn: Heat - 700, Pull - 100, Velocity - 50, - 10.
3. Steek canule in de houder van de druk myograaf kamer. Lijn de canules gepast.
4. breken voorzichtig de uiteinden van de canules door een tang onder de dissectiemicroscoop om de gewenste diameter. Hier laten we een canule met een 10 urn tip (figuur 2).
5. Vul beide canules met kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) met 1,8 mM Ca2 ^+; Vul de kamer met Ca ^{2 +} -vrij aCSF aangevuld met 1% bovine serumalbumine (BSA) + 10 uM Diltiazem (alle oplossingen moet vers worden bereid voor het begin van het experiment). Afhankelijk van de grootte van de kamer, varieert het volume van aCSF 5 tot 20 ml. Bewaar de kamer bij 4 ^ᵒ C tot klaar om te beginnen met infusen.
   LET OP: Diltiazem is een reversibele L-type voltage-gated calcium remmer die verwijding van de kleine slagaders zal veroorzaken, die infusen vergemakkelijkt

2. Isolatie van Parenchymale Arteriolen

1. Euthanaseren het dier onmiddellijk voorafgaand aan dissectie met behulp van standaard protocollen in het laboratorium dat door het dier zorg commissie van de instelling worden goedgekeurd. Het gebruik van barbituraten of kooldioxide de voorkeur, aangezien andere veelgebruikte anesthetica vaatverwijdende effecten in de cerebrale circulatie ¹⁵ kan hebben. Alle dierlijke procedures hier getoonde zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Nevada School of Medicine, en zijn in agreement met de National Institutes of Health 'Guiding Principles in de zorg en het gebruik van dieren ".
2. Euthanaseren het dier met behulp van kooldioxide. Voordat onthoofding, ervoor te zorgen dat het dier de ademhaling is gestopt en reageert niet wanneer knijpen zijn poten.
3. Onthoofden het dier met behulp van een scherpe schaar (muis) of guillotine (rat). Verwijder het vel van hoofd van het dier en snijd over de middellijn craniale hechtdraad met een fijne tip schaar. Met behulp van een stompe pincet (muis) of een bot tang verwijder voorzichtig de schedelbeenderen en bloot de hersenen. Verwijder de hersenen langzaam en voorzichtig over het oppervlak pial bloedvaten beschadigen. Plaats de hersenen in een container gevuld met 20 ml Ca2 ⁺ -vrij aCSF aangevuld met 1% BSA op ijs.
4. Vul een dissectie schotel met een pad met ijskoude Ca2 + -vrij aCSF aangevuld met 1% BSA en breng de hersenen met de ventrale zijde naar boven op deze schaal (figuur 2A). Plaats de schotel onder een dissecting microscoop (Figuur 3A). Speld de hersenen om de pad met behulp van 27-gauge naalden. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het plaatsen van pinnen in de buurt van de middelste cerebrale slagader (MCA).
5. Lokaliseren van de cirkel van Willis en de MCA vertakking van. Met behulp van scherpe en uitgelijnd Vannas lente schaar, knipte een kleine rechthoek rond het MCA. Controleer of rechthoek dicht bij 5 mm over de hele lengte van het MCA. Het bovenste deel van de rechthoek moet voorbij het ​​vertakkingspunt van de cirkel van Willis (proximaal van de Cirkel van Willis, Figuur 2B, pijl).
6. Met de Vannas veer schaar Voer een ondersneden in de diepte van het weefsel ongeveer 2-3 mm.
   NB: Dit deel is van cruciaal belang voor een goede isolatie van parenchymale arteriolen, en het kan een paar proeven te nemen om het goed te krijgen. Als de cut is briefje diep genoeg is, zal het geïsoleerde parenchymale arteriolen kort zijn; Als de cut te diep is, zal de arteriolen breken op hun aftakpunt wanneer de ontleedweefsel verwijderd.
7. Vastpinnen het meest distale einde van de hersenen slice in het ontleden schotel met de MCA naar boven (distale van de Cirkel van Willis) met behulp van insect pinnen. Maak een ondiepe incisie aan de pia snijden in de buurt van de pin, en let niet te diep in de onderliggende cerebrale cortex (anders de pennen zal niet vasthouden) te snijden.
8. pak zorgvuldig elke zijde van de pia met kleine pincet en beginnen afpellen van de pia cortex. Indien nodig, vast te houden aan de MCA, ervoor te zorgen dat de omringende pial membraan niet wordt beschadigd.
9. Blijf pellen tot de pia met de MCA vrij is van de cortex. Merk op dat het verzet tegen peeling dicht bij de Circle de Willis zal toenemen. Wees extra voorzichtig op dit punt, omdat de langere parenchymale arteriolen zal in deze regio.
10. Zodra de pia vrij, plaats deze voorzichtig op het pad op de ontleden schaal met de oppervlak tegenover arteriolen naar beneden (figuur 2B) parenchymale.
11. Het gebruik van Vannas voorjaar een schaar, knip de ontleed arteriolen vrij van de MCA, zorg ervoor dat de uiteinden van het schip worden botweg gesneden.
12. Verzameld arteriolen kan voor druk myography, moleculaire analyse of isolering van natief gladde spiercellen of endotheelcellen.

