Integratie van Nat en droog Bench Processen Optimaliseert Gerichte next-generation sequencing van lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumorbiopten

Summary

Er wordt een geïntegreerd systeem beschreven voor gerichte next-generation sequencing van oncologische monsters. Dit cross-platform systeem is geoptimaliseerd voor tumorbiopsies van lage kwaliteit en lage hoeveelheid, past zich aan lage DNA-inputs aan, omvat goed gekarakteriseerde multi-variant controles en beschikt over een nieuwe variant caller die wordt geïnformeerd door kwantitatieve pre-analytische kwaliteitscontrolemaatregelen.

Abstract

Alle next-generation sequencing (NGS) procedures omvatten testen uitgevoerd in het laboratorium bench ( "wet bench") en data-analyses met behulp van bioinformatica pijpleidingen ( "dry bench"). Beide elementen essentieel om nauwkeurige en betrouwbare resultaten, die van essentieel belang voor klinische laboratoria produceren. Gerichte NGS technologieën hebben in toenemende mate genade gevonden in de oncologie-toepassingen vooraf precisie geneeskunde doelstellingen te helpen, maar de werkwijzen omvatten vaak losgekoppeld en variabele natte en droge bank workflows en ongecoördineerde reagens sets. In dit rapport beschrijven we een werkwijze voor sequentiebepaling tegen kanker monsters met een 21-gen paneel als voorbeeld van een algehele gerichte NGS systeem. Het systeem integreert functionele DNA kwantificatie en kwalificatie, single-tube multiplex PCR verrijking, en de bibliotheek zuivering en normalisatie met behulp van analytisch-geverifieerd, single-source reagentia met een standalone bioinformatica suite.Daardoor nauwkeurige variant oproepen van lage kwaliteit en lage hoeveelheid formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) en fijne naald aspiratie (FNA) tumor biopsieën worden bereikt. De methode kan routinematig beoordelen kanker-geassocieerde varianten van een invoer van 400 amplificeerbaar DNA-kopieën, en is modulair opgebouwd om nieuwe gen inhoud tegemoet te komen. Twee verschillende types van analytisch ingestelde controles zorgt voor kwaliteitsborging en hulp bescherming call nauwkeurigheid klinisch relevante monsters. Een flexibele "tag" PCR stap bedt platform-specifieke adapters en index-codes om te proeven barcoding en verenigbaarheid met gemeenschappelijke benchtop NGS instrumenten mogelijk te maken. Belangrijk is dat het protocol is gestroomlijnd en kan 24 sequentie-ready bibliotheken te produceren in een enkele dag. Ten slotte is de aanpak koppelt natte en droge bank processen door de integratie van pre-analytisch monster kwaliteitscontrole resultaten direct in de variant bellen algoritmen om mutatie detectie nauwkeurigheid te verbeteren en te differentiëren vals-negatieve en indeterminate gesprekken. Deze doelgerichte NGS methode maakt gebruik van de vooruitgang in zowel wetware en software om high-diepte, multiplex sequencing en gevoelige analyse van heterogene kanker monsters voor diagnostische toepassingen te realiseren.

Introduction

Precisie medicijnen gebaseerd op de individualisering van diagnostische en therapeutische opties voor patiënten. De belofte van behandelingen op maat is een direct gevolg van een beter begrip van de ziekte trajecten die de koppeling van moleculaire diagnostiek en gerichte therapieën kunnen informeren. Bijvoorbeeld, het gebruik van moleculair-gerichte therapieën gestegen van 11% tot 46% 2003-2013 ^1, en ​​anti-kanker geneesmiddelen zoals vemurafenib en crizotinib zijn FDA goedgekeurde met automatisch diagnostische tests. Met de mogelijkheid om nauwkeurig terug lage abundantie sequentie doelen uit sterk gemultiplexeerde sample sets, is de volgende generatie sequencing (NGS) naar voren gekomen als een voorkeursmethode voor het evalueren van genetische afwijkingen geassocieerd met kanker en het identificeren van moleculaire doelwitten voor precisie geneeskunde.

De meest voorkomende solide tumor biopten voor moleculaire testen omvatten in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) en fijne naald aspiratie (FNA) specimensens. Deze monsters zijn beladen met een lage hoeveelheid en / of lage kwaliteit nucleïnezuren die uitdagen accurate NGS assessments ^2-5. De huidige commerciële NGS methoden voor de analyse van deze monsters zijn gebaseerd op een lappendeken van verschillende reagentia, protocollen en informatica tools die bewegende doelen van voortdurende verbeteringen te vertegenwoordigen. Bijvoorbeeld veranderingen in bepalingsbuffer chemie en / of software gebeurde elke 1-2 maanden voor de meest gebruikte gerichte NGS kits ^6. Deze instabiliteit weerspiegelt een gebrek aan samenhang in de bouw en het verifiëren van een uniform systeem voor het NGS uitdagende types monster, in het bijzonder voor het testen van kanker, en legt een te grote last op laboratoria om samenhangende protocollen die zijn geoptimaliseerd van sample-to-resultaten te ontwikkelen. Inderdaad, een recent onderzoek van NGS gebruikers gewezen op de problemen van deze "snel veranderende" technologieën, samen met de eisen voor gevestigde, medisch-bruikbare inhoud, verschanst bioinformatica deskundigheid, een solidified en geïntegreerde procedure die snel kan worden uitgevoerd, en gestroomlijnde workflows en vereenvoudigde protocollen die te vergemakkelijken on-the-job training ^7. In dit artikel wordt een uitgebreid systeem voor gerichte NGS beschreven dat deze lacunes adressen.

