Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Functionele Complementatie Analysis (FCA): A Laboratory Oefening ontworpen en geïmplementeerd om het onderwijs in Biochemical Pathways Supplement

17.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53850

⸱

24 juni 2016

 ,  , 
1Thomas H. Gosnell School of Life Sciences, Rochester Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

De validatie van de enzymatische activiteiten die betrokken zijn bij biochemische pathways kunnen worden toegelicht met behulp van functionele complementatie analyse (FCA). In dit manuscript het FCA assay waaruit de enzymatische activiteit van enzymen betrokken bij het metabolisme van aminozuren, bacteriële stringente respons en bacteriële peptidoglycaan biosynthese.

Samenvatting

Functionele complementatie bepaling (FCA) een in vivo analyse die op grote schaal wordt gebruikt om de functie / rol van genen / enzymen helderen. Deze techniek is heel gebruikelijk in de biochemie, genetica en vele andere disciplines. Een uitgebreid overzicht van de techniek om de leer van biochemische routes met betrekking tot zuren, peptidoglycaan en de bacteriële strenge reactie wordt beschreven in dit manuscript aminozuren aan te vullen. Twee cDNA's van de modelplant Arabidopsis thaliana die betrokken zijn bij het ​​metabolisme van lysine (L, L-diaminopimelinezuur aminotransferase (dapL) en tyrosine aminotransferase (tyrB) betrokken bij het ​​metabolisme van tyrosine en fenylalanine zijn gemarkeerd. Daarnaast is de bacteriële peptidoglycaan anabolische route gemarkeerd door de analyse van de UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamaat -2,6 meso-diaminopimelinezuur ligase (Muré) gen uit het bacterie Verrucomicrobium spinosum betrokken bij het ​​kruis-linking van peptidoglycan. De bacteriële stringente respons wordt eveneens opgenomen in de analyse van de rsh (r ElA / s pot h omolog) bifunctionele gen betrokken bij een hyper-mucoïde fenotype van de bacterie Novosphingobium sp. Vier voorbeelden van FCA worden gepresenteerd. De video zal zich richten op drie van hen, namelijk lysine, peptidoglycaan en de strenge reactie.

Inleiding

Functionele complementatie in de context van het ophelderen van de functie (s) / functie (s) van een gen wordt gedefinieerd als het vermogen van een bepaalde homoloog of ortholoog gen een bepaalde mutant renovatie met een waarneembaar fenotype met het wild-type toestand wanneer de homologe of orthologe gen wordt ingebracht in cis- of trans in het mutante achtergrond. Deze techniek wordt algemeen gebruikt voor het isoleren en de functie (s) / functie (s) van vele genen. Een specifiek voorbeeld is de isolatie en identificatie van orotidine-5-fosfaat decarboxylase van Candida albicans met de ura3 mutant van S. cerevisiae en pyrF mutant van E. coli. 1 De auteurs hebben deze techniek gebruikt om de functie van genen die betrokken zijn bij het ​​metabolisme van aminozuren, peptidoglycaan en de stringente respons in hun onderzoeksprogramma's en deze techniek hebben omgezet leerplannen B heldereniotechnology en Moleculair Biologische (BMB) programma aan het Rochester Institute of Technology (RIT).

De auteurs leren Fundamentals of Plant Biochemistry / Pathology (FPBP) (Hudson) en Bioseparations: Principles and Practices (BPP) (Hudson / Savka), twee bovenste divisie keuzevakken laboratorium op basis van cursussen in de BMB Program aan de RIT. Aangezien enkele van de onderwerpen die aan bod komen in de cursussen worden aangesloten bij hun onderzoek belangen zijn de auteurs veel van de technieken en experimentele instrumenten die gebruikt worden in hun onderzoeksprogramma's in deze twee-laboratorium op basis van cursussen opgenomen. Een voorbeeld is functionele complementatie als laboratorium oefening om de lezing materialen met betrekking tot zuurmetabolismeblokkers uit planten, peptidoglycaan en de stringente respons metabolisme van bacteriën amino versterken.

