Methodenartikel

-Capillaire gebaseerde centrifugale microfluïdische apparaat voor Grootte-controleerbare Vorming van Monodisperse microdruppels

DOI:

10.3791/53860

⸱

22 februari 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Computational Intelligence and Systems Science, Interdisciplinary Graduate School of Science and Engineering, Tokyo Institute of Technology, 2Graduate School of Bioscience and Biotechnology, Tokyo Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Keio University, 4PRESTO, Japan Science and Technology Agency

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier demonstreren we een eenvoudige productiemethode voor grootte-controleerbare, monodisperse, water-in-olie (W/O) microdruppeltjes met behulp van een capillair-gebaseerd centrifugaal microfluïdisch apparaat. Deze methode vereist slechts een klein monstervolume en maakt hoogwaardige productie mogelijk. We verwachten dat deze methode nuttig zal zijn voor snelle biochemische en cellulaire analyses.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier tonen we een eenvoudige werkwijze voor de snelle productie van grootte regelbaar, monodisperse, W / O microdruppels met een capillair-gebaseerde centrifugale microfluïdische apparaat. W / O microdruppeltjes zijn onlangs gebruikt krachtige methoden die het mogelijk maken geminiaturiseerde chemische experimenten. Daarmee wordt de ontwikkeling van een veelzijdige werkwijze ter verkrijging monodisperse W / O microdruppels nodig. We hebben een werkwijze voor het monodisperse W / O microdruppels op basis van een capillair gebaseerde centrifugaal assymmetrische co-flowing microfluïdische apparaat ontwikkeld. Gelukt het regelen van de omvang van de microdruppeltjes door aanpassing van de capillaire opening. Onze methode vereist apparatuur die gemakkelijker te gebruiken dan bij andere microfluïdische technieken, vereist slechts een klein volume (0,1-1 ul) van de monsteroplossing voor inkapseling, en maakt de productie van honderdduizenden aantal W / O microdruppeltjes per seconde . Wij verwachten dat deze methode zal biologische studies dat kostbare biologische s nodig te helpenamples door behoud van de volume van de monsters voor snelle kwantitatieve analyse biochemische en biologische studies.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W / O microdruppeltjes 1-5 hebben vele belangrijke toepassingen voor de studie van de biochemie en biotechnologie, waaronder eiwitsynthese 6, 7 eiwitkristallisatie, emulsie PCR 8,9, celinkapselende 10 en constructie van kunstmatige celachtige systemen 5,6. W / O microdruppeltjes voor deze toepassingen produceren belangrijke criteria zijn controle grootte en monodispersibility van het W / O microdruppels. Microfluïdische inrichtingen voor het maken monodisperse, grootte regelbaar W / O microdruppeltjes 11 zijn gebaseerd op de co-stromende 12,13 methode, flow scherpstelmethode 14,15, en de T-splitsing werkwijze 16 in microkanalen. Hoewel deze werkwijzen produceren sterk monodisperse W / O microdruppeltjes, de microfabrication proces vereist ingewikkelde hantering en gespecialiseerde technieken voor de bereiding van microkanalen en vereist ook een grote hoeveelheid monsteroplossing (ten minste enkele honderden81; l) vanwege de onvermijdelijke dode volume in de spuit pompen en buizen die de monsteroplossing om de microkanalen te voeren. Aldus wordt een eenvoudig te gebruiken en laag dood volume methode om monodisperse genereren W / O microdruppels nodig.

Dit document, samen met video experimentele procedures, beschrijft een centrifugale capillair-gebaseerde co-assymmetrische flowing microfluïdische apparaat 17 voor het genereren van cel-sized, monodisperse W / O microdruppels (figuur 1). Deze eenvoudige methode realiseert grootte monodispersiteit en grootte beheersbaarheid. Het vereist slechts een tabletop mini-centrifuge en een capillair basis assymmetrische-co stroomt microfluïdische apparaat in een sampling microbuis vast. Onze methode heeft slechts een zeer klein volume (0,1 ui) en geen significante volume van het monster afval.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabricage van een capillair-gebaseerde microfluïdische apparaat