De gepresenteerde methodiek integreert alle stappen in de procedure van pre-analytische post-analytische bij zowel natte als droge banken om de nauwkeurigheid, gevoeligheid en betrouwbaarheid van de doelgroep kwantificering en opsporing verbeteren NGS van klinisch relevante kankergen loci. Deze aanpak begint met de kwantificering van de 'functionele' DNA ⁴ tot DNA-kwaliteit te beoordelen, begeleiden inbreng in het PCR verrijking stap, en bescherming tegen vals-positieve gesprekken die kunnen voortvloeien uit het verhoor van de zeer lage template exemplaren. Een single-tube multiplex PCR verrijkt vervolgens voor 46 loci in 21 kankergenen met behulp van slechts 400 amplificeerbaar DNA-kopieën, gevolgd door incorporatie van platform-specifieke sequenties voor NGS using gewone desktop sequencing instrumenten. Bibliotheken worden gezuiverd met behulp van een eenvoudige magnetisch bolletje procedure en gekwantificeerd met een roman, kalibratie-vrij qPCR assay. Een standalone bioinformatica suite, op basis van DNA-monster QC resultaten aan de oproep van de prestaties te verbeteren, biedt sequentieanalyse volgende NGS. We presenteren gegevens met behulp van deze systemen aanpak voor gerichte NGS naar base-substitutie mutaties, insertie / deleties (indels) te onthullen, en kopieer het aantal varianten (CNV) en lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumor biopten zoals FFPE en FNA samples, en run controles.

Protocol

Opmerking: Dit protocol beschrijft de gelijktijdige verwerking van monsters met een MiSeq NGS systeem, maar kan worden aangepast voor de Personal Genome Machine (PGM) instrument. De aanbevolen minimale DNA vermogen van 400 amplificeren template kopieën de zuiverheid kan produceren tenminste 3,000x mediaan dekking voor alle 96 monsters per run NGS en gelijkwaardige dekking diepte voor 24 monsters met behulp van de PGM op 318 chip. De werkwijze vereist ook het gebruik van een real-time PCR instrument.

1. DNA Functionele kwantificeren en Quality Control (QC)

1. Dooi reagentia: 2x Master Mix, Primer Probe Mix, Remming Primer Probe Mix, 6-carboxy-X-rhodamine (ROX), Diluent en de vier humaan genomisch DNA ijklijn standaarden (DNA standaard (50 ng / pl), DNA Standard (10 ng / pl), DNA Standaard (2 ng / pl) en DNA standaard (0,4 ng / pl)) (tabel 1). Vortex alle reagentia voor 10 sec en centrifuge bij maximale snelheid 10 sec inhoud verzamelen.Houd de 2x master mix op ijs.
2. Bereid een voldoende hoeveelheid master mix voor het totale aantal te testen monsters en bevatten 10% meer volume tekorten door pipetteren voorkomen. Bereid de master mix in een microcentrifugebuis met behulp van de volgende volumes per sample: 5 pi 2x Master Mix, 0,5 pi Primer Probe Mix, 0,5 ul Remming Primer Probe Mix, 0,05 ui ROX en 2,95 ul Diluent. Vortex gedurende 10 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid 10 sec inhoud verzamelen.
3. Voeg 9 pi Master Mix in putjes van een 96-wells plaat.
4. Voeg 1 ul van de DNA standaarden in tweevoud een kalibratiekromme te genereren. Meng door pipetteren en neer 5 keer.
5. Zorg ervoor dat de nucleïnezuurmonster goed gemengd is voor gebruik. Voeg 1 pl monster naar de master mix en meng door pipetteren op en neer 5 keer.
6. Seal de plaat, vortex gedurende 10 seconden en centrifuge op maximale snelheid gedurende 10 seconden om de inhoud te verzamelen.
7. Plaats de plaat in de PCR System. Wijs beide FAM (functioneel kwantificering) en Victoria (functionele remming) detectoren voor elk monster volgens de instructies van de fabrikant. Voer PCR cycli van 10 minuten bij 95 ° C en 40 cycli (15 sec bij 95 ° C, 1 min bij 60 ° C).
8. Analyseer de qPCR gegevens door het genereren van een lineaire regressie grafiek voor elk van de dubbele DNA standaarden gebruikt softwareprotocollen.
9. Zet de Log ₁₀ van het kopieaantal voor elke DNA standaard op de x-as en de bijbehorende FAM _Cq waarde op de y-as.
10. Controleer of de resultaten binnen het dynamische bereik van de DNA standaarden ijkcurve het nucleïnezuurmonster vallen, en bereken de concentratie van de onbekende DNA in "functionele" of amplificeerbaar kopieaantal per pi van de overeenkomstige positie op de referentiestandaard curve. Figuur 1 toont voorbeelden van kalibratiecurven die voorbij en is mislukt.
11. Bepalen of versterking in elke reactie optrad door te controleren op de aanwezigheid van het niet-humane doelwit amplicon in de VIC kanaal.
    Opmerking: Als een positieve controle, de inhibitie Primer Probe Mix bevat primers die specifiek zijn voor een niet-humane exogeen target en het bijbehorende sjabloon. De remming Primer Probe Mix is ​​een onderdeel van de master mix die wordt toegevoegd aan elke reactie, waaronder de niet-template control (NTC). Bij afwezigheid van een remmer, moet het PCR product voor de niet-menselijk doel altijd gedetecteerd in de VIC kanaal. Een "undetected" _Cq een monster in de VIC kanaal de aanwezigheid van PCR remmers die kunnen profiteren van latere reiniging van het monster voorafgaand aan verdere verwerking.