3. Druk myography

1. Bereid de hechting van tevoren. Snijd de donkergroene nylon draad in 5 mm stukken en leg op de kleverige kant van een dubbelzijdige tape op een petrischaal. Onder de dissectiemicroscoop scheiden elk stuk in de filamenten met behulp van fijne pincet en losjes bereiden een eenvoudige halve hitch knoop door het passeren van een uiteinde van het filament in de andere.
2. Met behulp van een tang, kies een knoop van de dubbelzijdige tape, zorg ervoor dat niet om het te grijpen met te veel druk. Trek de hechtdraad in bad oplossing, glijbaan knoop op canule en draai hem op een afstand vanaf de punt van de canule. Herhaal dit proces tot 2 hechtingen voor elke canule hebben.
3. Coat een glasmicropipet met een 10% BSA-oplossing en spoel het overtollige met Ca ^{2 +} -vrij aCSF aangevuld met 1% BSA.
4. Trek 50 pi van de oplossing in het glas micropipet, trek een parenchymale arteriole en over te dragen aan de druk myography kamer. Duw de zuiger in één vloeiende beweging aan de parenchymale arteriole afzien in de kamer om te voorkomen dat het vasthouden aan de inwendige kamer van het glas micropipet.
5. Met behulp van twee super fijne tang, opent het lumen van de PA, voorzichtig om alleen het einde van het schip te raken.
6. Met de tang om de randen van de parenchymale arteriole houden, trek het vaartuig op de canule. Trek ver genoeg op de canule, zodat het schip niet aan het tapse uiteinde van de canule (figuur 3A).
7. Draai de 2 hechtingen op de canule en draai ze op het vat (Figuur 3B). Space de hechtingen uit elkaar een beetje aan het schip, en trek in de richting van de bestuurder, terwijl tightien is. Zorg ervoor dat alle takken worden afgebonden voor het sluiten van de andere kant van de parenchymale arteriole.
8. Draai kamer rond en sluit het andere uiteinde van de parenchymale arteriole als blinde weg. Om dat te bereiken, opent u de banden aan de andere canule en doorgeven naar de arteriole. Sluit langzaam de knoop zodanig dat de parenchymale arteriole worden gekoppeld aan de zijde van de canule. Vermijd longitudinale stuk van de arteriole. (Figuur 3C).
   Opmerking: Als het doel van de studie is om drugs perfuseren door het lumen canule het andere uiteinde in plaats van binden van de parenchymale arteriole aan de zijde van de canule. Zorg ervoor dat de canule geen zoutkristallen of interne build-ups die intraluminale stroom te blokkeren. Regulering van de stroomsnelheid op de juiste wijze om shear stress binnen fysiologische peil te houden. Een studie van Shih et al. Toont debieten binnen indringende arteriolen bij ratten ^8, en kan als een eerste gids voor pi dienenveel studies.
