De ontwikkeling van gevriesdroogde Loop-gemedieerde Isotherme Amplification reagentia voor de detectie van Coxiella burnetii

Summary

We beschreven hier een eenvoudige loop-mediated isothermal amplification (LAMP) methode met behulp van gelyofiliseerd reagens voor de detectie van C. burnetii in monsters van patiënten.

Abstract

Coxiella burnetii, de agent waardoor Q-koorts, is een obligaat intracellulaire bacterie. PCR gebaseerde diagnostische testen ontwikkeld voor het detecteren C. burnetii DNA in celculturen en klinische monsters. PCR vereist gespecialiseerde apparatuur en uitgebreide training van eindgebruikers, en daarom niet geschikt voor routinematige werken vooral in een gebied met beperkte hulpbronnen. We hebben a-loop gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) test om de aanwezigheid van C. detecteren ontwikkeld burnetii in monsters van patiënten. Deze werkwijze wordt uitgevoerd bij een temperatuur rond 60 ° C in een waterbad of verwarmingsblok. De gevoeligheid van deze assay LAMP is vergelijkbaar met PCR met een detectielimiet van ongeveer 25 kopieën per reactie. Dit rapport beschrijft de bereiding van het reactiemengsel middels gevriesdroogde reagentia en visualisatie van resultaten via Hydroxynaftolblauw blauw (HNB) of een UV-lamp met fluorescerende intercalerende kleurstof in het reactiemengsel. De LAMP reagentia waren lyophilized en bewaard bij kamertemperatuur (KT) gedurende één maand zonder verlies van detectiegevoeligheid. Dit LAMP test is bijzonder robuust omdat het reactiemengsel preparaat geen complexe stappen omvatten. Deze methode is ideaal voor gebruik in beperkte middelen waar de Q-koorts endemisch is.

Introduction

De kleine Gram-negatieve bacterie Coxiella burnetii is de verwekker van Q-koorts, die wereldwijd zoönose. Als gevolg van de wereldwijde distributie Q-koorts en de hoge infectiviteit van C. burnetii, de VS militair en civiel personeel in het buitenland ingezet lopen het risico van besmetting in de endemische gebieden.

Q-koorts manifesteert zich in twee vormen: acute en chronische infecties. Acute Q-koorts presenteert zich met griepachtige symptomen, hepatitis, of longontsteking, en is meestal een self-limiting ziekte met een lage sterfte. Chronische Q-koorts, terwijl minder gangbaar, resulteert vaak in endocarditis, die een veel hogere sterftecijfer heeft indien onbehandeld ^1,2. Daarom, vroege diagnose te begeleiden een passende behandeling is van cruciaal belang voor de patiëntenzorg. Polymerase kettingreactie (PCR) en kwantitatieve real time PCR (qPCR) assays ontwikkeld voor het detecteren C. burnetii DNA in celculturen en klinische monsters ^{3-5 <}/ Sup>. Zowel PCR en qPCR zijn duur en vaak niet direct beschikbaar in resource-constrained gebieden voor routinewerk.

Oorspronkelijk beschreven door Notomi ^6-loop gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) biedt een alternatieve DNA-amplificatie methode. LAMP gebruikt Bst DNA polymerase voor strengverplaatsing DNA-synthese met speciaal ontworpen primersets die ten minste zes onafhankelijke gebieden van het doelgen herkennen. Het belangrijkste voordeel van LAMP is dat amplificatie plaats onder isotherme omstandigheden. Daarom wordt slechts een waterbad, verwarming blok of een incubator vereist. Deze methode werd gebruikt om verschillende rickettsia ziekteverwekkers ^7-9 detecteren. Visualisatie van geamplificeerde DNA-producten door gelelektroforese is de meest accurate methode die terecht positieve valse positieven kunnen differentiëren door niet-specifieke amplificatie. Maar de bij gelelektroforese procedures niet praktisch voor beperkte middelen arEAS. Verschillende alternatieve methoden ontwikkeld om de reactieproducten gedetecteerd. Deze alternatieve zoals troebelheid afgeleid van magnesiumpyrofosfaat formatie ¹⁰ of met een fluorescerende intercalerende kleurstof onder UV-licht ^11,12 worden gevisualiseerd gunstiger dan het draaien van een gel. De LAMP reagentia waren een maand stabiel indien bewaard bij 25 ° C en 37 ° C, waarbij omgevingstemperatuur in tropische en subtropische landen waarin Q-koorts endemisch ^13.

