High-throughput CRISPR Vector Constructie en karakterisering van DNA Wijzigingen van Generation van Tomato Hairy Roots

Summary

Met behulp van DNA assembly kunnen meerdere CRISPR vectoren parallel worden geconstrueerd in een enkele klonen reactie, waardoor de bouw van grote aantallen vectoren CRISPR een eenvoudige taak. Tomaat harige wortels zijn een uitstekend model systeem om CRISPR vectoren te valideren en het genereren van mutant materialen.

Abstract

Doelgerichte DNA-mutaties gegenereerd door vectoren met clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technologie zijn nuttig gebleken voor functionele genoomstudies. Hoewel de meeste kloneringsstrategieën eenvoudig uit te voeren zijn, gebruiken ze over het algemeen meerdere stappen en kunnen ze meerdere dagen nodig hebben om de uiteindelijke constructen te genereren. De hier gepresenteerde methode is gebaseerd op DNA-assemblage en kan volledig functionele CRISPR-vectoren produceren in een enkele kloneringsreactie. Vectorconstructie kan ook worden gepoold, wat de efficiëntie en het nut van het proces verder verhoogt. Een aanpassing van de methode wordt gebruikt om CRISPR-vectoren met meerdere gendoelen te maken. CRISPR-vectoren worden vervolgens getransformeerd in harige tomatenwortels om transgene materialen met doelgerichte DNA-modificaties te genereren. Harige wortels zijn een nuttig systeem voor het testen van vectorfunctionaliteit omdat ze technisch eenvoudig te genereren zijn en geschikt voor grootschalige productie. De hier gepresenteerde methoden zullen een brede toepassing hebben, omdat ze kunnen worden gebruikt om een verscheidenheid aan CRISPR-vectoren te genereren en kunnen worden toegepast in een breed scala van plantensoorten.

Introduction

De mogelijkheid om gerichte DNA wijzigingen met CRISPR genereren / Cas9 heeft een groot potentieel voor functionele genomica studies. Er zijn twee onderdelen van het CRISPR / Cas9 systeem; de Cas9 nuclease afgeleid van Staphylococcus pyogenes en een ongeveer 100-nt guide RNA (gRNA) molecuul dat Cas9 doorstuurt naar de target DNA site (s) ^1. Beeldherkenning wordt verleend door de eerste ~ 20-nt van het gRNA, die zorgt voor high-throughput productie van richtende vectoren ^2,3. De meeste organismen die kunnen worden gemanipuleerd, reeds CRISPR / Cas9 technologie ^4,5 hebben.

In planten, constitutieve promoters, zoals de CaMV 35S promotor, worden vaak gebruikt om de expressie van de Cas9 nuclease ⁶ rijden. De gRNAs worden uitgedrukt in het RNA-polymerase III U6 en U3 promotors die de eerste base van het gRNA beperkt tot hetzij een G voor U6 of A U3, voor efficiënte transcriptie. Maar RNA-polymerase II promoters, die vrij zijn van deze beperkingen zijn, zijn ook gebruikt ^7,8.

Verschillende gRNAs induceren DNA-mutaties met verschillende rendementen, en dus kan het belangrijk zijn om eerst te valideren CRISPR geblokkeerd voordat investeren in hele plant transformaties of het opzetten van een uitgebreide fenotypische schermen. Tijdelijke expressie van CRISPR constructen in planten, met agroinfiltration bijvoorbeeld algemeen in een lagere frequentie van DNA modificatie vergeleken met stabiele planten ^6, wat detectie van mutaties en fenotypische testen moeilijk onpraktisch met dergelijke benaderingen. Zogenaamde haarwortels is een handig, alternatief systeem aangezien een groot aantal onafhankelijke stabiel getransformeerde materialen binnen weken kan worden gegenereerd, in plaats van maanden stabiele planten. CRISPR vectoren zijn zeer effectief in het induceren van mutaties in DNA haarwortels ^9,10.