9. Breng voorzichtig de kamer naar het stadium van de microscoop worden gehanteerd om vaatdiameter. Bevestig de kamer op de microscoop podium, het aansluiten van temperatuursensor en de inlaat en de afzetmogelijkheden voor perfusie naar de juiste buizen. Breng het arteriole tot 40 mmHg intraluminale druk muis parenchymale arteriolen of 50 mmHg rat arteriolen, met behulp van een druksysteem in het laboratorium (waterkolom, peristaltische pomp gekoppeld aan een drukomzetter, enz.). Figuur 4D toont een voorbeeld van een peristaltische pomp gekoppeld aan een drukomzetter de canule arteriole druk.
10. Schakel de gebruikt om wijzigingen in diameter (figuur 3E) detecteren systeem. Instellingen op de microscoop, zoals de verlichting en contrast, teneinde de best mogelijke detectie te verkrijgen. Idealiter de wanden van de arteriole dient donker en het lumen doorschijnend. Zodra de detectie geschikt is, beginnen met het opnemen thij te experimenteren.
11. Start het superfusie systeem. Was de canule, stromend parenchymale arteriole met warm (37 ^ᵒ C) aCSF met 1,8 mM Ca2 ⁺ gedurende 15 tot 20 minuten bij een debiet tussen 3-5 ml / min. Dit aCSF dient Diltiazem of BSA bevatten.
12. Vervang regelmatig aCSF met 60 mM KCl aCSF de levensvatbaarheid van het preparaat te evalueren. 20% vernauwing tot 60 mM KCl - Op dit moment moet PA 10 vertonen. Als de arteriole niet vernauwen in die mate, te verwijderen en canule andere arteriole.
13. Spoel de 60 mM KCl met regelmatig aCSF. Wacht tot de generatie van de spontane myogene toon, die kan duren tot een uur. Als arteriole myogene toon niet over die tijd, vervangen door een ander arteriole.
    OPMERKING: Myogene toon wordt waargenomen als een geleidelijk en soms traag, vermindering van het lumen diameter van het vat zonder stimulering door contractiele agonisten of hoge KCl oplossing. Myogene toon wordt berekend met de volgende formula: (1 - (actief lumen diameter / passief lumen diameter)) x 100 ⁵ Een geschikte hoeveelheid myogene tonus kan variëren afhankelijk behandelingen, stammen, species, transgenics, enz.. In het algemeen fysiologische myogene toonbereiken 15-30% ^5.