Een LAMP assay werd ontwikkeld in ons laboratorium om de aanwezigheid van sporen C. burnetii in ¹⁴ plasmamonsters. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de bereiding van de LAMP reactiemengsel uit de gevriesdroogde reagentia. De gevriesdroogde reagentia een maand stabiel indien bewaard bij kamertemperatuur. In combinatie met een eenvoudige visualisatiemethode is dit een ideale methode te gebruiken voor het detecteren C. burnetii in een beperkte middelen setting.

Protocol

1. Bereid Plasmid DNA verdunningen als norm voor LAMP Reaction

1. Gebruik een spectrofotometer om de optische dichtheid (OD) gemeten bij 260 nm aan het plasmide (bevattende doelwitgen IS1111a van C. burnetii RSA 493) DNA-concentratie te bepalen. Een OD ₂₆₀ van 1 gelijk aan 50 ug / ul DNA.
2. Zetten de hoeveelheid plasmide DNA in het kopieaantal. Aangezien de grootte van het plasmide 6330 bp, het molecuulgewicht van dit plasmide is 4,1 x 10 ⁶ g (6330 bp x 649 g / bp). De DNA-concentratie van het plasmide 34,2 ng / pl (zoals bepaald uit stap 1.1). 1 pl van deze DNA-monster bevat 34,2 ng plasmide-DNA, hetgeen neerkomt op 5 x 10 ⁹ kopieën (34,2 x 10 ^-9 g / 4,1 x 10 ⁶ GX 6.02 x 10 ²³⁾ van DNA.
3. Voeg 10 ul van plasmide-DNA (5 x 10 ⁹ kopieën / ul) aan 90 ul van water voor een 10-voudige verdunning van een DNA-monster van 5 x 10 ⁸ kopieën / pl.
4. Herhaal stap 1,3 tot DNA-monsters van 5 x 10 ⁷ bereiden, 5 x 10 ^6, 5 x 10 ^5, 5 x 10 ^4, 5 x 10 ^3, 5 x 10 ^2, 5 x 10 ^1, en ​​5 x 10 ⁰ kopieën / pl.

2. Bereid Template DNA van Monsters voor LAMP Reaction

1. Voer DNA extractie uit humaan plasma onder toepassing van een commerciële DNA Mini Kit volgens het protocol van de fabrikant. Met in totaal 200 gl monster voor extractie en elueren geëxtraheerde DNA in een 20 ui volume.

3. Maak 2x LAMP Reaction Buffer

1. Meng 200 pl 10x Pol buffer, 320 pl 5 M trimethylglycine, 12 gl 1 M _MgSO4, 280 ui dNTP mengsel (10 mM elk) en 188 gl water tot 1 ml 2x LAMP buffer maken. Mix van pulse-vortexen gedurende 10 sec.

4. Voer Standard LAMP Reaction

1. Meng 12,5 pi 2x LAMP buffer (zoals bereid in stap 3; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM KCl, 16 mM _MgSO4, 20 mM (NH _{4) 2} SO _4, 0,2% Triton X-100, 1,6 M trimethylglycine, 1,4 mM dNTP mengsel), 1,2 pl primer mix, 1 ui Bst DNA polymerase (8 U / pl) en 5,3 pi water reactiemengsel (20 ui) in een 0,2 ml PCR buis maken.
2. Voeg 5 pl DNA (van stap 1 en 2) naar de 20 pi reactiemengsel en meng goed.
3. Afsluiten buis en incubeer bij 60 ° C gedurende 60 min in een waterbad of verwarmingsblok. Dit is de optimale reactietemperatuur vooraf bepaald.
4. Voeg 5 ui 10X gelbeladingsbuffer om de reactie te beëindigen.
5. Belasting 5 pi reactieproducten tot een 2% agarosegel gekleurd met intercalerende nucleïnezuur vlek.
6. Run gel bij 100 V gedurende 35 minuten in 1 x TBE buffer.
7. Visualiseer de resultaten door UV-licht.

