Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Summary

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Abstract

Retrovirussen vertonen handtekening integratie voorkeuren op zowel de lokale en wereldwijde schaal. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor (1) genereren van diverse bibliotheken van retrovirale integratieplaatsen middels ligatie-gemedieerde PCR (LM-PCR) amplificatie en de volgende generatie sequencing (NGS), (2) kaart brengen van de genomische locatie van elk virus gastheer junction behulp BEDTools, en (3) het analyseren van de gegevens voor statistische relevantie. Genomisch DNA geëxtraheerd uit geïnfecteerde cellen is gefragmenteerd door digestie met restrictie-enzymen of door sonicatie. Na geschikte DNA end-reparatie, zijn double-stranded linkers geligeerd op de DNA-uiteinden en semi-nested PCR wordt uitgevoerd met primers die complementair zijn aan zowel de lange terminale herhaling (LTR) uiteinde van het virus en de geligeerde linker DNA. De PCR primers dragen sequenties die vereist zijn voor DNA-clustering in NGS, teniet de behoefte aan apart adapter ligatie. Kwaliteitscontrole (QC) is uitgevoerd om DNA-fragment grootteverdeling evalueren en aanpassener DNA opname voorafgaand aan de NGS. Sequence output bestanden worden gefilterd voor LTR-bevattende leest, en de sequenties definiëren van de LTR en de linker zijn weg afgesneden. Bijgesneden gastheercel sequenties worden toegewezen aan een referentie genoom behulp BLAT en gefilterd voor minimaal 97% identiteit met een unieke plaats in de referentie genoom. Unieke integratieplaatsen worden onderzocht voor aangrenzende nucleotide (nt) sequentie en distributie ten opzichte van verschillende genomische functies. Met dit protocol, kan integratieplaats bibliotheken met hoge complexiteit worden geconstrueerd uit genomisch DNA in drie dagen. De gehele protocol dat exogene virale infectie van gevoelige weefselkweek cellen integratieplaats analyse omvat kan derhalve worden uitgevoerd bij ongeveer 1-2 weken. Recente toepassingen van deze technologie hebben betrekking op longitudinale analyse van de integratie sites uit HIV-geïnfecteerde patiënten.

Introduction

Integratie van viraal DNA (vDNA) in het gastheergenoom is een essentiële stap in de virale levenscyclus. Integratie wordt bereikt door het virale enzym integrase (IN), die zich bezighoudt met twee verschillende katalytische processen die leiden tot de oprichting van een stabiel ingebracht provirus ^1. IN subeenheden aangrijpen op de uiteinden van de lineaire vDNA dat wordt gegenereerd door middel van reverse transcriptie, die de hogere orde intasome met vDNA uiteinden samengehouden door een IN multimeer ^2-4. IN splitst de 3 'einden van het vDNA stroomafwaarts van invariante 5'-CA-3' sequenties in een proces dat 3'-verwerking, het ....

Protocol

1. Genereer Virus Stocks

Opmerking: Een stroomschema van de wet bench aspect van dit protocol is in Figuur 1 De gegevens van virusvoorraad productie en daaropvolgende infectie van weefselcultuur cellen algemeen voor verschillende retrovirussen.. Voor sommige experimenten, kan de doelcel niet de endogene virale receptor (en) tot expressie, en in dergelijke gevallen de constructie van pseudo-getypeerde retrovirale deeltjes herbergen heterologe virale envelop glycoproteïne, bijvoorbeeld het glycoproteïne G van vesiculair stomatitis virus (VSV-G), wordt vereist voor infectie ^44,45.

Results

Tabel 4 vermeldt de resultaten van een representatief experiment om de gevoeligheid van NGS illustreren voor het terugwinnen integratieplaatsen uit een kweek van geïnfecteerde cellen. Geïnfecteerde cellulaire DNA werd gebruikt om serieel verdunde genomisch DNA van een infectie waarin elke cel gemiddeld staand een integratie ^40. Verdunningen werden bereid in stappen van vijf tot een maximale verdunning van 1: 15.625. Genomisch DNA in het titratiereeks Vervolgen.......

Discussion

Een protocol voor de analyse van retrovirale integratieplaatsen, de initiële virusinfectie stap door de omschrijving van genomische verspreidingspatronen wordt beschreven. Dit protocol is toepasbaar op elk retrovirus geïnfecteerd en elk celtype. Bovendien is de assay pijpleiding is zeer gevoelig, met de potentie om een bevredigend aantal unieke integratieplaatsen van seriële verdunningen van genomisch DNA overeenkomt herstellen tot die van een infectie gestart met een MOI van 6,4 x 10 ^-5. Deze gevoeligheid ma.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	11965-084	Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH 30088.03	Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-Cl	Antibiotics to be added to DMEM
Phosphate-Buffered saline	Mediatech	21-040-CV	Used to wash cells
Trypsin EDTA	Corning	25-053-CI	Used to detach adherent cells from tissue culture plates
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688	DNA transfection reagent
0.45 µm Filters	Thermo Scientific	09-740-35B	Used to filter virus particle-containing cell culture media
Turbo DNase	Ambion	AM2239	Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks
HIV-1 p24 Antigen Capture Assay	ABL Inc.	5447	Used to quantify yield of virus production
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506	Used to purify genomic DNA from cells
Sonicator	Covaris	S2	With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec
Nuclease-Free Water	GeneMate	G-3250-125	Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination
QIAQuick PCR Purification Kit	Qiagen	28106	Used to purify DNA during library construction
End-It DNA End-Repair Kit	Epicentre	ER81050	Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples
Klenow Fragment (3'-5' exo–)	New England Biolabs (NEB)	M0212S	Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments
dATP	Thermo Scientific	R0141	Deoxyadenosine triphosphate
MseI	NEB	R0525L	Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage
BglII	NEB	R0144L	Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence
T4 DNA Ligase	NEB	M0202L/6218	Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends
DNA Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	custom	Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs <30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs
Advantage 2 Polymerase Mix	Clontech	639202	Commercial mix containing DNA polymerase for PCR
dNTPs (100 mM solutions)	Thermo Scientific	R0181	Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Spectrophotometer for determination of DNA concentration
Qubit Fluorimeter	Life Technologies	Qubit® 3.0	Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration
2200 TapeStation System	Agilent	G2964AA	Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution
MiSeq	Illumina	SY-410-1003	Used for NGS