Drie van de aminozuur paden uit planten die worden beschreven in de FPBB Natuurlijk zijn die lysine (Lys), tyrosine(Tyr) en fenylalanine (phe). De lys route wordt gemarkeerd in de loop vanwege het belang van het aminozuur als een essentieel aminozuur voor alle dieren bijzonder mensen omdat de dieren missen de genetische machinerie te synthetiseren Lys de novo. Bovendien werd recent ontdekt dat planten gebruiken een route voor de synthese van lys die aanzienlijk verschilt van die van bacteriën. Deze ontdekking werd gedeeltelijk vergemakkelijkt door functionele complementatie van E. coli diaminopimelinezuur (dap) mutanten met een gen dat het enzym L, L-diaminopimelinezuur aminotransferase (DapL) codeert de modelplant Arabidopsis thaliana. 2 De variant wegen voor de synthese van lys door de tussenliggende diaminopimelinezuur zijn weergegeven in figuur 1. Naast de synthese van lys vergemakkelijkt door het aspartaat afgeleide familie van aminozuren die sterk gereguleerd. 3 Naast hun belang eiwitten Synthesis de routes voor Tyr en Phe zijn gemarkeerd gezien hun belang dienen als voorloperverbindingen voor het anabolisme van phenylpropanoid verbindingen omvatte de synthese van plantaardige afweerstoffen voorzien:. alkaloïden, ligninen, flavonoïden, isoflavonen, hydroxykaneelzuur oa 4 De tyr en phe trajecten worden ook gewezen op het verschil tussen de plant en bacteriële anabole pathways te tonen. In bacteriën wordt het enzym tyrosine aminotransferase (tyrB) betrokken bij het anabolisme van beide aminozuren, terwijl in planten, het enzym primair betrokken bij de afbraak van tyr phe en en niet betrokken bij het anabolisme van deze aminozuren. (Figuur 2). 4

De verschillen tussen Gram positieve en Gram negatieve bacteriën over de inrichting van peptidoglycaan (PG) zijn aangegeven in de FPBP loop. De PG van Gram negatieve bacteriën is van belang op plantenpathologie gebaseerd op het feit dat de meesteplantpathogenen zijn Gram-negatieve. Een recente beoordeling met betrekking tot de top 10 bacteriële fyto-pathogenen bleek dat alle zijn Gram-negatieve. De bacteriën werden uit de genera:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya en Pectobacterium 5 Een van de chemische verschillen bij vergelijking van de PG stam van Gram-negatieve en gram-positieve bacteriën is het verschil tussen de verknopende amino zuren van beide types. De eerste stap voor die verschillende verknoping van PG optreedt in de stap van het cytoplasmatische PG anabolisme en wordt vergemakkelijkt door het enzym UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamaat -2,6 meso-diaminopimelinezuur ligase (MURE) (Figuur 3A). Mure katalyseert de toevoeging van een bepaalde diamineverbinding ten derde positie van het peptide steel. 6 in de meeste Gram-negatieve bacteriën, de voorlaatste lys voorloper, meso -diaminopimelate ( m -DAP) dient als verknoping aminozuur en lys vervult dezelfde rol in de PG meeste gram-positieve bacteriën (Figuur 3B). 7 Dit komt door het feit dat zowel m -DAP lys en bezitten twee amine groepen kunnen vormen twee peptidebindingen voor peptide stam verknoping.

In de Bioseparations: Principles and Practices (BPP) Uiteraard zijn de verschillen tussen open en gesloten systemen voor de teelt van bacteriën en hoe nutriëntenniveaus aanzienlijk zal veranderen in beide systemen als gevolg van veranderingen in het milieu besproken. Deze gebeurtenissen zijn gekoppeld aan wijzigingen in de regelgeving een zogenaamde "terugschakelen" of "opschakelen" veroorzaakt door honger of een voldoende aanbod van aminozuren of energie. De "terugschakelen" reactie kan optreden als een bacteriële kweek wordt overgebracht van een rijk en complex medium om een ​​chemisch gedefinieerde medium met een enkele koolstofbron. Deze verandering in de omgeving leidt tot de snelle Cessatie van tRNA en rRNA synthese. Deze beëindiging leidt het gebrek aan ribosomen, eiwit- en DNA-synthese, hoewel de biosynthese van aminozuren opgereguleerd.

