We beschreven hier een eenvoudige loop-mediated isothermal amplification (LAMP) methode met behulp van gelyofiliseerd reagens voor de detectie van C. burnetii in monsters van patiënten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De ontwikkeling van gevriesdroogde Loop-gemedieerde Isotherme Amplification reagentia voor de detectie van
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Coxiella burnetii, de agent waardoor Q-koorts, is een obligaat intracellulaire bacterie. PCR gebaseerde diagnostische testen ontwikkeld voor het detecteren C. burnetii DNA in celculturen en klinische monsters. PCR vereist gespecialiseerde apparatuur en uitgebreide training van eindgebruikers, en daarom niet geschikt voor routinematige werken vooral in een gebied met beperkte hulpbronnen. We hebben a-loop gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) test om de aanwezigheid van C. detecteren ontwikkeld burnetii in monsters van patiënten. Deze werkwijze wordt uitgevoerd bij een temperatuur rond 60 ° C in een waterbad of verwarmingsblok. De gevoeligheid van deze assay LAMP is vergelijkbaar met PCR met een detectielimiet van ongeveer 25 kopieën per reactie. Dit rapport beschrijft de bereiding van het reactiemengsel middels gevriesdroogde reagentia en visualisatie van resultaten via Hydroxynaftolblauw blauw (HNB) of een UV-lamp met fluorescerende intercalerende kleurstof in het reactiemengsel. De LAMP reagentia waren lyophilized en bewaard bij kamertemperatuur (KT) gedurende één maand zonder verlies van detectiegevoeligheid. Dit LAMP test is bijzonder robuust omdat het reactiemengsel preparaat geen complexe stappen omvatten. Deze methode is ideaal voor gebruik in beperkte middelen waar de Q-koorts endemisch is.
Inleiding
De kleine Gram-negatieve bacterie Coxiella burnetii is de verwekker van Q-koorts, die wereldwijd zoönose. Als gevolg van de wereldwijde distributie Q-koorts en de hoge infectiviteit van C. burnetii, de VS militair en civiel personeel in het buitenland ingezet lopen het risico van besmetting in de endemische gebieden.
Q-koorts manifesteert zich in twee vormen: acute en chronische infecties. Acute Q-koorts presenteert zich met griepachtige symptomen, hepatitis, of longontsteking, en is meestal een self-limiting ziekte met een lage sterfte. Chronische Q-koorts, terwijl minder gangbaar, resulteert vaak in endocarditis, die e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereid Plasmid DNA verdunningen als norm voor LAMP Reaction
- Gebruik een spectrofotometer om de optische dichtheid (OD) gemeten bij 260 nm aan het plasmide (bevattende doelwitgen IS1111a van C. burnetii RSA 493) DNA-concentratie te bepalen. Een OD 260 van 1 gelijk aan 50 ug / ul DNA.
- Zetten de hoeveelheid plasmide DNA in het kopieaantal. Aangezien de grootte van het plasmide 6330 bp, het molecuulgewicht van dit plasmide is 4,1 x 10 6 g (6330 bp x 649 g / bp). De DNA-concentratie van het plasmide 34,2 ng / pl (zoals bepaald uit stap 1.1). 1 pl van deze DNA-monster bevat 34,2 ng plasmide-DNA, hetgeen neerko....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het gevriesdroogde LAMP reagentia in de 0,2 ml buisje bevat Bst DNA polymerase, primers en dNTP's. 20 ui buffer reconstitutie wordt gebruikt om resuspendeer de gevriesdroogde reagentia. Figuur 1 toont de resultaten LAMP reactie op agarosegels met vers bereide reagentia en reagentia gevriesdroogd. Het gevriesdroogde reagens heeft geen activiteit te verminderen. LAMP reacties bereid door beide reagentia kan 25 kopieën van DNA-matrijs. Figuur 2.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Eerder hebben we een gevoelige en specifieke test gericht op de LAMP inbrengorgaan IS1111a 14. De IS1111 element werd gekozen omdat het sterk geconserveerd onder de verschillende stammen van C. burnetii en het hoge aantal kopieën (7-110) in de bacteriën (Klee 2006). Onze resultaten toonden dat LAMP ongeveer 25 kopieën van IS1111 element, die correleren met slechts een chromosomale kopie van Coxiella DNA kan detecteren. In deze studie, Bst DNA polymerase, L.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gesteund door het Naval Medical Research Center, onderzoek werkeenheid 6000.RAD1.J.A0310. De standpunten in dit artikel zijn die van de auteurs en geven niet noodzakelijkerwijs het officiële beleid of de positie van het Ministerie van de Marine, Ministerie van Defensie, of de Amerikaanse regering. Wei-Mei Ching is een werknemer van de Amerikaanse overheid. Dit werk werd opgesteld in het kader van haar officiële taken. Titel 17 USC §105 bepaalt dat "bescherming van het auteursrecht in het kader van deze titel is niet beschikbaar voor een werk van de Amerikaanse regering." Titel 17 USC §101 definieert een Amerikaanse regering werk als werk bereid doo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, zout vrij | Door klant ontworpen sequentie |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 eenheden/ml |
| 10x Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP-mengsel | New England Biolabs | N0447L | 10 mM elk |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10x Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel-laadbuffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10.000x, visualiseer producten in buizen |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10.000x, visualiseer producten in gels |
| Gelyofiliseerd reagens | Gene Reach | ||
| Hydroxynaftol blauw | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant buisscanner | Qiagen | real-time detectie |
Referenties
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