  1. Opzetten van de houders
    Opmerking: De houder ontwerp is weergegeven in figuur 2A.
    1. Knip elk van de vier schijven van de houders (Figuur 2A (i) - (iv)) van 2 mm dikke polyacetaal kunststof plaat met een freesmachine. Gebruik de volgende afmetingen voor elk van de vier schijven van de houder: (i) disc 1 8,5 mm diameter, capillaire opening (CH) diameter 1,3 mm, schroefgat (SH) diameter 1,8 mm; (Ii) 2 disc diameter 8,7 mm, 2,0 mm diameter CH, SH diameter 1,8 mm; (Iii) 3 disc diameter 8,7 mm, diameter 0,5 mm CH, SH diameter 1,8 mm; en (iv) 4 disc diameter 9,1 mm, diameter 1,0 mm CH, SH diameter van 1,8 mm.
    2. Monteer de houders met behulp van M2 × 40 schroeven (Figuur 2B). Een onderste gedeelte van de houder (figuur 2B) uit de schijf 1 en de schijf 2 in figuur 2A (i), (ii) en een bovenste gedeelte (Figure 2B) van de houder uit de schijf 3 en de schijf 4 in Figuur 2A (iii), (iv).
      1. Om het onderste deel van de houder te construeren, steek de schroef in drie SH van elke schijf 1 en 2. Kort de schroeven door knijpen een stuk van de draad gedeelte. Houd de lengte van schroef 0,9 cm (dezelfde lengte als het bodemdeel van de houder).
      2. Om het bovenste deel van de houder te bouwen, plaatst u schroeven in de twee SH van elke schijf 3 en 4. Verkort de schroeven door knijpen een stuk van de draad gedeelte. Houd de lengte van schroef 0,7 cm (dezelfde lengte als het bovenste gedeelte van de houder).
      3. Om de houder te monteren, lid worden van de bodem en de bovenste delen van de houder met behulp van een lange schroef.
        Opmerking: Bewaar de lengte van elk deel van de houder exact: het onderste deel is 0,9 cm; het bovenste deel is 0,7 cm (figuur 2B).
  2. Fabricage van de glazen capillairen
    1. Gebruik twee soorten glas capillairen: een binnenste glazen capillair (buitendiameter (OD) / binnendiameter (ID): 1,0 / 0,6 mm) en een buitenste glazen capillair (OD / ID: 2,0 / 1,12 mm).
    2. Gebruik een glassnijder naar de buitenste glas capillaire verdelen in drie gelijke delen, en gebruik vervolgens de glassnijder aan de binnenste glazen capillair verdelen in twee gelijke stukken.
    3. Verscherpen elk verdeeld binnenste en buitenste glas haarvaten met behulp van een glazen capillair trekker (figuur 3A). Stel het gewicht van de trekker bij max. Stel de hitte niveau van de trekker op 60 graden voor de buitenste glazen capillair en 70 graden voor de binnenste capillair. verscherpen de glazen capillair zorgvuldig.
      1. Houd de lengte van de punt binnen het versmalde gedeelte van de glazen capillair de binnenste capillair 1,5-1,8 cm; de buitenste capillair 0,8-1,0 cm (figuur 3C). Als deze lengte korter of langer is dan de beschreven lengte, past u de warmte niveau van de trekker.
    4. Fix de binnenste of buitenste glas haarvaten van de microforge staan ​​met tape (Figuur 3B).
    5. Snij het ​​uiteinde van de glazen capillair met de microforge in drie stappen (Figuur 3B): (i) raakt de punt van de glascapillair om de glasparels op een platinadraad, (ii) verwarm het platinadraad van stappen op een voet schakelaar voor 1-2 seconden, en (iii) na 1-2 sec, afgesneden uiteinde van de glazen capillair door koelen de platinadraad.
      1. Stel de diameters van de binnenste (d i) en buitenste (d o) capillaire openingen, respectievelijk. De openingsdiameter van de binnenruit capillair 5, 10 en 20 pm (d = i 5,10, 20 pm) en de buitenste glazen capillair (d o) is 60 urn (d o = 60 pm) in dit experiment.
        Opmerking: Het glas capillair is voor eenmalig gebruik. Herhaal de vervaardiging van de glazen capillaireies.