Naar aanleiding van de "terugschakelen" reactie, worden de bestaande ribosomen gebruikt om nieuwe enzymen produceren om de aminozuren niet meer beschikbaar in het medium of milieu te synthetiseren. Na een periode van tijd, rRNA synthese en nieuwe ribosomen worden geassembleerd en de populatie van bacteriële cellen begint te groeien, hoewel tegen een gereduceerd tarief. De gang van zaken wordt genoemd de "stringente respons" of "stringente controle" en is een voorbeeld van de wereldwijde cellulaire regulatie en kan worden gezien als een mechanisme voor het aanpassen van de cel biosynthetische machinerie ter compensatie van de beschikbaarheid van de vereiste substraten en energiebehoeften . 8 de strenge reactie stelt dus bacteriën om snel te reageren op fluxen van nutriënten in het milieu en draagt ​​en enhraten het vermogen van bacteriën om te concurreren in een omgeving die snel kunnen veranderen met betrekking tot voedings- en of substraat beschikbaarheid. 8-9

De stringente respons een integrale rol in genexpressie wanneer de beschikbaarheid van aminozuren, koolstof, stikstof, fosfaat en vetzuren beperkt. 8,10-14 Deze stringente respons wordt gecoördineerd door twee nucleotiden, guanosine tetrafosfaat (ppGpp) en guanosine pentaphosphate (pppGpp) meestal aangeduid samen als de alarmoon (p) ppGpp. Wanneer bijvoorbeeld aminozuren beperkte die kan leiden tot een knelpunt in de eiwitsynthese-alarmoon, guanosine 3,5- (bis) pyrofosfaat (ppGpp), afgeleid van anabolisme van guanosine 3-difosfaat 5-trifosfaat (pppGpp) accumuleert in de cel. De verandering in (p) ppGpp level is betrokken bij expressie van genen die de respons te om het gebrek aan substraten in de omgeving die direct betrokken zijn bij celgroei en -ontwikkeling overwinnent. Twee van de genen die betrokken zijn bij dit proces heten Rela en spot. RelA een ribosoom-geassocieerde (p) ppGpp synthetase dat betrokken is bij de reactie op de accumulatie van ongeladen tRNA's die het resultaat is van beperking aminozuur. SPOT functioneert als een bifunctioneel (p) ppGpp synthetase en hydrolase. De synthetase activiteit van SPOT is betrokken bij de reactie op het gebrek aan koolstof en vetzuur verhongering. 8 de RelA / Spot homologen zijn wijdverspreid in planten en bacteriën en worden aangeduid als Rsh O ElA / S POT h omologs. 8,10 -12,16 een recent manuscript aangetoond dat er een specifiek Rsh eiwit betrokken bij de synthese van deze alarmones uit de bacterie Novosphingobium sp Rr 2-17. 17

Hier presenteren we vier biochemische pathways vastgebonden aan de functionele complementatie bepalingen. De complementering assays beschreven in dit manuscript biedt een laan naar EXPLerts toepassing van deze in vivo analyse als middel voor het identificeren en karakteriseren of enzymen die worden voorspeld onbekende / mogelijke functie (s) of leermiddelen de leer van biochemische pathways aanvulling hebben.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

LET OP: De auteurs zijn bereid om bacteriestammen en recombinante plasmiden leveren aan de integratie van functionele complementatie analyse voor onderwijsdoeleinden voor mensen die geïnteresseerd zijn te vergemakkelijken. De plasmiden die werden gebruikt om functionele complementatie-experimenten vergemakkelijken staan ​​in tabel 1.