2. Bibliotheek Bereiding: genspecifieke (GS) PCR

1. Bereid een voldoende hoeveelheid master mix het totale aantal te testen monsters en bevatten 10% meer volume tekorten door pipett voorkomening. Bereid de GS PCR Master Mix in een microcentrifugebuis met de volgende hoeveelheden per monster: 5 pl 2x Amplificatie Master Mix (Tabel 1) en 1 pl Pan Cancer Primer Panel (tabel 1). Meng door pipetteren en neer, vortex gedurende 10 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid 10 sec inhoud verzamelen.
2. Aliquot de GS 6 pi PCR Master Mix in putjes van een 96-wells plaat. Voeg 4 pi van elk nucleïnezuur monster in afzonderlijke putjes. Voor andere putjes, voeg 4 pi van de FFPE controle (tabel 1), 4 ui van de multivariate controle (tabel 1), en 4 pl nuclease-vrij water voor procedurele NTC. Voor elke toevoeging, meng door pipetteren en neer 5 keer.
3. Seal de plaat, vortex gedurende 10 seconden en centrifuge op maximale snelheid gedurende 10 seconden om de inhoud te verzamelen.
4. Plaats de plaat in de thermocycler voor de volgende PCR cyclus: 5 min bij 95 ° C,2 cycli (15 sec bij 95 ° C, 4 minuten bij 60 ° C), 23 cycli (15 sec bij 95 ° C, 4 minuten bij 72 ° C), en een laatste verlenging van 10 min bij 72 ° C. Houden op 4 ° C.
   Opmerking: Na het voltooien van stap 2,4, zal de plaat de GS PCR-plaat genoemd.

3. Bibliotheek Voorbereiding: Tag PCR

1. Dooi reagentia: 2x Index Master Mix (tabel 1) en Index Codes (tabel 1). Vortex gedurende 10 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid 10 sec inhoud verzamelen.
   Let op: Index codes worden vooraf gemengd om een ​​unieke set van paarsgewijs indices (barcodes) voor elk monster.
2. In een 96-well plaat, voeg 7,5 pl van 2x Index Master Mix en 5,5 pl van een Index Code een goed gespecificeerde en meng door pipetteren op en neer 5 keer.
3. Open voorzichtig de GS PCR-plaat, en voeg 2 pl GS PCR-product aan de nieuwe plaat met de master mix. Meng door pipetteren up-and-down 5 tijden. Voor elk monster, noteer de monster-ID en de bijbehorende paarsgewijze Index Codes. Seal de plaat, vortex gedurende 10 seconden en centrifuge op maximale snelheid gedurende 10 seconden om de inhoud te verzamelen.
4. Plaats de plaat in de thermocycler en PCR voor 5 min bij 95 ° C, 10 cycli (30 sec bij 95 ° C, 30 sec bij 55 ° C, 1 min bij 72 ° C), en een laatste verlenging van 10 min bij 72 ° C. Houden op 4 ° C.
   Opmerking: Na het voltooien van stap 3.4, wordt de plaat als de Tag PCR-plaat genoemd.

4. Bibliotheek Zuivering en Size Selection

1. Verwijder de bibliotheek Pure Prep magnetische korrels (Tabel 1) en Elution Buffer (Tabel 1) 2-8 ° C om de temperatuur tot kamertemperatuur gedurende 30 min. Voeg 9,6 ml 100% ethanol aan de Wash Buffer (Tabel 1) houder, deksel en meng door de fles meermaals.
2. Vortex de magnetische partikels voor 10 seconden en voeg 11 ul in afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat.
3. Open de Tag PCR-plaat en voeg 10 ul van Tag PCR-product aan de parels en pipet mix 5 keer. Incubeer het mengsel gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
4. Plaats de 96-well plaat op de magnetische standaard (Tabel 1) gedurende 4 min. De 96-well plaat nog op de standaard, Verwijder de supernatant met een pipet.
5. Verwijder de 96-well plaat uit de magnetische standaard en voeg 100 ul ethanol bevattende wasbuffer aan elk putje en meng door pipetteren op en neer 5 keer. Incubeer gedurende 2 min.
6. Plaats de 96-well plaat op de magnetische standaard voor 2 minuten, verwijder Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet.
7. Herhaal stap 4,5, een totaal van 2 ethanol wassen, verwijderen van zo veel mogelijk wasoplossing na de tweede maal spoelen.
8. Met de 96-well plaat op de magnetische stand, drogen de kralen gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de plaat uit de stand.
9. Resuspendeer de kralen door het toevoegen van 20 ui elutiebuffer aan elke well en pipet op en neer 5 keer.
10. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
11. Plaats de 96-well plaat terug op de magnetische standaard voor 4 minuten en verwijder voorzichtig en breng 18 pl van de heldere supernatant naar een nieuwe put.
    Opmerking: De procedure kan veilig worden gestopt bij deze stap en monsters bewaard bij -15 tot -30 ° C. Opnieuw op te starten, te ontdooien bevroren monsters op het ijs voordat u verder gaat.

