Met behulp van DNA assembly kunnen meerdere CRISPR vectoren parallel worden geconstrueerd in een enkele klonen reactie, waardoor de bouw van grote aantallen vectoren CRISPR een eenvoudige taak. Tomaat harige wortels zijn een uitstekend model systeem om CRISPR vectoren te valideren en het genereren van mutant materialen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
High-throughput CRISPR Vector Constructie en karakterisering van DNA Wijzigingen van Generation van Tomato Hairy Roots
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Doelgerichte DNA-mutaties gegenereerd door vectoren met clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technologie zijn nuttig gebleken voor functionele genoomstudies. Hoewel de meeste kloneringsstrategieën eenvoudig uit te voeren zijn, gebruiken ze over het algemeen meerdere stappen en kunnen ze meerdere dagen nodig hebben om de uiteindelijke constructen te genereren. De hier gepresenteerde methode is gebaseerd op DNA-assemblage en kan volledig functionele CRISPR-vectoren produceren in een enkele kloneringsreactie. Vectorconstructie kan ook worden gepoold, wat de efficiëntie en het nut van het proces verder verhoogt. Een aanpassing van de methode wordt gebruikt om CRISPR-vectoren met meerdere gendoelen te maken. CRISPR-vectoren worden vervolgens getransformeerd in harige tomatenwortels om transgene materialen met doelgerichte DNA-modificaties te genereren. Harige wortels zijn een nuttig systeem voor het testen van vectorfunctionaliteit omdat ze technisch eenvoudig te genereren zijn en geschikt voor grootschalige productie. De hier gepresenteerde methoden zullen een brede toepassing hebben, omdat ze kunnen worden gebruikt om een verscheidenheid aan CRISPR-vectoren te genereren en kunnen worden toegepast in een breed scala van plantensoorten.
Inleiding
De mogelijkheid om gerichte DNA wijzigingen met CRISPR genereren / Cas9 heeft een groot potentieel voor functionele genomica studies. Er zijn twee onderdelen van het CRISPR / Cas9 systeem; de Cas9 nuclease afgeleid van Staphylococcus pyogenes en een ongeveer 100-nt guide RNA (gRNA) molecuul dat Cas9 doorstuurt naar de target DNA site (s) 1. Beeldherkenning wordt verleend door de eerste ~ 20-nt van het gRNA, die zorgt voor high-throughput productie van richtende vectoren 2,3. De meeste organismen die kunnen worden gemanipuleerd, reeds CRISPR / Cas9 technologie 4,5 hebben.
In planten, constitutieve ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Guide RNA Ontwerp en Vector Construction
- Identificeer doelwitsequenties voor de genen van belang. Er zijn diverse online CRISPR doelsoorten vinden programma's die geschikt zijn voor deze stap 13,14.
LET OP: Hier gebruiken we de GN 20 GG doel motief, maar ook andere ontwerpen kunnen geschikt zijn, afhankelijk van de toepassing of vector systeem dat wordt gebruikt. - Ontwerp 60-meer oligo gRNA de GN 19 gedeelte van de doelwitmotieven geflankeerd door 5 'en 3' 20 nt-sequenties die nodig zijn voor DNA opstelling aan. De uiteindelijke 60-mer motief is: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -G....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
CRISPR vectorconstructie met DNA samenstel genereert doorgaans tientallen tot honderden onafhankelijke klonen. Kolonie screening door PCR identificeert eenvoudig juiste klonen en kunnen onderscheiden plasmiden met en zonder inzetstukken (Figuur 2A) dat bruikbaar is voor het oplossen van problemen. Typisch, alle van de klonen bevatten een insert en een gebruiker kan kiezen om de kolonie screeningsstappen helemaal overslaan. Diagnostic verteert (Figuur 2B).......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Aangezien DNA-assemblage wordt gebruikt om elkaar overlappende DNA-sequenties te recombineren, kan deze kloneringmethode worden toegepast op elke CRISPR vectorconstructie. De meeste CRISPR-kloneringsschema's gebruiken het genereren van genen van de gRNA, type IIS restrictie-enzymen17,18 of overlap-extensie PCR19. Elke van deze technieken heeft inherente voordelen en nadelen, maar ze vereisen doorgaans meerdere praktische kloneringstappen. Het belangrijkste voordeel van de hier gepresenteerde kloneri.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gesteund door de National Science Foundation subsidie IOS-1025642 (GBM). Wij danken Maria Harrison voor het verstrekken van de ARqua1 stam.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | Het p201H:Cas9 plasmid (59176) is ook compatibel met de gerapporteerde overlaps en enzymen. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' → 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG | ||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG | ||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT | ||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT | ||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG | Kan niet worden gebruikt voor Sanger-sequencing omdat er een tweede bindingsplaats op het plasmide is | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Vetgedrukte sequenties duiden op 20-nt overlaps met gelinieriseerd p201N:Cas9. |
Referenties
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