1. Constructie van plasmiden voor Functionele Complementatie

  1. Klonen van diaminopimelaatdehydrogenase Aminotransferase (dapL) voor Functionele Complementatie.
    1. Versterken de dapL open leeskader (ORF) van de V. spinosum en cDNAs van A. thaliana en C. reinhardtii door PCR. Met 1 cyclus bij 94 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 2 minuten. Bevatten 12 pmol van elke primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM elk van de 4 deoxynucleotide trifosfaten, en 0,5 ng template-DNA en 1 eenheid van PfxDNA polymerase.
      LET OP: De volledige omschrijving met betrekking tot de recombinante klonen van drie dapL orthologen uit de plant A. thaliana (At -dapL), de bacterie Verrucomicrobium spinosum (Vs -dapL) en de alg Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) is eerder gepubliceerd. 2,18-20
      OPMERKING: De primers die voor klonering van de dapL orthologen zijn:
      Vs dapL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
      Vs dapL R 5'CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 '
      Bij dapL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 '
      Bij dapL R-5'GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
      Cr dapL F-5'CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 '
      Cr dapL R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 '
    2. Kloon de PCR-fragmenten in tHij plasmide pET30A op de recombinante plasmiden te produceren, pET30A :: Vs dapL, pET30A :: Op dapL en pET30A :: Cr dapL met behulp van de primers, restrictie-enzymen en T4 DNA ligase.
      1. Kort samengevat, incubeer 50 ng insert en 20 ng vector in 1 x ligasebuffer en 1 eenheid T4 DNA-ligase gedurende de nacht bij 17 ° C. Transformeer ligatie in E. coli DH5a cellen en scherm kolonies op LB-platen aangevuld met 50 ug / ml kanamycine -1 door incubatie bij 37 ° C gedurende 24 uur. 18-20
    3. Om het plasmide voor functionele complementatie te creëren, te verteren pET30A :: Vs dapL en pET30A :: Bij dapL plasmiden met de restrictie-enzymen Xbal en Sali en Xbal en HindIII voor de pET30A :: Cr dapL. Ligeren van de inserts in de plasmide pBAD33 met T4 DNA ligase aan het plasmide pBAD33 :: Vs dapL produceren; pBAD33 :: Bij dapL en pBAD33 :: Cr dapL.
      1. Incubeer 50 ng insert en 20 ngvector in 1 x ligasebuffer en 1 eenheid T4 DNA-ligase gedurende de nacht bij 17 ° C. Transformeer ligatie in E. coli DH5a cellen en scherm kolonies op LB-platen aangevuld met 34 ug / ml kanamycine -1 door incubatie 37 ° C gedurende 24 uur. 20
  2. Klonering van tyrosine aminotransferase (tyrB) van A. thaliana voor Functionele Complementatie.
    OPMERKING: De volledige details van het kloneren van het cDNA uit A. thaliana geannoteerd door de locus labels At5g36160 is eerder beschreven. 4
    1. Amplificeren het cDNA door PCR. Met 1 cyclus bij 94 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 2 minuten. Bevatten 12 pmol van elke primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM elk van de vier deoxynucleotide trifosfaten, en 0,5 ng template-DNA en 1 eenheid van Pfx DNA polymerase.
      OPMERKING: De primers die voor de cloning van de At5g36160 zijn:
      Bij tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
      AttyrB R- 5'CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
    2. Kloon het fragment in het plasmide pET30A de recombinante plasmiden pET30A :: At5g36160 produceren door digestie van het PCR-fragment met EcoR1 en Sal1; ligeren van het fragment in pET30A met T4 DNA ligase zoals hieronder beschreven. 4
    3. De functionele complementatie plasmide, verteren het pET30A :: At5g36160 met de restrictie-enzymen XbaI en HindIII en ligeren het inzetstuk in pBAD33 met dezelfde restrictie-enzymplaatsen op de recombinante plasmide pBAD33 :: At5g3160 gebruikmaking van T4 DNA ligase produceren.
      1. Incubeer 50 ng insert en 20 ng vector in 1 x ligasebuffer en 1 eenheid T4 DNA-ligase gedurende de nacht bij 17 ° C. Transformeer de ligatie in E. coli DH5a cellen en het scherm voor de kolonies op LB-platen, aangevuld met 34 ug / ml -1 chloramphenicol door incubatie 37 ° C gedurende 24 uur. 4
  3. Klonen van UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamaat meso -2,6-diaminopimelaatdehydrogenase Ligase (Mure) van V. spinosum voor Functionele Complementatie.
    LET OP: Het klonen van het MURE ORF van V. spinosum is eerder beschreven. 18
    1. Versterken het open afleesraam met PCR. Met 1 cyclus bij 94 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 2 minuten. Bevatten 12 pmol van elke primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM elk van de vier deoxynucleotide trifosfaten, 0,5 ng template-DNA en 1 eenheid van Pfx DNA polymerase. Dan klonen in het plasmide pET100D het plasmide pET100D :: Vs mure produceren.
      OPMERKING: De primers die voor klonering van de Vs MURE zijn:
      Vs mure F- 5'CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3 '
      vsMure R- 5'GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 '
    2. Om het plasmide voor functionele complementatie te produceren, te verteren de pET100D :: Vs mure
      Met de restrictie-enzymen XbaI en Sal1 en ligeren het inzetstuk in pBAD33 het recombinante plasmide pBAD33 :: Vs Muré gebruikmaking van T4 DNA ligase produceren.
      1. Incubeer 50 ng insert en 20 ng vector in 1x ligasebuffer met 1 eenheid T4 DNA-ligase, overnacht bij 17 ° C. Transformeer ligatie in E. coli DH5a cellen en scherm kolonies op LB-platen aangevuld met 34 ug / ml chlooramfenicol -1 door incubatie 37 ° C gedurende 24 uur. 8
  4. Klonen van Rela / s POT (rsh) van Novosphingobium sp voor Functionele Complementatie.
    Opmerking. Het klonen van de rsh uit Novosphingobium sp is eerder beschreven 17.
    1. Versterken de rsh ORF in aanvulling op 599 nucleotiden upstpak de initiatie startplaats en 46 nucleotiden stroomafwaarts bij de beëindiging plaats met behulp van PCR. Met 1 cyclus bij 94 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 2 minuten. Bevatten 12 pmol van elke primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM elk van de vier deoxynucleotide trifosfaten, 0,5 ng template-DNA en 1 eenheid Taq DNA-polymerase. Vervolgens klonen in het plasmide pCR2.1 om pCR2.1 :: Nsp rsh produceren.
      1. Incubeer 1 ul geamplificeerd PCR-fragment, 1 ui vector pCR2.1, 1 pl zoutoplossing en 1 pl water. Incubeer bij 25 ° C gedurende 5 min en 2 pi ligatie in E. coli-cellen en scherm kolonies op LB-platen aangevuld met 50 ug / ml kanamycine -1 door incuberen 37 ° C gedurende 24 uur.
        OPMERKING: De primers die voor klonering van de rsh zijn:
        rsh F- 5'GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 '
        rsh R- 5'GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 '
      2. Voor functionele complementatie, verteren het plasmide pCR2.1 :: Nsp rsh met EcoR1 en ligeren het inzetstuk in de breed gastheerbereik pRK290 op de recombinante plasmide pRK290 :: Nsp produceren RSH met behulp van T4 DNA ligase.
        1. Incubeer 50 ng insert en 20 ng vector in 1 x ligasebuffer en 1 eenheid T4 DNA-ligase gedurende de nacht bij 17 ° C. Transformeer ligatie in E. coli DH5a cellen en scherm kolonies op LB-platen aangevuld met 10 ug / ml tetracycline -1 door incuberen 37 ° C gedurende 24 uur. 17