DNA assemblagemethoden efficiënt ligeren DNA-fragmenten die overlapping ¹¹ eindigt. Een belangrijk voordeel van een aantal DNA montagemethoden is de mogelijkheid om ssDNA (dwz oligo) nemen in de samengestelde producten. Aangezien gRNAs slechts ~ 20-nt lange en nieuwe doelen kunnen worden gesynthetiseerd met oligo deze DNA montagemethoden zijn geschikt voor CRISPR klonen. De hier beschreven protocollen zijn gebaseerd op de P201 serie CRISPR vectoren die met succes is toegepast in sojabonen ^{10, 12} en populier nu tomaat. De kloneringswerkwijze gepresenteerd biedt verscheidene voordelen boven de huidige werkwijze ¹⁰ klonen. Namelijk, kan volledig functionele vectoren in één klonen reactie in een enkele dag worden gegenereerd. Vector constructie kan ook worden samengevoegd om meerdere CRISPR vectoren parallel genereren, hands-on tijd en materiële kosten verder te verlagen. Ook presenteren een protocol voor het genereren van tomaat haarwortels een efficiënte methode om transgene materialen doelgen deleties te produceren. Harige wortels worden gebruikt om geldigeat de CRISPR vectoren en voorzien materiaal voor verdere experimenten.