5. Voer LAMP Reactie met Gereconstitueerdreagentia

1. Meng 125 gl 10x Pol buffer, 200 pl 5 M trimethylglycine, 7,5 gl 1 M _MgSO4, 667,5 ui water 1 ml buffer reconstitutie maken. Mix van pulse-vortexen gedurende 10 sec.
2. Verwijder buizen die gevriesdroogde reagentia uit de verzegelde aluminiumfoliezak bevatten. Laat de buizen als de aluminiumfolie zak niet is afgedicht gebruikt of als het beschadigd is.
3. Voeg 20 ul van reconstitutie buffer in elke buis opnieuw te suspenderen gevriesdroogde reagentia.
4. Meng door pipetteren buffer op en neer 5 keer. Neem een ​​kijkje om te controleren of de gevriesdroogde reagentia volledig opnieuw opgeschort. Het witte poeder moet verdwijnen in de buis.
5. Voeg 5 ui DNA-matrijs (van stap 1 en 2) om het opgeloste reagentia en meng goed.
6. Afsluiten buis en incubeer bij 60 ° C gedurende 60 min in een waterbad of verwarmingsblok.
7. Voeg 5 ui 10X gelbeladingsbuffer om de reactie te beëindigen.
8. Belasting 5 gl reactiemengselproducten om een ​​2% agarosegel gekleurd met intercalerende nucleïnezuur vlek.
9. Run gel bij 100 V gedurende 35 minuten in 1 x TBE buffer.
10. Visualiseer de resultaten door UV-licht.

6. Voer LAMP Reactie met Reconstitution Buffer bevattende HNB of Fluorescent intercalerende Dye

1. Meng 125 gl 10x Pol buffer, 200 pl 5 M trimethylglycine, 7,5 gl 1 M _MgSO4, 7,5 ui 20 mM HNB (of 12,5 pl 100x fluorescerende intercalerende kleurstof) en 660 gl (of 655 pl) van water maak 1 ml reconstitutie buffer. Mix van pulse-vortexen gedurende 10 sec.
2. Gebruik de bereide buffer bereid in hoofdstuk 6 om de stappen te herhalen 5.2 - 5.6.
3. Visualiseren van de resultaten met het blote oog (reactie die HNB) of UV licht (reactie die intercalerende fluorescente kleurstof).

7. Voer Real-time LAMP Reactie met Tube Scanner

1. Voeg 5 ul DNA de reconstituted reagentia met fluorescerende intercalerende kleurstof, dicht buis en voeg deze aan de buis scanner.
2. Stel incubatietemperatuur bij 60 ° C. Meet de fluorescentie bij 520 nm gedurende 60 min.

Results

Het gevriesdroogde LAMP reagentia in de 0,2 ml buisje bevat Bst DNA polymerase, primers en dNTP's. 20 ui buffer reconstitutie wordt gebruikt om resuspendeer de gevriesdroogde reagentia. Figuur 1 toont de resultaten LAMP reactie op agarosegels met vers bereide reagentia en reagentia gevriesdroogd. Het gevriesdroogde reagens heeft geen activiteit te verminderen. LAMP reacties bereid door beide reagentia kan 25 kopieën van DNA-matrijs. Figuur 2...

Discussion

Eerder hebben we een gevoelige en specifieke test gericht op de LAMP inbrengorgaan IS1111a ^14. De IS1111 element werd gekozen omdat het sterk geconserveerd onder de verschillende stammen van C. burnetii en het hoge aantal kopieën (7-110) in de bacteriën (Klee 2006). Onze resultaten toonden dat LAMP ongeveer 25 kopieën van IS1111 element, die correleren met slechts een chromosomale kopie van Coxiella DNA kan detecteren. In deze studie, Bst DNA polymerase, L...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LAMP primers	Eurofins MWG operon	10 nmol, zout vrij	Door klant ontworpen sequentie
Bst DNA polymerase	New England Biolabs	M0275L	8 eenheden/ml
10x Thermo pol buffer	New England Biolabs	B9004S
dNTP-mengsel	New England Biolabs	N0447L	10 mM elk
Betaine	Sigma-Aldrich	B0300	5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M3409-1ML	1 M
10x Bluejuice	Invitrogen	10816-015	gel-laadbuffer
SYBR green	Invitrogen	S7585	10.000x, visualiseer producten in buizen
GelRed	Phenix Research Products	RGB-4103	10.000x, visualiseer producten in gels
Gelyofiliseerd reagens	Gene Reach
Hydroxynaftol blauw	Fluka	33936-10G
ESEQuant buisscanner	Qiagen		real-time detectie