2. Voorbereiding van de elektro-competente bacteriecellen op Transformation vergemakkelijken

Opmerking: Het preparaat van elektro-competente cellen is gebaseerd op het protocol 26 van 1,0 liter cultuur die tot een kleiner volume (bijvoorbeeld, 250 ml) worden geschaald. Houdt u er rekening mee dat dit protocol kan be gebruikt om alle stammen bevoegde die worden beschreven in dit manuscript om FCA te vergemakkelijken. 22

  1. Wordt geënt in 50 ml vloeibaar medium met een enkele kolonie in een kolf en groeien 's nachts, en zorg ervoor dat het genotype van de mutant te controleren alvorens te beginnen met deze stap (tabel 2).
  2. Op dag twee enten 1,0 L van het geschikte medium (LB E. coli mutanten en PD Novosphingobium sp) met 50 ml van de overnachtkweek en groeien tot een OD 600 tot 0,4-0,6 (log fase) bij 30 ° C.
  3. Oogst cellen door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C, giet het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 ml steriele ijskoude pure H2O
  4. Centrifugeer de cellen bij 5000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C, giet het supernatant en resuspendeer de pellet in 250 ml steriele ijskoude 10% glycerol.
  5. Centrifugeer de cellen bij 5000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C, giet de supernatant en resuspendeer de pellet in 2,0 ml van 10% glycerol.
  6. Aliquot de cellen door overdracht van 50 gl in micro-centrifugebuizen en onmiddellijk bevriezen door het plaatsen van de buizen in een droogijs-ethanol bad. Bewaar de competente cellen bij -80 ° C voor elektroporatie.

3. Elektroporatie van bacteriële cellen met plasmiden Complementatie

  1. Voor elektroporatie, voeg 1,0 pl (10-50 ng) recombinant plasmide een aliquot (50 pl) van competente cellen en plaats op ijs gedurende 5 minuten.
  2. Breng het mengsel via pipetteren een elektroporatie cuvet en stel de elektroporatie apparaat naar de volgende instelling: 25 uF capaciteit, 2,5 kV en 200 ohm weerstand en zorgen voor een impuls.
  3. Voeg 1,0 ml van herstel media (LB) aan de elektroporatie cuvette en de overdracht met behulp van een pipet om een ​​15 ml conische buis. Recover met zachte rotatie gedurende 60 minuten in een schuddend incubator.
  4. Plate 100 pl van de cultuur van de Recozeer stap op de agarplaten te selecteren op transformanten door pipetteren en verspreiden met een steriele spreader.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de tabellen 1 en 2 te controleren alvorens te beginnen met deze stap om de antibiotica en genotypes te controleren om de juiste agar platen te maken.

