Immunohistochemmie is een krachtige laboratoriumtechniek voor het evalueren van eiwitlokalisatie en -expressie in weefsels. Huidige semi-automatische methoden voor kwantificering introduceren subjectiviteit en leiden vaak tot onherhaalbare resultaten. Hier beschrijven we methoden voor multiplexte immunohistochemmie en objectieve kwantificering van eiwitexpressie en co-lokalisatie met behulp van multispectrale beeldvorming.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantificering van eiwitexpressie en Co-localisatie behulp multiplexverzending Immuno-histochemische kleuring en multispectrale
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Immunohistochemie is een veel gebruikte klinische en onderzoekslaboratoriumdetectietechniek voor het onderzoeken van eiwitexpressie en -lokalisatie in weefsels. Er zijn veel semi-kwantitatieve systemen ontwikkeld voor het scoren van expressie met behulp van immunohistochemie, maar de inherente subjectiviteit beperkt de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van de resultaten. Bovendien is de onderzoek naar ruimtelijk overlappende biomarkers, zoals nucleaire transcriptiefactoren, moeilijk met de huidige immunohistochemietechnieken. We hebben een systeem ontwikkeld en geoptimaliseerd voor gelijktijdig onderzoek van meerdere eiwitten met behulp van hoogdoorvoermethoden van multiplex immunohistochemie en multispectrale beeldvorming. Multiplex immunohistochemie wordt uitgevoerd door sequentiële toepassing van primaire antilichamen met secundaire antilichamen geconjugeerd aan paardenradenperoxidase of alkalische fosfatase. Verschillende chromogenen worden gebruikt om elk eiwit van belang te detecteren. Gekleurde dia's worden geladen in een geautomatiseerde diascanner en er wordt een protocol gemaakt voor geautomatiseerde beeldacquisitie. Een spectrale bibliotheek wordt gemaakt door een reeks dia's te kleuren met een enkele chromogeen op elk. Een subset van representatieve gekleurde afbeeldingen wordt geïmporteerd in multispectrale beeldvormingssoftware en een algoritme voor het onderscheiden van weefseltype wordt gemaakt door weefselcompartimenten op afbeeldingen te definiëren. Subcellulaire compartimenten worden gesegmenteerd door gebruik te maken van hematoxylincoulering en aanpassing van het intrinsieke algoritme. Drempelwaarden worden toegepast om positiviteit en eiwitco-lokalisatie te bepalen. Het uiteindelijke algoritme wordt vervolgens toegepast op de volledige set weefsels. De resulterende gegevens stellen de gebruiker in staat om eiwitexpressie te evalueren op basis van weefseltype (bijv. epitheel versus stroma) en subcellulair compartiment (nucleus versus cytoplasma versus plasmamembraan). Co-lokalisatie-analyse maakt onderzoek mogelijk naar dubbel-positieve, dubbel-negatieve en enkel-positieve celtypen. Het combineren van multispectrale beeldvorming met multiplex immunohistochemie en geautomatiseerde beeldacquisitie is een objectieve, hoogdoorvoermethode voor het onderzoek van biomarkers in weefsels.
Inleiding
Immunohistochemie (IHC) is een standaard laboratorium techniek voor detectie van eiwitten in weefsel en IHC nog veel gebruikt in zowel onderzoek als diagnostische pathologie. De evaluatie van IHC kleuring is vaak semi-kwantitatieve, de invoering van mogelijke vertekening in de interpretatie van de resultaten. Veel semikwantitatieve benaderingen ontwikkeld die zowel kleurintensiteit en kleuring mate nemen in einddiagnose 1-4. Andere systemen omvatten scoring intensiteit en subcellulaire locatie om expressie 5 beter te lokaliseren. Opname van de gemiddelde scores van de verschillende kijkers wordt vaak gebruikt om de effecten van één kijker ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Het protocol hierin beschreven kleuring en analyse van een tissue microarray (TMA), 12,17,18 eerder beschreven. De 4 pm dik TMA sectie werd verkregen uit een paraffine blok met behulp van een standaard microtoom.
LET OP: Een spectrale bibliotheek voor de 4 chromogenen en tegenkleuring moet worden gecreëerd voor het kwantificering. Om dit te bereiken moet het protocol geoptimaliseerd voor elk antilichaam worden uitgevoerd met één antilichaam per dia, minus de tegenkleuring. Een vijfde dia worden gekleurd met hematoxyline de 5 afbeeldingen nodig spectrale bibliotheek te maken genereren.
1. Multiplex Immunohistochemie
- Bak....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In figuur 1 is training uitgevoerd op prostaatweefsel segmenteren afbeeldingen in epitheliale en stromale delen, tezamen met het niet-weefselcompartiment. Via de epitheliale membraan marker E-cadherine werd cel segmentatie uitgevoerd om de kern, cytoplasma en membraan gedeelten, getoond in figuur 2 te scheiden.