2. Procedure voor het genereren W / O microdruppeltjes

  1. Vul een buitenste glas capillair met oliehoudend surfactant. Het mengsel van olie en oppervlakteactieve hexadecaan bevattende 2% (w / w) sorbitanmonooleaat in dit experiment (figuur 4A).
    Opmerking: Er zijn vele combinaties van oliën en oppervlakteactieve stoffen (bijvoorbeeld oliën kunnen gefluoreerd of koolzuurhoudend zijn, ionische surfactanten, niet-ionische of fluorchemische zijn).
    1. Pipetteer 10 gl bevattende hexadecaan sorbitanmonooleaat in een buitenste glazen capillair. In figuur 4A is de openingsdiameter van de buitenste glazen capillair (d o) is 60 urn (d o = 60 pm). Om de opening van het glazen capillair aan te passen, terug te stappen 1.2.4-1.2.5.
  2. Stel de buitenste capillair in het onderste deel van de houder (figuur 4B).
  3. Draw ongeveer 0,1 gl van een waterige oplossing in een binnenste glazen capillair (figuur 4C) door capillaire werking. In figuur 4C, de openingsdiameter van binnenruit capillair (d i) 10 urn (d i = 10 pm). Om de opening van het glazen capillair aan te passen, terug te stappen 1.2.4-1.2.5.
  4. Stel de binnenste capillair in het bovenste deel van de houder (figuur 4D-a). Plaats de binnenste capillair in de buitenste capillair (Figuur 4D-a). Kijkend naar de witte stip cirkel zoals in figuur 4D-een, op de positie van de binnenste capillair in de buitenste capillair (inwendige diameter van de buitenste capillair (w) = 130 urn) (Figuur 4D-b, c) met een digitale microscoop . De positie van de binnenste capillair in de buitenste capillair moet op w = 100-150 urn.
    Opmerking: Om de positie van de innerlijke veranderingcapillaire in de buitenste capillaire, schakel dan de schroef in het bovenste deel van de houder. Daardoor kan de afstand w nauwkeurig worden geregeld.
  5. Introduceren 100 gl bevattende hexadecaan sorbitanmonooleaat (2% w / w) in de bodem van een 1,5 ml monster microbuis. Installeer de houder met de binnenste en buitenste capillairen in het monster microbuis (Figuur 4E-a). Zorg ervoor dat de buitenste capillaire controleren om het weg te houden van de lucht-olie-interface (Figuur 4E-b).
  6. Centrifuge het monster microbuisjes met een tabletop swingende-out-type mini-centrifuge bij een gewicht van 1.600 g gedurende 1-2 sec om microdruppels te genereren (Figuur 4F). Voer alle experimenten bij RT.
    Opmerking: Gebruik een swingende-out-type centrifuge. Een druppel kan botsen met een zijwand van het monster microbuis en desintegreren wanneer vaste-hoek-centrifuge wordt gebruikt.
  7. trekken langzaam de W / O druppeltjes met een pipet, en dan, leg ze op een glazen slide.
  8. Maak foto's van de microdruppels gegenereerd met behulp van een digitale microscoop (vergroting, 200X).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie presenteren we een eenvoudige methode voor het genereren van cel-sized W / O microdruppels met een capillaire gebaseerde centrifugale microfluïdische inrichting (figuur 1). Het microfluïdische apparaat bestond uit een capillaire houder (figuur 2B), twee glazen capillairen (binnenste en buitenste glazen capillairen in figuur 3C), en een microbuis met een olie zoals surfactant. We ingespoten 0,1 ul van het monster oplossing ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gebruik van dit apparaat de monodisperse W / O microdruppels werden gegenereerd door Plateau-Rayleigh instabiliteit van een jet-stroom 17. Microscopisch onderzoek niet de aanwezigheid van volgdruppels niet onthullen. Bij de vervaardiging van de inrichting, drie kritische stappen zijn essentieel voor succesvol genereren monodisperse W / O microdruppels. Enerzijds een rechte oliestroom die oppervlakteactieve stof en een waterige oplossing te leveren, moet de capillaire openingen van vier schijven aangebracht in...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het PRESTO-onderzoeksgebied "Ontwerp en Controle van Cellulaire Functies" van de Japan Science and Technology Agency (JST), een Grant-in-Aid voor Wetenschappelijk Onderzoek van Innovatieve Gebieden "Moleculair Robotiek" (Projectnr. 24104002) van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie (MEXT), Japan, Grant-in-Aid voor Jonge Wetenschappers (A) (Projectnr. 24680033) en Wetenschappelijk Onderzoek (B) (Projectnr. 26280097) van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), en de Creative Design voor Bioscience en Biotechnology cursus van de School of Bioscience en Biotechnology in Tokyo Tech.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-mm-dikte polyacetaal kunststof plaatGereedschapNikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan)244-6432-08
FreesmachineGereedschapRoland DG Co., Ltd. (Japan)MDX-40A
End Mill RSE230-0.5*2.5GereedschapNS Tool Co., Ltd. (Japan)01-00644-00501
M2*40 schroevenGereedschapJujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan)0001-024
Glas capillair pullerGereedschapNarishige (Japan)PC-10
MicroforgeGereedschapNarishige (Japan)MF-900
Binnen glas capillairGereedschapNarishige (Japan)G-1
Buiten glas capillairGereedschapWorld Precision Instruments Inc. (USA)1B200-6
1,5 ml steekproefbuisjeGereedschapINA OPTIKA CO.,LTD (Japan)ST-0150F
HexadecaanReagensWako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan)080-03685 
Sorbitaan monooleaat (Span 80)ReagensTokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan)S0060
Milli Q-systeemReagensMerck Millipore Corporation (Duitsland)ZRQSVP030
Zwenkbare mini-centrifugeGereedschapHitech Co., Ltd. (Japan)ATT101
Digitaal microscoopGereedschapKEYENCE Corporation (Japan)VHX-2001