4. Voorbeeld Pressure myography Experimenten: Agonist-geïnduceerde Vernauwing en Myogene reactiviteit

1. Bereid een reeks verdunningen van een agonist van keuze in aCSF middels geschikte concentraties. Voor het onderhavige voorbeeld werd de tromboxaan _A2-receptor agonist U46619 gebruikt. Een voorraadoplossing van 1 ml U46619 bij een concentratie van 1 mM werd bereid. Breng 100 pi van 1 mM oplossing naar een nieuwe buis met 900 ui van aCSF een 10-voudige verdunning van het geneesmiddel, wat resulteert in een oplossing die 100 pM U46619. Herhaal deze procedure voor 6 verdunningen variërend van 1 mM tot 100 nM tot een concentratie-respons curve constrictor bereiden.
2. Voeg detotale volume van de oplossing die de agonist (1 ml voor de eerste dosis, gevolgd door 900 pl alle volgende doses) om 100 ml superfusing aCSF. Dit leidt tot een extra 100-voudige verdunning van de agonist. Het uiteindelijke concentraties van agonist in het bad traject van 10 pM tot 10 pM. Sta arteriolen incuberen ~ 10 min in elke concentratie tot luminale diameter van een steady-state bereikt.
3. Spoel de agonist door superfusing PA's met aCSF zonder drugs totdat de PA diameter is terug naar de oorspronkelijke waarde. Incubeer de parenchymale arteriole Ca ^{2 +} -vrij aCSF (zonder BSA), aangevuld met 10 pM Diltiazem + 2 mM EGTA maximale verwijding induceren en opnemen passieve diameter van de arteriole.
4. Verwijder de parenchymale arteriole van de canule door het voorzichtig naar buiten te trekken terwijl u in het uiteinde van de banden. Was het schip kamer met dubbele gedemineraliseerd water om vuil en overmaat van agonist te verwijderen. Vul de kamer met Ca2 + -vrij aCSF + BSA en canule andere arteriole. Het is niet aan te raden om meer dan één experiment per arteriole voeren.
5. Een myogene reactiviteit experiment uitgevoerd, zodat de parenchymale arteriole equilibreren bij 40 mmHg intraluminale druk tot spontane myogene toon gegenereerd (hierboven beschreven). Verlaag de intraluminale druk tot 5 mmHg PA en laat equilibreren ~ 5-10 min, totdat luminale diameter stationaire toestand bereikt. Verhoog de intraluminale druk stapsgewijze via het interval van keuze (bijvoorbeeld 5-140 mmHg in stappen 20 mmHg).
6. Mis arteriole intraluminale druk van minder dan 5 mmHg niet bloot die kunnen instorten en beschadiging van het endotheel, waardoor de resultaten van het experiment veranderen.
7. Aan het einde van de drukcurve, superfuse de parenchymale arteriole met Ca2 ⁺ -vrij aCSF (zonder BSA), aangevuld met 10 pM Diltiazem + 2 mM EGTA en herhaal de druktrappen, vanaf de lowest druk.
   Opmerking:% tone = (1 - (diameter actief / passief diameter)) x 100: Dit zal de passieve diameters van de PA, die noodzakelijk% myogene tonus te berekenen, gedefinieerd door de formule.

Resultaten

Figuur 5A toont een representatief vernauwing van muis PA 60 mM KCl aCSF om de integriteit van het preparaat te evalueren. PA moet vernauwen tussen 15-30% in aanwezigheid van 60 mM KCl. Als de vernauwing is dan 15%, gooi de PA canule en andere, zoals wordt gesuggereerd dat de arteriole werd beschadigd tijdens het isoleren en canule proces.

Figuur 5B illustreert PA vernauwing aan toenemende con...

Discussie

Cerebral parenchymale arteriolen zijn hoge weerstand arteriolen met weinig anastomoses en takken die verschillende neuronale populaties perfuseren. Deze gespecialiseerde bloedvaten centrale spelers in cerebrovasculaire autoregulatie en neurovasculaire koppeling through-astrocyten gemedieerde vaatverwijding ^1. Het belang van deze gespecialiseerde bloedvaten in cerebrale vasculaire ziekte is gekend voor ongeveer 50 jaar, toen het pionierswerk van Dr. Miller Fisher beschreven structurele veranderingen in parench...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Kunstmatige hersenvocht
NaCl	Fisher Scientific	S-640
KCl	Fisher Scientific	P217
MgCl Anhydrous	Sigma-Aldrich	M-8266
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G2870
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Isolering/Cannuleplaatsing
Stereo Microscope	Olympus	SZX7
Super Fine Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Wiretrol 50 μl	VWR Scientific	5-000-1050
0.2 μm Sterile Syringe Filter	VWR Scientific	28145-477
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm	Sutter Instruments	B120-69-10
Dark Green Nylon Thread	Living Systems Instrumentation	THR-G
Linear Alignment Single Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1-LIN
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump	Living Systems Instrumentation	PS-200
Video Dimension Analyzer	Living Systems Instrumentation	VDA-10
Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software	Living Systems Instrumentation	DAQ-IWORX-404
Heating Unit	Warner Instruments	64-0102
Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-324B