Protocol

1. Guide RNA Ontwerp en Vector Construction

1. Identificeer doelwitsequenties voor de genen van belang. Er zijn diverse online CRISPR doelsoorten vinden programma's die geschikt zijn voor deze stap ^13,14.
   LET OP: Hier gebruiken we de GN ₂₀ GG doel motief, maar ook andere ontwerpen kunnen geschikt zijn, afhankelijk van de toepassing of vector systeem dat wordt gebruikt.
2. Ontwerp 60-meer oligo gRNA de GN ₁₉ gedeelte van de doelwitmotieven geflankeerd door 5 'en 3' 20 nt-sequenties die nodig zijn voor DNA opstelling aan. De uiteindelijke 60-mer motief is: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN ₁₉ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
   OPMERKING: Standaard, ontzout primers werken prima.
3. Bereid de vier DNA's voor de montage (figuur 1). Zie aanvullende bestand voor DNA-sequenties.
   1. Digest 1-5 ug p201N: Cas9 ¹⁰ plasmide met het restrictie-enzym SpeI in 1x Buffer 4 bij 37 ° C gedurende 2 uur. Column-zuiveren het verteren eenolgens instructies van de fabrikant. Resuspendeer in ~ 15 ui 10 mM Tris-HCl en kwantificeren door UV spectrofotometrie.
   2. Voer een tweede digest met het restrictie-enzym SwaI in 1x buffer 3,1 bij 25 ° C gedurende 2 uur. Raadpleeg 100-200 ng op een 0,8% agarosegel om volledige digestie bevestigen.
      LET OP: Een correct verteerd plasmide zal een enkele band hebben op 14.313 bp. Noot: Hitte inactivatie van het enzym en defosforylatie zijn niet vereist. Het gedigesteerde plasmide kan worden bewaard bij -20 ° C.
   3. PCR versterken de Medicago truncatula (Mt) U6 promotor en steiger DNA's uit de pUC gRNA Shuttle ¹⁰ plasmide met behulp van de primers Swa I_MtU6F / MtU6R en ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR, respectievelijk. Gebruik een high-fidelity polymerase met de PCR-condities: 95 ° C gedurende 3 min; 31 cycli (98 ° C gedurende 20 seconden, 60 ° C gedurende 15 sec, 72 ° C gedurende 30 sec); en 72 ° C gedurende 5 minuten.
      1. Visualiseer ~ 3 ui porties van PCR producten op een 1% agarosegel om amplificatie te bevestigen. De MtU6 amplicon is 377 bp en het schavot amplicon is 106 bp. Kolom zuiveren resterende PCR producten volgens de voorschriften, gekwantificeerd door UV-spectrofotometrie en bewaar bij -20 ° C.
   4. Resuspendeer de hele tube gRNA oligo tot 100 urn in het laboratorium-grade water. Voeg 1 pl 100 pM oligo aan 500 pl 1x Buffer 2,1. Goed mengen. Als pooling meerdere oligos, voeg 1 pl van elk 100 uM oligo het 1x Buffer 2,1 tube. Verdunde oligo's kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
4. Programmeer een thermocycler te houden bij 50 ° C, onder toepassing van een verwarmde deksel. Combineer 100 ng (0,011 pmol) gelineariseerd vector, 50 ng (0,2 pmol) van MtU6 promoter, 12 ng (0,2 pmol) van steiger, 1 gl (0,2 pmol) verdund gRNA oligo (s) en water tot een volume van 5 pl. Voeg 5 ul van 2x high-fidelity DNA assemblage master mix, meng goed en spin down. Incubeer reactie gedurende 60 min in50 ° C PCR-apparaat. Plaats vervolgens de reactie op het ijs.
   Opmerking: Reactie volumes kan worden verhoogd tot lage DNA opbrengsten tegemoet te komen.
5. Transformatie 2 ul van het reactiemengsel in competente E. coli-cellen met behulp van standaardtechnieken en plaat op LB aangevuld met 50 mg L ^-1 kanamycine (Kan _50). Kweek-cellen uitgeplaat bij 37 ° C overnacht. Sla de resterende DNA assemblage reactie bij -20 ° C.
6. Kolonie scherm door middel van PCR met behulp van de primers StUbi3P218R en ISceIR. Verdun een aliquot van het overgebleven DNA samenstel reactie met water 1: 5. Gebruik 1 pl als een positieve controle voor de kolonie scherm en 1 ng van circulaire p201N: Cas9 plasmide als een no-insert controle.
   1. PCR versterken met de voorwaarden; 95 ° C gedurende 3 min; 31 cycli (95 ° C gedurende 30 sec, 58 ° C gedurende 30 sec, 72 ° C gedurende 30 sec); en bij 72 ° C gedurende 5 minuten. Visualiseren PCR producten op een 1% agarosegel. Zorg ervoor dat de juiste inserties hebben een band bij 725 bp en vectoren without inzetstukken (bijvoorbeeld ongesneden vector) zal een 310-bp band hebben.
7. Positieve kolonies groeien in LB-Kan ₅₀ vloeibare kweken overnacht bij 37 ° C en zuiveren plasmiden volgens de instructies van de fabrikant. Sanger reeks plasmiden met de StUbi3P218R primer en lijn chromatogrammen aan de MtU6 promotor, doel, en steiger sequenties om ervoor te zorgen tijdens het klonen werden geen fouten geïntroduceerd.
8. Voer een diagnostische verteren door het verteren van ~ 1 ug plasmide met Eco RV en Sty I. Visualiseren op een 0,8% agarosegel. Fragmenten (in bp) zijn: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318 en 174.
9. Gebruik DNA assemblage te construeren met meerdere gRNAs.
   1. Een vector met twee cassettes gRNA construeren, PCR amplificeren van de eerste positie gRNA de primers Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR en de tweede positie gRNA de primers UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR van 1 ng van elk van de respectieveplasmiden geconstrueerd stappen 1,1-1,8. Met de PCR-omstandigheden in stap 1.3.3. Visualiseren ~ 3 gl aliquots van de PCR producten op een 1% agarosegel om amplificatie te bevestigen. Amplicons zijn ~ 500 bp.
   2. Combineer en meng ongeveer gelijke hoeveelheden un gezuiverde PCR producten in een 200 pl buis (gewoonlijk 3-4 pl elk). Voor de montage, voeg 1 pl gecombineerd PCR-producten, 50 ng van Swa I en Spe I gelineariseerd p201N: Cas9, laboratorium-grade water tot 2,5 pi en 2,5 pi van 2x high-fidelity DNA assemblage master mix. Incubeer in een 50 ° C thermische cycler gedurende 15 min.
      Opmerking: De DNA opbouwinstructies beveelt een 15 min incubatie gedurende 2 - 3 fragmenten.
   3. Transformeer 1-2 pi in competente E. coli-cellen en plaat op LB Kan _50. Kweek cellen uitgeplaat bij 37 ° C overnacht. Sla de resterende reactie bij -20 ° C.
   4. Kolonie scherm door middel van PCR met primers StUbi3P218R en ISceIR met dezelfde voorwaarden als stap 1.6. correct cLones zal een 1200 bp amplicon hebben. Groeien positieve kolonies in LB Kan ₅₀ vloeibare kweken 's nachts en te zuiveren plasmiden.
   5. Sanger reeks plasmiden met de primers StUbi3P218R (beslaat de eerste positie gRNA) en p201R (dekt tweede positie gRNA). Lijn chromatogrammen aan de MtU6 promotor, doel, en steiger sequenties. Diagnostische verteren met EcoRV en Styl zal resulteren in de volgende fragmenten (in bp): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. Vetgedrukte fragment bevat de tweede gRNA.
10. Na een ontmoeting met alle kwaliteitscontrole verwachtingen van het transformeren plasmiden in Agrobacterium rhizogenes stam ARqua1 ^15. Voeg 1 pl van het plasmide prep tot 50 pi elektrocompetente cellen en electroporate in een 1 mm cuvette met instellingen: 2,4 kV, 25 uF en 200 Ω. Herstel cellen in ~ 500 pi SOC en schud bij 28 ° C gedurende 2 uur. Plaat op LB Kan ₅₀ en grij bij 28 ° C gedurende 2 dagen. Voer kolonie scherm met behulp van dezelfde primers en PCR-omstandigheden als 1.3.3. Maak glycerol voorraden van positieve klonen.