4. Transformatie van AOH1 naar Functional Complementatie vergemakkelijken Met behulp van L, L-diaminopimelaatdehydrogenase Aminotransferase (dapL)

  1. Voor complementatie analyse transformeren AOH1 met de lege vector (pBAD33), en met de DapL expressievectoren in afzonderlijke transformatie gebeurtenissen met behulp van de elektroporatie protocol beschreven in paragraaf 3.0.
  2. Selecteer transformanten door uitplaten op LB agar medium aangevuld met 50 ug / ml -1 DAP en 34 ug / ml chlooramfenicol -1 en 50 ug / ml kanamycine -1.
  3. Test voor functionele complementatie door replica-plating kolonies door uitstrijken op LB medium met 0,2% (w / v) arabinose met en zonder 50 ug / ml -1 DAP en 34 ug / ml kanamycine -1.
  4. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 24 uur en observeer resultaten.
    Opmerking: Het resultaat moet blijken dat de mutant alleen in staat te groeien op DAP vrije media wanneer de dapL expressie wordt gebracht in de mutante achtergrond in vergelijking met de controle vector alleen.

5. Transformatie van TKL-11 tot en met Functionele Complementatie vergemakkelijken met behulp van UDP-N -acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso -diaminopimelate Ligase (mure)

  1. Transformeer de mutant met de lege vector (pBAD33) en met de MURE uitdrukken vector (pBAD33 :: VsmurE) met behulp van het protocol beschreven in paragraaf 3.0.
  2. Plaat en selecteer transformanten op LB agar medium aangevuld met 50 ug / ml -1 thymine en 34 ug / ml chlooramfenicol -1 en incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 24 uur.
  3. Test op complementatie door uitstrijken of uitplaten kolonies van zowel de controle en de experimentele transformaties op twee LB-medium met 0,2% (w / v) arabinose en 50 ug / ml -1 thymine.
  4. Incubeer een plaat bij 30 ° C en de andere bij 42 ° C gedurende 24 uur visueel beoordelen van de groei fenotype.
    NB: De resultaten moeten aantonen dat de mutant in staat te groeien bij 42 ° C wanneer het MURE expressie wordt gebracht in de mutante achtergrond in vergelijking met de controle vector alleen.

6. Transformatie van DL39 tot Functional Complementatie Faciliteren Met behulp van tyrosine Aminotransferase (tyrB)

  1. DL39 transformatie met ofwel pBAD33 of pBAD33 :: At5g36160 en selecteer transformanten op LB-agarplaten gesupplementeerd met 50 ug / ml -1 tyrosine, 50 ug / ml -1 fenylalanine en 34 ug / ml chloramfenicol -1 gebruik van het protocol beschreven in sectie 3,0.
  2. kopiestalen frame, enzovoort kolonies op een minimale (M9) medium met 50 ug / ml -1 fenylalanine en 50 ug / ml -1 tyrosine, 50 ug / ml -1 aspartaat, 50 ug / ml leucine -1, 50 ug / ml valine -1, 50 ug / ml -1 isoleucine, 10 ug / ml uracil -1 0,5% (w / v) glycerol, 0,2% (w / v) arabinose. Ook replica-plaat kolonies op platen ontbreekt fenylalanine en tyrosine door strepen dezelfde kolonie van beide platen.
  3. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 48 uur tot groeifenotype observeren.
    Opmerking: Het resultaat moet blijken dat de mutant alleen in staat te groeien op fenylalanine en tyrosine vrije media, alleen wanneer de tyrB gen wordt tot expressie gebracht in de mutante achtergrond in vergelijking met de controle vector alleen.