5. Bibliotheek kwantificering

1. Dooi Library Quant (LQ) reagentia: 2x LQ Master Mix, LQ Primer / Probe Mix, LQ Standaard, LQ Positive Control, LQ Diluent en LQ ROX (tabel 1). Vortex gedurende 10 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid 10 sec inhoud verzamelen.
2. Het gebruik van gezuiverd bibliotheek producten, het uitvoeren van een seriële verdunning van elk individueel monster in LQ Diluent.
   1. Voeg 2 pi (bibliotheek gezuiverd product) aan 198 gl LQ Diluent en meng op en neer met een pipet 10 keer.
   2. Voeg 2 pl (1: 100 verdunning) naar 198 ul LQ Diluent en meng up-and-down met een pipet 10 keer.
3. Bereid een voldoende hoeveelheid LQ master mix het totale aantal te testen monsters en bevatten 10% meer volume tekorten door pipetteren voorkomen. Bereid de LQ Master Mix in een microcentrifugebuis met behulp van de volgende volumes per sample: 5 pl 2X LQ Master Mix, 2 pl LQ Primer / Probe Mix, 0,5 ul LQ Standard en 0,5 pi LQ ROX. Meng door pipetteren en neer, vortex gedurende 10 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid 10 sec inhoud verzamelen.
4. Voeg 8 ul LQ master mix tot een goed van een optische 96-well plaat.
5. In afzonderlijke putten, voeg 2 ul verdunde bibliotheek, 2 pl LQ Positive Control en 2 pl LQ Diluent (NTC) en meng door pipetteren up-and-down 5 keer. Seal de plaat met optische zelfklevende folie, vortex gedurende 10 seconden en centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 seconden om de inhoud te verzamelen.
6. Wijs zowel FAM en VIC DETECTOrs voor elk monster. Voer PCR amplificatie onder gebruikmaking cyclingcondities van 5 min bij 95 ° C en 40 cycli (15 sec bij 95 ° C, 1 min bij 60 ° C).
7. Bepaal de concentratie van elk monster (nM) met de vergelijkende methode _Cq. Bereken het verschil van de bekende LQ Standard _(Cq VIC) om de onbekende bibliotheek _(Cq FAM). De concentratie van het verdunde monster (PM) wordt berekend met de volgende vergelijking:
   [Conc _{lib] nM} = 12.5 x 2 ^{Δ Cq}
   Bij gebruik van een verdunningsfactor uitzondering 10.000 Bereken de verhouding van de beoogde verdunningsfactor 10.000 en vermenigvuldigt deze factor door het resultaat van de vergelijking van 5,7.

6. Bibliotheek Normalisatie en Sample Pooling

1. Bepaal de mediane concentratie (nM) over alle monsters (elk met een unieke paarsgewijs index) te bundelen.
2. Bepaal de individuele monster volume (pi) te bundelen door het vermenigvuldigen van de mediane concentratie in alle monsters met 5, dan delen door de individuele concentratie (nM). Rond de resulterende waarde naar het dichtstbijzijnde gehele getal. Ronde volumes waarden van <2 pi aan 2 ui en volumes> 15 pl tot 15 pl.
3. Voeg de genormaliseerde volume (ul) voor elk monster een microcentrifugebuis aan het monsterpoel maken.
4. Bereken de nieuwe concentratie voor elk monster met behulp afgeronde gehele waarden en noteer de resultaten.
5. Om de concentratie van de monsterpoel vaststelling, de som van alle afzonderlijke concentraties en het hieruit resulterende waarde (nM).
6. Verdun het monster zwembad om 1.25 nm met behulp van Sequencing Diluent (tabel 1).
   Opmerking: De procedure kan veilig worden gestopt bij deze stap en monsters bewaard bij -15 tot -30 ° C. Opnieuw op te starten, te ontdooien bevroren monsters op het ijs voordat u verder gaat.

7. Sequencing

1. Denature de monsterpoel in aanwezigheid van PhiX v3 controle (tabel 1) en daarin het volgende: 15 ui 1,25 nM monsterpoel, 3 pi 0,5 nM PhiX en 2 ui 1 N NaOH. Kort vortexen, gevolgd door een korte centrifugatie en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
2. Leg het gedenatureerde monster zwembad op het ijs.
3. Voeg 8 pi gedenatureerd bibliotheek 992 gl voorgekoeld HT1-Hyb buffer naar een microcentrifugebuis. Vortex kort te mengen, gevolgd door een korte centrifugeren om de inhoud te verzamelen. Houd op het ijs.
4. Voeg 600 pi van het gedenatureerde en verdund bibliotheek op positie # 17 van het reagens cartridge.
5. Dooi Lees 1 bepalende primers (Tabel 1), Index Lees Sequencing primers (Tabel 1) en 2 Lees Sequencing primers (Tabel 1). In microcentrifugebuizen, apart verdunnen 4 ui bepalende primers met 636 ul HT1-Hyb buffer. Opmerking: HT1-Hyb buffer is voorzien van with de sequentie reagenskit (tabel 1).
6. Meng door vortexen gedurende 10 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid 10 sec inhoud verzamelen. Voeg 600 ul van verdund Lees 1 Sequencing Primers op stand # 18 van de sequencing reagens cartridge, 600 pi van verdunde Index lezen Primers op stand # 19, en 600 pi van verdunde Lees 2 Sequencing Primers op stand # 20.
7. Laad de reagentia op de NGS instrument (Tabel 1) en sequentie volgens de instructies van de fabrikant. Voer een gepaarde-end 2 x 150 cyclus sequencing run.

8. Data Analysis

Let op: De NGS instrument software converteert cluster beelden naar de basis gesprekken en de kwaliteit scores, en demultiplext paarsgewijs indices voor de individuele gzip gecomprimeerde FASTQ genereren (* .fastq.gz) bestanden voor elk monster. Voorafgaand aan de analyse van de gedemultiplexte bestanden, moet de lezer downloaden en installeren van de bijbehorende bioinformatica software (Tabel1). De software kan worden geïnstalleerd op een consument-grade Windows PC en vereist geen gespecialiseerde computerhardware of een internetverbinding nodig om de data-analyse uit te voeren.