2. Hairy Root Transformation

1. Steriliseren tomatenzaad in 20% bleekmiddel voor 15 minuten onder constant mengen. In een laminaire stroming kap, verwijder het bleekmiddel en wassen in steriel laboratorium-grade water 3 keer.
2. Plate 30 zaden in een GA-7 doos met ½ MS media (2,22 g L ^-1 MS-zouten + Gamborg vitaminen, 10 g L ^-1 sucrose, 3 g L ^-1 gellangom, pH 5,8). Kiemen voor ~ 2 dagen in het donker, ga dan GA-7 dozen aan het licht. Groei zaailingen voor ~ 4 dagen in het licht.
3. De dag voor de transformatie, streak uit A. rhizogenes kweken op vaste LB Kan ₅₀ en groeien bij 28 ° C overnacht.
4. Dag van de transformatie, in de laminaire stroming kap monteren steriele materialen: 12 ml cultuur buizen, 50 ml conische buis, ½ MS vloeistof (geen gellan gum), 200 uM acetosyringoon, filterpapier, petrischaaltjes, pincet en scalpel, pipetten en pipetpunten. Voeg 25 ul van acetosyringoon 50 ml ½ MS en giet ~ 6 ml in elk kweekbuis.
5. Gebruik een gebogen 200 ul tip om A. te schrapen rhizogenes cellen van de plaat en resuspendeer in 6 ml ½ MS vloeistof. Vortex de buis volledig resuspendeer de cellen. Na resuspenderen van cellen van elke vector, meet de optische dichtheid (OD) van 1 ml cellen bij een vaste golflengte van 600 nM. Zorgen OD tussen 0,2 en 0,4; verdunnen of voeg meer cellen als dat nodig is. Herhaal dit voor elk construct.
6. Voeg ~ 2 ml ½ MS vloeistof naar een petrischaal met een steriel filtreerpapier. Accijnzen zaadlobben van de zaailingen en plaats op het bevochtigde filterpapier. Zodra alle zaadlobben zijn verzameld, snijd de distale ~ 1 cm af van de zaadlobben, wat resulteert in zaadlob stukken met twee afgesneden einden. Explantaten toevoegen aan A. rhizogenes oplossingen, meng en incubeer gedurende 20 minmet af en toe omkeren.
   Opmerking: Ongeveer 12 explantaten per construct worden routinematig gebruikt, maar liefst 80 explantaten werden geïnoculeerd in 6 ml A. rhizogenes oplossing.
7. Tijdens de A. rhizogenes incubatie, voeg filter papier petrischaaltjes, één per construct getransformeerd. Ook ½ MS vast medium, geen antibiotica, in de laminaire stroming kap drogen.
8. Schep zaadlobben uit A. rhizogenes oplossing met een steriel pincet en leg ze op een droge filter papier. Dek af met Petri deksel om ervoor te zorgen weefsels niet uitdrogen, terwijl u doorgaat naar de volgende transformatie. Blot zaadlobben op het filter papier en de overdracht, abaxiale kant naar boven, naar MS media ½. Wikkel platen met chirurgische tape en co-kweken in het donker bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen.
9. Na co-kweek, overdracht zaadlobben, abaxiale kant naar boven, tot ½ MS medium aangevuld met 300 mg L ^-1 ticarcilline / clavulaanzuur (Tim _300, om de groei van residu voorkomenUAL A. rhizogenes) en Kan ₅₀ (voor de plantaardige selection) en wikkel met chirurgische tape. Handhaaf culturen onder tl-verlichting bij kamertemperatuur met een 16-uur fotoperiode.
10. Na ~ 1,5-2 weken wortels ten minste 2 cm lang zijn uitgesneden uit de zaadlobben met steriele pincet en een scalpel en overgebracht naar MS Kan ₅₀ Tim ₃₀₀ media ½. Transfer 10-15 wortels tot een enkele plaat. Markeer de positie van de wortel tips met een marker, wrap met chirurgische tape, en onderhouden in cultuur kamer.
11. Na één week, worden omgezet wortels zien groeien op de selectieve media. Oogst een subgroep van getransformeerde wortels voor DNA-extractie met behulp van de gewenste DNA-extractie methode. Noot: Platen met zaadlobben worden gedurende 2-3 wekelijks oogsten, waarna punt de wortels groeien tot een wirwar en moeilijk te isoleren. Niet geoogste wortel weefsels kan onbeperkt worden gehandhaafd. Verschillende testen kunnen worden uitgevoerd op de geïsoleerde DNA-monsters DNA mutatiefrequentie en -type te bepalen. Resultaten van een paar van zulke assays worden hieronder beschreven.