7. Transformatie van Hx699 om Functionele Complementatie van de Hypomucoid fenotype van Novosphingobium sp vergemakkelijken. Strain Hx699

  1. Transformeer wild-type stam Novosphingobium sp. (Rr2-17) en de mutant Hx699 met pRK290 en pRK290 :: rsh Nsp in 2 aparte transformatie gebeurtenissen met behulp van de transformatie protocol beschreven in paragraaf 3.0.
  2. Plate de transformaties op aardappel dextrose (PD) agar gesupplementeerd met 10 ug / ml tetracycline -1 en incubeer gedurende ten minste 24 uur of totdat transformanten.
  3. Streak zowel transformaties in de "X" patroon op verse PD agar platen en incubeer bij 30 ° C gedurende ten minste 4 dagen. Let op de fenotypes van alleen de vector, en experimenteer door visueel onderzoek van de groei fenotype van beide platen.
    Opmerking: Het resultaat moet blijken dat de hypo-mucoïde fenotype wordt aangevuld rsh wordt uitgedrukt in de achtergrond mutant in vergelijking met de controle vector alleen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De bacteriële stammen die gebruikt worden in de verschillende functionele complementatie analyses worden in tabel 2.

Functionele complementatie analyse: L, L-diaminopimelinezuur aminotransferase (dapL)

E. coli dubbele mutant AOH1 (Δ dapD :: Kan2, dapE6) herbergt een mutatie in het gen dapE en een complete deletie van het d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Veel van de cursussen die integraal zijn voor de Biotechnologie en Moleculaire Bioscience curriculum aan het Rochester Institute of Technology hebben een laboratorium component in aanvulling op de lezing deel van de cursus. Het curriculum voor het academisch jaar 2014-2015 een totaal van 48 cursussen, waarvan 29 bevatten een laboratorium component die ongeveer 60% vertegenwoordigen. Een van deze cursus is Fundamentals of Plant Biochemie en Pathologie (FPBP), een gemengde lezing / practicum en Bioseparations: Principles ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

AOH en MAS erkent het College of Science en de Thomas H. Gosnell School of Life Sciences aan het Rochester Institute of Technology voor ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Amerikaanse National Science Foundation (NSF) toe te kennen aan AOH MCB-1120541.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
E. coli mutantenHudson/Savka lab of CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
ElectroporatorBiorad-USA1652100
Electroporatie CuvettesBiorad-USA1652082
Temperatuur gecontroleerde incubatorGeneric
MicrocentrifugeGeneric
Luria AgarThermofisher Scientific22700025
Luria BrothThermofisher Scientific12795084
M9 MediumSigma-Aldrich63011
Aardappel Dextrose MediumFisher Scientfic DF0013-15-8
KanamycineSigma-AldrichK1377
DiaminopimelaatSigma-Aldrich92591
ThymineSigma-AldrichT0376
ChloramfenicolSigma-AldrichC0378
TyrosineSigma-AldrichT3754
FenylefanilineSigma-AldrichP2126
AspartaatSigma-AldrichA9256
ValineSigma-AldrichV0500
LeucineSigma-AldrichL8000
IsoleucineSigma-AldrichI2752
UracilSigma-AldrichU0750
GlycerolSigma-AldrichG5516
ArabinoseSigma-AldrichA3256
TetracyclineSigma-Aldrich87128
Taq DNA polymeraseThermofisher Scientific10342-020
Platinum pfx DNA polymeraseThermofisher Scientific11708-013
T4 DNA ligaseThermofisher Scientific15224-041
E. coli Dh5-alphaThermofisher Scientific18258012
E. coli Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/topo vectorThermofisher ScientificK100-01
pCR2.1 VectorThermofisher ScientificK2030-01

Referenties

  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
  3. Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).
  4. Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572(2010).
  5. Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
  6. McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458(2013).
  7. Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
  8. Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical. Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).
  9. Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).
  10. Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).
  11. Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
  12. Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
  13. Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
  14. Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
  15. Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
  16. Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
  17. Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
  18. Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183(2012).
  19. Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
  20. Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439(2011).
  21. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
  22. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  23. Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
  24. Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
  25. Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
  26. Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
  27. Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
  28. Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
  29. Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
  30. Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
  31. Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. Automatic prediction of protein function. Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).
  32. Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
  33. Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Enzymactiviteitsassaygenfunctieanalyseelectroporatietransformatieselectie van bacteriële mutantenin vivo-conditiesaminozuurmetabolismepeptidoglycaansynthesestringent respons-routeArabidopsis thaliana
Functionele Complementatie Analysis (FCA): A Laboratory Oefening ontworpen en geïmplementeerd om het onderwijs in Biochemical Pathways Supplement
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.