Functionele Complementatie Analysis (FCA): A Laboratory Oefening ontworpen en geïmplementeerd om het onderwijs in Biochemical Pathways Supplement

Summary

De validatie van de enzymatische activiteiten die betrokken zijn bij biochemische pathways kunnen worden toegelicht met behulp van functionele complementatie analyse (FCA). In dit manuscript het FCA assay waaruit de enzymatische activiteit van enzymen betrokken bij het metabolisme van aminozuren, bacteriële stringente respons en bacteriële peptidoglycaan biosynthese.

Abstract

Functionele complementatie bepaling (FCA) een in vivo analyse die op grote schaal wordt gebruikt om de functie / rol van genen / enzymen helderen. Deze techniek is heel gebruikelijk in de biochemie, genetica en vele andere disciplines. Een uitgebreid overzicht van de techniek om de leer van biochemische routes met betrekking tot zuren, peptidoglycaan en de bacteriële strenge reactie wordt beschreven in dit manuscript aminozuren aan te vullen. Twee cDNA's van de modelplant Arabidopsis thaliana die betrokken zijn bij het ​​metabolisme van lysine (L, L-diaminopimelinezuur aminotransferase (dapL) en tyrosine aminotransferase (tyrB) betrokken bij het ​​metabolisme van tyrosine en fenylalanine zijn gemarkeerd. Daarnaast is de bacteriële peptidoglycaan anabolische route gemarkeerd door de analyse van de UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamaat -2,6 meso-diaminopimelinezuur ligase (Muré) gen uit het bacterie Verrucomicrobium spinosum betrokken bij het ​​kruis-linking van peptidoglycan. De bacteriële stringente respons wordt eveneens opgenomen in de analyse van de rsh (r ElA / s pot h omolog) bifunctionele gen betrokken bij een hyper-mucoïde fenotype van de bacterie Novosphingobium sp. Vier voorbeelden van FCA worden gepresenteerd. De video zal zich richten op drie van hen, namelijk lysine, peptidoglycaan en de strenge reactie.

Introduction

Functionele complementatie in de context van het ophelderen van de functie (s) / functie (s) van een gen wordt gedefinieerd als het vermogen van een bepaalde homoloog of ortholoog gen een bepaalde mutant renovatie met een waarneembaar fenotype met het wild-type toestand wanneer de homologe of orthologe gen wordt ingebracht in cis- of trans in het mutante achtergrond. Deze techniek wordt algemeen gebruikt voor het isoleren en de functie (s) / functie (s) van vele genen. Een specifiek voorbeeld is de isolatie en identificatie van orotidine-5-fosfaat decarboxylase van Candida albicans met de ura3 mutant van S. cerevisiae en <....

Protocol

LET OP: De auteurs zijn bereid om bacteriestammen en recombinante plasmiden leveren aan de integratie van functionele complementatie analyse voor onderwijsdoeleinden voor mensen die geïnteresseerd zijn te vergemakkelijken. De plasmiden die werden gebruikt om functionele complementatie-experimenten vergemakkelijken staan ​​in tabel 1.

1. Constructie van plasmiden voor Functionele Complementatie

1. Klonen van diaminopimelaatdehydrogenase Aminotransferase (dapL) voor Functionele Complementatie.
   1. Versterken de dapL open leeskader (ORF) van de V. spinosum en cDNAs van A. thaliana en C.....

Results

De bacteriële stammen die gebruikt worden in de verschillende functionele complementatie analyses worden in tabel 2.

Functionele complementatie analyse: L, L-diaminopimelinezuur aminotransferase (dapL)

E. coli dubbele mutant AOH1 (Δ dapD :: Kan2, dapE6) herbergt een mutatie in het gen dapE en een complete deletie van het d.......

Discussion

Veel van de cursussen die integraal zijn voor de Biotechnologie en Moleculaire Bioscience curriculum aan het Rochester Institute of Technology hebben een laboratorium component in aanvulling op de lezing deel van de cursus. Het curriculum voor het academisch jaar 2014-2015 een totaal van 48 cursussen, waarvan 29 bevatten een laboratorium component die ongeveer 60% vertegenwoordigen. Een van deze cursus is Fundamentals of Plant Biochemie en Pathologie (FPBP), een gemengde lezing / practicum en Bioseparations: Principles .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli mutants	Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
Electroporator	Biorad-USA	1652100
Electroporation Cuvettes	Biorad-USA	1652082
Temperature controlled incubator	Generic
Microcentrifuge	Generic
Luria Agar	Thermofisher Scientific	22700025
Luria Broth	Thermofisher Scientific	12795084
M9 Medium	Sigma-Aldrich	63011
Potato Dextrose Medium	Fisher Scientfic	DF0013-15-8
Kanamycin	Sigma-Aldrich	K1377
Diaminopimelate	Sigma-Aldrich	92591
Thymine	Sigma-Aldrich	T0376
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754
Phenlylalanine	Sigma-Aldrich	P2126
Aspartate	Sigma-Aldrich	A9256
Valine	Sigma-Aldrich	V0500
Leucine	Sigma-Aldrich	L8000
Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
Gylcerol	Sigma-Aldrich	G5516
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Tetracyline	Sigma-Aldrich	87128
Taq DNA polymerase	Thermofisher Scientific	10342-020
Platinum pfx DNA polymerase	Thermofisher Scientific	11708-013
T4 DNA ligase	Thermofisher Scientific	15224-041
E. coli Dh5-alpha	Thermofisher Scientific	18258012
E. coli Top10	Thermofisher Scientific	C4040-03
pET100D/topo vector	Thermofisher Scientific	K100-01
pCR2.1 Vector	Thermofisher Scientific	K2030-01