1. Dubbelklik op het pictogram software bureaublad.
2. Inloggen op het systeem met de gebruikersnaam en het wachtwoord in de software handleiding.
3. Open het dashboard project, en klik op "New Project".
   1. Noem het project en zorgen voor een optionele beschrijving van het project. Selecteer de beoogde NGS soort paneel en NGS het type instrument. Klik op 'Opslaan en doorgaan ".
   2. Upload de gecomprimeerde FASTQ bestanden voor de vooruit en achteruit leest. Laat de "niet-toegewezen" FASTQs, die bevat leest dat niet demultiplexen niet uploaden. Klik op 'Opslaan en doorgaan ".
   3. Het nummer van functionele kopieën ingang gebruikt om elke bibliotheek bereiden bepaald door het DNA kwantificatie functionele assay (zie stap 1 hierboven). Handmatig waarden of kopiëren en plakken waarden toevoegt uit een spreadvel in de annotatie tafel. Klik op 'Opslaan en doorgaan. "
   4. Geef je mening over de geannoteerde bibliotheken geüpload voor analyse en klik op 'Verzenden analyse "om de analyse te starten.
4. De voortgang van de analyse wordt weergegeven door middel van het dashboard project.
   Opmerking: Een analyse volledige status indicatie wordt gepresenteerd wanneer de resultaten zijn klaar voor beoordeling.
5. Geef je mening over de geanalyseerde resultaten voor het monster QC metrics inclusief totale dekking per bibliotheek, het percentage leest het passeren van filters, amplicon dekking diepte en uniformiteit. Geef je mening over de variant vraagt ​​om elk gesequenced bibliotheek met dbSNP, kosmisch, 1000 genomen en andere bronnen van functionele en populatieniveau annotatie.
6. Exporteer de ruwe resultaten als samenvatting spreadsheet tabellen * .bam bestanden en * VCF-bestanden voor langdurige opslag of downstream-analyse met complementaire informaticatools.

Results

Een totaal van 90 monsters (74 unieke) vertegenwoordigen positieve en negatieve controles, eerder gekarakteriseerde cellijnen, en de resterende klinische FFPE tumor biopsies werden beoordeeld op amplificeerbaar DNA, inbreng in multiplex PCR verrijking, gelabeld met opeenvolging adapters, streepjescode, en in een enkel geanalyseerd benchtop NGS instrument run (figuur 2), die 19,1 M geproduceerd leest passeren filter. Equimolaire monster pooling resulteerde in hoge scherptediepte sequencing (3,692x gelezen) en een uniforme dekking (97,8% van de amplicons gedekt binnen 5-voudige van de mediaan gelezen diepte). Uitschieters bestaat geen template controle, een cellijn DNA met een groot aantal kopieën amplificatie, en één FFPE DNA dat PCR remming werd gemarkeerd door de pre-analytische QC-test (figuur 3). Dekking uniformiteit over de 46 amplicons werd gehandhaafd met behulp van drie verschillende operatoren (Figuur 4A), en voor verschillende lage kwaliteit FFPE DNA-monsters ( Figuur 4B). Een FFPE tumor DNA controle, geformuleerd uit een mengsel van de resterende klinische monsters tot 5% BRAF V600E (gekwantificeerd door droplet digital PCR) te bereiken, werd gemeld aan het doel BRAF mutatie op abundanties van 3,9, 5,3 hebben, en 6,5% in drie operatoren gebruiken een invoer van 400 amplificeerbare kopieën (en dus slechts 20 mutant kopieën) (Figuur 4B en "FFPE3" van inzet tabel). Verder kan een mengsel van 12 synthetisch DNA-matrijzen, die elk een bekende "driver" base-substitutie mutatie, toonden verwachte mutaties op het bedoelde bereik van 9-17% gemiddelde allelfrequentie (tabel 2). Verdunning van cellijn en FFPE DNA-monsters met copy number amplificaties aangetoond dosis-afhankelijkheid voor varianten in EGFR en KRAS, respectievelijk (figuur 5). Belangrijker kan FFPE DNA ingang verminderd tot zo weinig als 50 geamplificeerde kopieën of 1,2 ng bulk DNA tegelijkertijd de detectie van bekende mutaties zonder vals-positievedringt (figuur 6). DNA inputs werden ondergebracht in een 100-voudig bereik tot ten minste 50.000 kopieën te amplificeren (Tabel 3). In deze en aanverwante experimenten variant dringt in FFPE 22 en 20 FNA monsters werden gerapporteerd in overeenstemming met onafhankelijke methoden met gedeelde mutatie bereik (Tabel 4).

De gevoeligheid en positief voorspellende waarde voor de test werd bepaald op basis van een analyse van de 97 monsters, met inbegrip van FFPE, FNA, vers ingevroren, en cellijn DNA, en een totaal van 195 sequencing resultaten. De resultaten bleek 365 echte positieve variant gesprekken, 4 vals negatieve gesprekken en 1 vals-positieve oproep tot een gevoeligheid van 98,9% (95% CI: 97,1-99,7%) en een positief voorspellende waarde (PPV) van 99,7% (95% CI : 98,2-99,99%). Analyses van indels werden uitgevoerd voor twee gemeenschappelijke EGFR varianten (p.E746_A750delELREA en p.V769_D770insASV) in 33 sample-runs, waaruit blijkt een gevoeligheid van 93,9% (95% CI: 78,4-98,9%) en een PPV van 100% (95% Cl: 86,3-100%) met varianten waargenomen over een bereik van 2,4-84,8%.