Results

CRISPR vectorconstructie met DNA samenstel genereert doorgaans tientallen tot honderden onafhankelijke klonen. Kolonie screening door PCR identificeert eenvoudig juiste klonen en kunnen onderscheiden plasmiden met en zonder inzetstukken (Figuur 2A) dat bruikbaar is voor het oplossen van problemen. Typisch, alle van de klonen bevatten een insert en een gebruiker kan kiezen om de kolonie screeningsstappen helemaal overslaan. Diagnostic verteert (Figuur 2B)...

Discussion

Aangezien DNA-assemblage wordt gebruikt om elkaar overlappende DNA-sequenties te recombineren, kan deze kloneringmethode worden toegepast op elke CRISPR vectorconstructie. De meeste CRISPR-kloneringsschema's gebruiken het genereren van genen van de gRNA, type IIS restrictie-enzymen^17,18 of overlap-extensie PCR¹⁹. Elke van deze technieken heeft inherente voordelen en nadelen, maar ze vereisen doorgaans meerdere praktische kloneringstappen. Het belangrijkste voordeel van de hier gepresenteerde kloneri...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix)	New England Biolabs	E5520
p201N:Cas9	Addgene	59175	Het p201H:Cas9 plasmid (59176) is ook compatibel met de gerapporteerde overlaps en enzymen.
pUC gRNA Shuttle	Addgene	47024
SwaI	New England Biolabs	R0604S
SpeI	New England Biolabs	R0133S
Zymo clean and concentrator-5 column purification	Zymo Research	D4003
NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B7202S
NEB CutSmart (Buffer 4)	New England Biolabs	B7204S
NEB Buffer 3.1	New England Biolabs	B7203S
EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep)	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF®	New England Biolabs	R3195S
StyI-HF®	New England Biolabs	R3500S
MS Salts + Gamborg Vitamins	Phytotechnology Laboratories	M404
Phytagel™ (gellan gum)	Sigma Aldrich	P8169
GA-7 Boxes	Sigma Aldrich	V8505
Micropore™ surgical tape	3M	1535-0
Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid)	Various	0029-6571-26
Primers 5' → 3'
SwaI_MtU6F	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
ScaffoldF	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG	Kan niet worden gebruikt voor Sanger-sequencing omdat er een tweede bindingsplaats op het plasmide is
UNS1_Scaffold R	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R	CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
Vetgedrukte sequenties duiden op 20-nt overlaps met gelinieriseerd p201N:Cas9.