In één experiment gebruikten we gemultiplexte IHC om de expressie en lokalisatie va.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het gebruik van traditionele immunohistochemie gaan eiwitexpressie wordt beperkt door subjectieve, semi-kwantitatieve analysemethoden 22,23. Advance platforms zijn gemaakt voor high-throughput analyse van biomarker expressie en lokalisatie. Gedetailleerde segmentatie van zowel weefsel en subcellulaire compartimenten kunnen gebruikers biomarker expressie, lokalisatie, en co-lokalisatie te studeren met andere markers van belang. In eerdere studies hebben we het nut van IHC en multispectrale, vooral wanneer gebr.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken de Universiteit van Wisconsin Translational Research Initiatives in Pathologie laboratorium, mede ondersteund door de UW afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde en UWCCC subsidie P30 CA014520, voor het gebruik van de faciliteiten en diensten.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Xyleen | Fisher Chemical | X3F1GAL | NFPA-classificatie: Gezondheid – 2, Vuur – 3, Reactiviteit – 0 |
| Ethyl Alcohol-200 proof | Fisher Scientific | 4355223 | NFPA-classificatie: Gezondheid – 0, Vuur – 3, Reactiviteit – 0 |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | NFPA-classificatie: Gezondheid – 2, Vuur – 0, Reactiviteit – 0 |
| Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | NFPA-classificatie: Gezondheid – 2, Vuur – 0, Reactiviteit – 0 |
| Tween 20 | Chem-Impex | 1512 | NFPA-classificatie: Gezondheid – 0, Vuur – 1, Reactiviteit – 0 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP2944-100 | NFPA-classificatie: Gezondheid – 1, Vuur – 0, Reactiviteit – 0 |
| Peroxidazed | Biocare Medical | PX968 | Vermijd contact met huid en ogen. Kan huidirritatie en oogbeschadiging veroorzaken. |
| Oestrogen Receptor alpha | Thermo Fisher Scientific-Labvision | RM9101 | Niet geclassificeerd als gevaarlijk |
| Androgen Receptor | SCBT | sc-816 | Niet geclassificeerd als gevaarlijk |
| CD147 | Biodesign | P87535M | Niet geclassificeerd als gevaarlijk |
| E-cadherin | Dako | M3612 | Niet geclassificeerd als gevaarlijk |
| Renoir Red Andibody Diluent | Biocare Medical | PD904 | Speciaal ontworpen voor gebruik met Tris-gebaseerde antilichamen |
| DeCloaking Chamber | Biocare Medical | Model DC2002 | Neem normale voorzorgsmaatregelen voor het gebruik van een snelkookpan |
| Barrier pen-Immuno Edge | Vector Labs | H-4000 | |
| Denaturing Kit-Elution step | Biocare Medical | DNS001H | Niet geclassificeerd als gevaarlijk |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer | Biocare Medical | RHRP520 | Niet geclassificeerd als gevaarlijk |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer | Biocare Medical | RALP525 | Niet geclassificeerd als gevaarlijk |
| Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer | Biocare Medical | M3M530 | Niet geclassificeerd als gevaarlijk |
| Betazoid DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | BDB2004 | 1. DAB staat bekend als een vermoedelijke carcinogeen. 2. Stel DAB-componenten niet bloot aan sterk licht of direct zonlicht. 3. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en kleding. 4. DAB kan huidsensibilisatie veroorzaken. Vermijd contact met huid en ogen. 5. Neem alle federale, staats- en lokale milieuwetgeving met betrekking tot verwijdering in acht |
| Warp Red Chromogen Kit | Biocare Medical | WR806 | Corrosief. Zuur dat huidirritatiek of oogbeschadiging kan veroorzaken. |
| Vina Green Chromogen Kit | Biocare Medical | BRR807 | Schadelijk indien ingeslikt |
| Bajoran Purple Chromogen Kit | Biocare Medical | BJP807 | Ontvlambare vloeistof. Uit de buurt van hitte, vlammen en vonken houden. Schadelijk bij inslikken of absorptie. Vermijd contact met huid of ogen, en vermijd inademing. |
| Cat Hematoxylin | Biocare Medical | CATHE | Paarse oplossing met een milde azijnzuur (azijn) geur. Kan irriterend zijn voor huid of ogen. Vermijd contact met huid en ogen. Vermijd inname. |
| XYL Mounting Media | Richard Allen | 8312-4 | NFPA-classificatie: Gezondheid – 2, Vuur – 3, Reactiviteit – 0 |
| 1.5 Coverslips | Fisher Brand | 22266858 | Scherpe randen |
| Incubation (Humidity)Chamber | obsolete | obsolete | Meerdere leveranciers beschikbaar |
| Convection Oven | Stabil- Therm | C-4008-Q | |
| Background Punisher Blocking Reagent | Biocare Medical | BP974 | Dit product is niet geclassificeerd als gevaarlijk. |
| inForm software | PerkinElmer | CLS135781 | Primaire multispectrale beeldvormingssoftware gebruikt in manuscript |
| Nuance software | PerkinElmer | Nuance EX | Software gebruikt voor het maken van spectrale bibliotheken binnen manuscript |
| Vectra microscope and slide scanner | PerkinElmer | VECTRA | Geautomatiseerde diascanner en microscoop voor het verkrijgen van IM3 beeldkubussen |
Referenties
- Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
- Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. E....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Meer artikelen verkennen