Figuur 1: Een voorbeeld van DNA Kwantificering Calibration Curves dat Pass en Fail QC Criteria (A) Een passerende standaard curve.. (B) Een falende standaard curve. In dit geval werd de storing veroorzaakt door duplicate pipetteren van de laagste ingang DNA-norm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Overzicht van een algehele gerichte NGS System for Oncology Toepassingen die integreert Pre-analytischeal, analytische en post-analytische workflows. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Lees Dekking en Uniformiteit voor gerichte NGS van genen Cancer in Lage-kwaliteit FFPE DNA vergelijking met intacte cel-lijn DNA en Controls in totaal 90 monsters die resterende klinische FFPE (gesloten cirkels), cellijn inbegrepen (open cirkels. ) en synthetische matrijs DNA (plustekens) werden verwerkt met een buis, 21-gen multiplex PCR verrijking. Elke amplicon bibliotheek werd gelabeld met adaptersequenties voor NGS instrument barcode met een duidelijke dubbele indexcode, gezuiverd, gekwantificeerd en genormaliseerd tot een concentratie van 2,5 nM. De DNA-bibliotheek werd gesequenced en geanalyseerd door de begeleidende bio-informatica software. sample devities bevatte een verdunningsreeks van MDA-MB-468 cellijn DNA voorzien van een groot EGFR kopieaantal amplificatie (bovenkant open rechthoeken binnen gestippelde cirkel) die dekking uniformiteit en een melanoom FFPE monster vervormd dat niet een aanzienlijk aantal genereren leest wijten om overdracht van PCR-remmers van de DNA-extractie. Het melanoom monster falen (bodem, gestippelde cirkel) werd voorspeld door de pre-analytische qPCR DNA-test QC. NTC, no-template controle (x symbolen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Amplicon-by-amplicon lezen Dekking, Uniformiteit en Variant Detection in Overblijvende Clinical FFPE Tumor DNA. (A) Lees de dekking in alle verrijkte loci in een representatieve FFPE DNA-monster gemetenover drie verschillende operators. Operator 1, Op1 (blauwe balken); Operator 2, Op2 (groene balken); Operator 3, OP3 (zwarte balken). (B) Dekking uniformiteit en variant gesprekken geëvalueerd met behulp van drie FFPE tumor samples, met inbegrip van een controle-mengsel (FFPE3, grijze balken en tekst) bestaat uit een bekende 5% BRAF c.1799T> A mutatie. FFPE1 (blauwe balken en tekst), FFPE2 (oranje bars en tekst). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5:. Dosisafhankelijke Detectie van Copy Number varianten in Cell-line FFPE DNA MDA-MB-468 cellijn DNA met een goed gekarakteriseerde EGFR kopieaantal amplificatie werd progressief verdund in een achtergrond van een referentie niet-gemuteerde cel -lijn DNA aan de daling van het aantal kopieën verandering als een illustratiefunctie van de verdunning. Het percentage van elke cellijn DNA monster wordt getoond met een duidelijke lijn (0, 12,5, 25, 50 en 100%). Verdunning van een ovariële FFPE tumor monster met een bekende KRAS amplificatie toonde een vergelijkbaar profiel met dezelfde titratie serie, maar met replica's van 100% FFPE DNA voor de bovenste twee lijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Accurate Mutatie Detectie en kwantificatie naar 50 amplificeerbaar FFPE DNA kopieën of 1,2 ng Bulk DNA Het amplificeerbare kopieaantal van darmkanker FFPE DNA werd bepaald door de qPCR-gebaseerde QC assay en verdund 400-25 exemplaren als. input multiplex PCR verrijking voorafgaand aan sequencing. De bioinformatica pijpleiding correct genoemd zowel van de bekende Variants tot 50 kopieën, of het equivalent van ~ 10 mutant templates. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam van de Material / Materiaal	Bedrijf	Catalogus nummer
2x Quantidex Master Mix	Asuragen	145345
Quant Primer Probe Mix	Asuragen	145336
Remming Primer Probe Mix	Asuragen	145344
ROX	Asuragen	145.346
oplosmiddel	Asuragen	145.339
DNA Standard (50)	Asuragen	145340
DNA Standard (10)	Asuragen	145.341
DNA Standaard (2)	Asuragen	145342
DNA standaard (0,4)	Asuragen	145.343
2x Amplification Master Mix	Asuragen	145.348
Pan Cancer Primer Panel	Asuragen	145.347
Pan Cancer FFPE Controle	Asuragen	145.349
Pan Cancer Multi-Variant Controle	Asuragen	145350
Bibliotheek Pure Prep Beads	Asuragen	145.351
wash Buffer	Asuragen	145352
Elution Buffer	Asuragen	145.353
2x LQ Master Mix	Asuragen	145.358
LQ Diluent	Asuragen	145.354
LQ PositieveControle	Asuragen	145.355
LQ Standard	Asuragen	145.356
LQ Primer / Probe Mix (ILMN)	Asuragen	145357
LQ ROX	Asuragen	145.359
Index Codes (ILMN) - Set A	Asuragen	150.004
AIL001 - AIL048 (48)
Index Codes (ILMN) - Set B	Asuragen	150.005
AIL049 - AIL096 (48)
2x Index Master Mix	Asuragen	145.361
Lees 1 Sequencing Primers	Asuragen	150001
Index lezen Sequencing Primers	Asuragen	150.002
Lees 2 Sequencing Primers	Asuragen	150.003
sequencing Diluent	Asuragen	145.365
Illumina MiSeq	Illumina
MiSeq Reagent Kit v3 (600-cyclus)	Illumina	MS-102-3003
MiSeq reagens Nano Kit v2 (300-cyclus)	Illumina	MS-103-1001
PhiX Controle v3	Illumina	FC-110-3001
Magnetic Stand-96 (of soortgelijke inrichting)	Ambion	AM10027
Quantidex Reporter Software	Asuragen

Tabel 1:. Reagentia en Kits Bij eerste gebruik van de ROX, bewaar het flesje bij 2-8 ° C. Niet opnieuw invriezen. De software kan worden gedownload op www.asuragen.com.