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F. Reactions in droplets in microfluidic channels. Angew. Chem., Int. Ed. 45 (44), 7336-7356 (2006).
  2. Huebner, A., et al. Microdroplets: a sea of applications? Lab Chip. 8, 1244-1254 (2008).
  3. Taly, V., Kelly, B. T., Griffiths, A. D. Droplets as microreactors for highthroughput biology. ChemBioChem. 8 (3), 263-272 (2007).
  4. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip . 8, 198-220 (2008).
  5. Takinoue, M., Takeuchi, S. Droplet microfluidics for the study of artificial cells. Anal. Bioanal. Chem. 400 (6), 1705-1716 (2011).
  6. Hase, M., Yamada, A., Hamada, T., Baigl, D., Yoshikawa, K. Manipulation of cell-sized phospholipid-coated microdroplets and their use as biochemical microreactors. Langmuir. 23 (2), 348-352 (2007).
  7. Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A Droplet-Based, Composite PDMS/Glass Capillary Microfluidic System for Evaluating Protein Crystallization Conditions by Microbatch and Vapor-Diffusion Methods with On-Chip X-Ray Diffraction. Angew. Chem., Int. Ed. 43 (19), 2508-2511 (2004).
  8. Nakano, M., et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. J. Biotechnol. 102 (2), 117-124 (2003).
  9. Diehl, F., et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat. Methods. 3, 551-559 (2006).
  10. He, M., et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  11. Baroud, C., Gallaire, F., Dangla, R. Dynamics of microfluidic droplets. Lab Chip. 10, 2032-2045 (2010).
  12. Utada, A. S., Nieves, A. F., Stone, H. A., Weitz, D. A. Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams. Phys. Rev. Lett. 99 (9), 094502(2007).
  13. Cramer, C., Fischer, P., Windhab, E. J. Drop formation in a co-flowing ambient fluid. Chem. Eng. Sci. 59 (15), 3045-3058 (2004).
  14. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow-focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-366 (2003).
  15. Takeuchi, S., Garstecki, P., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. An axisymmetric flow-focusing microfluidic device. Adv. Mater. 17 (8), 1067-1072 (2005).
  16. Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86 (18), 4163-4166 (2001).
  17. Yamashita, H., et al. Generation of monodisperse cell-sized microdroplets using a centrifuge-based axisymmetric co-flowing microfluidic device. J. Biosci. Biotech. 119 (4), 492-495 (2015).
  18. Maeda, K., Onoe, H., Takinoue, M., Takeuchi, S. Controlled synthesis of 3D multi-compartmental particles with centrifuge-based microdroplet formation from a multi-barrelled capillary. Adv. Mater. 24 (10), 1340-1346 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Capillary based Centrifugal Microfluidic DeviceMonodisperse Microdroplet FormationSize controllable MicrodropletsWater in Oil MicrodropletsCentrifugal MicrofluidicsCapillary Orifice ControlMicrodroplet GenerationMicrofluidic Device AssemblyCentrifuge OperationMicrodroplet Size Control

Gerelateerde artikelen