GENE	COSMIC variant	COSMIC aminozuur	% Variant
NRAS	c.182A> G	p.Q61R	13.3
NRAS	c.35G> A	p.G12D	15.2
HRAS	c.182A> G	p.Q61R	17.8
HRAS	c.35G> A	p.G12D	9.2
KRAS	c.182A> G	p.Q61R	13.5
KRAS	c.35G> A	p.G12D	19.1
PIK3CA	c.1633G> A	p.E545K	9.3
PIK3CA	c.3140A> G	p.H1047R	9.1
KIT	c.2447A> T	p.D816V	14.6
EGFR	c.2369C> T	p.T790M	11.3
EGFR	c.2573T> G	p.L858R	14.9
BRAF	c.1799T> A	p.V600E	17.3

Tabel 2: een gepoolde Synthetische controle bestaat uit 12 "Driver" Kanker genvarianten die worden geraamd op 9-17% Overvloed Een mengsel van 12 verschillende dubbelstrengs synthetische templates waarop 12 verschillende mutaties werd geëvalueerd na sequencing.. Alle varianten werden correct aangeroepen zonder false positives.

>% Variant

sample ID	functioneel cps	Gen	COSMIC variant	COSMIC aminozuur	Median read diepte	% Binnen 5x van het mediane
BCPAP	400	BRAF	c.1799T> A	p.V600E	99.5	3289	96%
BCPAP	10.000	BRAF	c.1799T> A	p.V600E	99.7	4040	98%
BCPAP	25.000	BRAF	c.1799T> A	p.V600E	99.4	3687	96%
BCPAP	50.000	BRAF	c.1799T> A	p.V600E	99.7	4611	93%

Tabel 3: Dekking en Variant Calling worden bewaard dan een> 100-voudig Bereik van DNA-ingang. amplificeerbaar DNA van een BCPAP cellijn werd ingevoerd in multiplex PCR verrijking bij 400 tot 50.000 exemplaren en gesequenced. Lees diepte, dekking uniformiteit, mutatie-detectie, en de nauwkeurigheid mutatie werden bewaard over de input range.

Tabel 4: Variant Calls in 22 FFPE en 20 FNA Tumor biopten Eens met resultaten van Independent mutatieassays Een set van 22 FFPE-tumor DNA met mutatie-status eerder bepaald door orthogonale gerichte NGS assays werd ingevoerd bij 400 tot 2928 amplificeerbaar kopieën in de PCR verrijking. stap en gesequenced met behulp van de 21-gen panel Pan Cancer. Bovendien, een cohort van 20 FNA DNA monsters eerder gekarakteriseerd onder toepassing van een vloeibare bead matrix mutation assay ⁸ werd met PCR geamplificeerd met 156 tot 36.080 ingang amplificeerbaar kopieën en gesequenced. Alle overlappende gesprekken tussen het paneel Pan Cancer NGS en de referentieNVU methoden waren in overleg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

NGS technologieën zijn verwachtingen voor het ondervragen van de moleculaire profielen van de tumor biopten in klinische settings ⁹ geherdefinieerd. Een aantal gerichte NGS panelen zijn ontwikkeld als onderzoekstechnologieën, laboratorium ontwikkelde testen, en in de handel verkrijgbare producten en aangepaste panelen voor het beoordelen van meerdere typen klinische monsters ^3,5,10-15. Verslagen van meerdere onderzoeken is de waarde van NGS aangetoond dat een gevoelige en specifieke klinische instrument voor de detectie van genomische veranderingen ^3,10-12,14. Toch blijkt overigens het risico van artefacten die vals positieve resultaten uit uitdagende kanker biopsies zoals FFPE specimens ^2-5,12,14 kunnen veroorzaken. Daarnaast hebben recente publicaties hoge uitvalpercentages gemarkeerd voor NGS gebruik oncologie exemplaren ¹⁶ en vals-positieve gesprekken met commercieel gerichte NGS panelen die worden verergerd door het gebruik van low-input ^DNA-12. Daardoor sommige LaboraTories zijn ofwel aangepast of extra checks and balances toegevoegd aan in de handel verkrijgbare gerichte NGS technologieën om de prestaties te verbeteren, vaak om de nauwkeurigheid te waarborgen of te bevestigen de bevindingen uit de bioinformatica analyses ^5,10,11.

De 21-gen (zie figuur 2) werd ontwikkeld als gerichte content voor een uitgebreid NGS systeem om evidence-based, bruikbare mutaties ondervragen in moeilijke types monster zoals FFPE en FNA tumor biopten. De workflow heeft een aantal voordelen: 1) de samenhang door het verstrekken van een uniforme amplicon dekking (figuren 3 en 4, tabel 3); 2) het gemak van het gebruik door het verstrekken van pre-geformuleerde, geoptimaliseerde reagens sets, en vereenvoudiging van de bioinformatica eisen; 3) de efficiency door het stroomlijnen van de workflow en het verminderen van het aantal pipetteren stappen in vergelijking met andere commerciële NGS methoden; en 4) de nauwkeurigheid door het opnemen van een DNA-QC-test voor het beoordelen van de versterkerkunnen DNA copy number om ervoor te zorgen aanvaardbare template diversiteit en vermijd stochastische fluctuaties in variant detectie ^4. De integratie van de pre-analytische QC data met de bioinformatica analyse maakt lage ingangen van FFPE DNA. Dit werd bereikt door het trainen van een beslissing-tree algoritme met behulp van verschillende functionele kopieën van DNA-ingang over 400 FFPE monsters met onafhankelijke maatregelen van de waarheid, en de integratie van dit algoritme in de bio-informatica-software. Daardoor is de aanbevolen inbreng van 400 amplificeerbare exemplaren, meestal gelijk aan ~ 5-20 ng FFPE DNA, steekt gunstig af bij andere methoden ^10-12, waaronder hybridisatie gebaseerde Verrijking ~ 250 ng DNA aanbevolen FFPE ^17,18 . Hoewel de techniek is beschreven voor gebruik op een MiSeq platform kan worden gemodificeerd door Tag PCR primers met instrument-specifieke adapters sequentieanalyse andere NGS platforms mogelijk.

Verschillende stappen zijn van cruciaal belang om succes te garanderenvan de procedure. De pre-analytische QC assay bepaalt het amplificeerbare aantal kopieën van DNA en rapporten functionele remming. Indien echter minder dan 400 amplificeerbaar DNA kopieën worden in de PCR verrijkingsstap, er een verhoogd risico op vals-negatieve telefoontje van monsters met een lage abundantie mutaties (figuur 6). Bovendien moet zorg gedurende bibliotheek zuivering worden genomen lang drogen van de magnetische korrels tijdens de was- of elutiestappen voorkomen. Bovendien succesvol bibliotheek kwantificering is sterk afhankelijk van de juiste verdunning van DNA bibliotheek. Voor het beste resultaat, het verschil van de qPCR resultaten voor samplebibliotheek (Cq FAM) vergeleken met de standaard LQ (Cq VIC) moet ≤3.3 Cq. Indien het verschil groter is dan 3,3 Cq, re-verdunning en testen van het monster wordt aanbevolen. Hoewel een uitstekende correlatie waargenomen tussen deze competitieve qPCR methode en commerciële kits die absolute kwantificatie met behulp van een standaardcurve biedenEen offset van de bibliotheekinvoer in de klonale amplificatie stap ten opzichte van andere werkwijzen noodzakelijk zijn om optimale zaaidichtheid bereiken.

Sommige kanker exemplaren zijn bijzonder uitdagend om te sequencen omdat remmers die blijven bestaan ​​na DNA-isolatie. Om deze monsters voorafgaand aan de bibliotheek preparaat kunnen identificeren, de qPCR QC test detecteert ook versterking remming door het opnemen van een exogene template dat dient als zowel een interne controle en een schildwacht voor functionele remming. Een voorbeeld is weergegeven in figuur 3 waarin een melanoom DNA monster niet de QC remming gegeven voorafgaand aan sequencing passen en niet een library die kan worden gesequenced genereren. Het falen zou waarschijnlijk een gevolg van melanine vervuiling, een bekende remmer PCR, uit het FFPE DNA isolatiestap uitgevoerd. Monsters die worden geïdentificeerd door de QC-test te worden met het risico voor de amplificatie falen kan worden gered door middel van een extra clean-up stap to verwijderen potentiële remmers.

De beoogde 21-gen panel richt zich op evidence-based-gen hotspots en biedt een compleet systeem met geoptimaliseerde reagentia en controles voor DNA QC, NGS en bioinformatica software die wordt geïnformeerd door pre-analytische "functioneel" DNA kwantificering resultaten. De werkwijze detecteert nauwkeurig base-substitutie mutaties en indels van extensieve DNA, en een voorbeeld van een NGS systeem de mogelijkheid inhoudskader breiden, om extra varianten zoals CNVs detecteren en aangepast voor gerichte RNA sequentie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x Quantidex Master Mix	Asuragen	145345
Quant Primer Probe Mix	Asuragen	145336
Inhibition Primer Probe Mix	Asuragen	145344
ROX	Asuragen	145346
Diluent	Asuragen	145339
DNA Standard (50)	Asuragen	145340
DNA Standard (10)	Asuragen	145341
DNA Standard (2)	Asuragen	145342
DNA Standard (0.4)	Asuragen	145343
2X Amplification Master Mix	Asuragen	145348
Pan Cancer Primer Panel	Asuragen	145347
Pan Cancer FFPE Control	Asuragen	145349
Pan Cancer Multi-Variant Control	Asuragen	145350
Library Pure Prep Beads	Asuragen	145351
Wash Buffer	Asuragen	145352
Elution Buffer	Asuragen	145353
2X LQ Master Mix	Asuragen	145358
LQ Diluent	Asuragen	145354
LQ Positive Control	Asuragen	145355
LQ Standard	Asuragen	145356
LQ Primer/Probe Mix (ILMN)	Asuragen	145357
LQ ROX	Asuragen	145359
Index Codes (ILMN) - Set A, AIL001 - AIL048 (48)	Asuragen	150004
Index Codes (ILMN) - Set B, AIL049 - AIL096(48)	Asuragen	150005
2x Index Master Mix	Asuragen	145361
Read 1 Sequencing Primers	Asuragen	150001
Index Read Sequencing Primers	Asuragen	150002
Read 2 Sequencing Primers	Asuragen	150003
Sequencing Diluent	Asuragen	145365
Illumina MiSeq	Illumina
MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle)	Illumina	MS-102-3003
MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle)	Illumina	MS-103-1001
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001
Magnetic Stand-96 (Or equivalent device)	Ambion	AM10027
Quantidex Reporter Software	Asuragen