Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door

9.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53864

⸱

17 april 2016

 , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, The Center for Sensory Biology, The Johns Hopkins University, School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Het gehoororgaan is betrokken bij het gehoor. Hier presenteren we een aangepaste in ovo micro-elektroporatiemethode, geoptimaliseerd voor het bestuderen van de proliferatie en differentiatie van auditieve stamcellen in het zich ontwikkelende gehoororgaan van de kip.

Samenvatting

Kippenembryo's zijn ideaal modelsystemen voor het bestuderen van de embryonale ontwikkeling manipulaties genfunctie kan worden uitgevoerd met relatief gemak in ovo. Het binnenoor auditieve zintuig is van cruciaal belang voor ons vermogen om te horen. Het herbergt een zeer gespecialiseerde sensorische epitheel, dat bestaat uit-mechanisch transduceren haarcellen (HC) en de omliggende glia-achtige ondersteunende cellen (SCS). Ondanks structurele verschillen in de auditieve organen worden moleculaire mechanismen reguleren van de ontwikkeling van het auditieve orgaan evolutionair geconserveerd tussen zoogdieren en Aves In ovo elektroporatie grotendeels beperkt tot beginfase E1 -. E3. Door de relatieve late ontwikkeling van het auditieve orgaan E5, manipulaties van het auditieve orgaan van in ovo elektroporatie verleden E3 moeilijk vanwege de gevorderde ontwikkeling van het kippenembryo in latere stadia. De hier gepresenteerde methode is een voorbijgaande genoverdracht methode voor het richten van genen van belang bijstadium E4 - E4.5 in de ontwikkelingslanden kip auditieve zintuig via in ovo micro-elektroporatie. Deze methode is toepasbaar voor gain en verlies-van-functie met conventionele plasmide-DNA-expressievectoren en kan worden gecombineerd met in ovo celproliferatie assay door toevoeging EDU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) om het hele embryo in de tijdstip van elektroporatie. De toepassing van groen of rood fluorescerend eiwit (GFP of RFP) expressieplasmiden kan de experimentator om snel te bepalen of de elektroporatie succes het auditieve gedeelte van het binnenoor ontwikkeling gericht. Bij deze werkwijze document, zijn representatieve voorbeelden van GFP geëlektroporeerd specimens geïllustreerd; embryo's werden geoogst 18-96 uur na elektroporatie en targeting van GFP aan de pro-sensorische gebied van het auditieve orgaan werd bevestigd door RNA in situ hybridisatie. De werkwijze papier verschaft ook een geoptimaliseerd protocol voor het gebruik van de thymidine analoog EDE cel Prolif analyserenking; Een voorbeeld van een EDU gebaseerd celproliferatie assay die immuno-labeling combineert en klik EDU chemie verschaft.

Inleiding

Ondanks verschillen in morfologie en cellulaire patroonvorming tussen de zoogdieren en vogels auditieve zintuig, worden de moleculaire factoren en routes die verantwoordelijk zijn voor de sensorische HC ontwikkeling gedacht evolutionair geconserveerd 1-3. De basilaire papilla, die de auditieve HK's en hun omgeving SC huizen, ontwikkelt zich als een outpocketing van het binnenoor otocyst. Vroeg op een pool van HC en SC voorlopers wordt opgegeven binnen de otic placode / otic cup neurale-zintuiglijke bevoegde domein (NSD). Fate-kaartgegevens leveren het bewijs dat de neuronale en sensorische lijnen zijn met elkaar verbonden en komen voort uit de NSD in de antero-ventrale regio van de otic beker of otocyst bij muizen en kippen 4,5. Eerst, neuroblasts delamineren van de NSD invloed kunnen uitoefenen neuronen van de auditieve-vestibulaire ganglion, die uiteindelijk verdeeld auditieve en vestibulaire ganglia geven. Deze neuronen innerveren sensorische HC van het binnenoor en kernen in de hersenstam. De cellen thten blijven in de NSD wordt gedacht dat ze ontstaan ​​verschillende sensorische patches, waaronder de auditieve zintuig geven, bestaande uit de in mechanisch sensorische transductie HK's en de bijbehorende SC.

In zowel het kuiken en muizen, gehoororgaan sensorisch voorlopercellen celcyclus exit en HC differentiatie komen in tegengestelde gradiënten. In kuiken, auditieve progenitor celcyclus exit begint rond ~ E5 en vordert van de basis naar de top en van het centrum naar de periferie 6. Eén dag later, HC differentiatie begint de apex en zich ontwikkelt tot de basis 7. Het bestuderen van de ontwikkeling van het binnenoor van kip heeft vele technische voordelen als functionele mechanismen kunnen worden onderzocht met relatief gemak in ovo tegenover manipuleren van embryo's in de baarmoeder in andere modelsystemen die complexe operaties vereist. De hier beschreven methode gebruikt in ovo micro-elektroporatie genen van belang richten in de vermoedelijke basilar papilla gebied anterior-ventraal in de otic blaasje specifiek op E4.

Elektroporatie in ovo is een techniek die goed ingeburgerd en veelgebruikte 8-14. Het principe van de electroporatie techniek is gebaseerd op het feit dat nucleotiden (bijvoorbeeld plasmide-DNA, synthetisch DNA of RNA oligonucleotiden) negatief geladen zijn. Het DNA wordt geïnjecteerd in het weefsel van belang. Wanneer een elektrische stroom wordt geplaatst in het weefsel, de huidige opent tijdelijke poriën in de celwanden en maakt de opname van het DNA, als negatief geladen DNA stroomt naar de positieve elektrode (anode). Voor gain-of-function experimenten worden genen van belang gewoonlijk gekloneerd in expressieplasmiden die geschikt expressiecassettes voor groen fluorescerend eiwit (GFP) of rood fluorescerend eiwit (RFP) bevatten. Voor loss-of-function experimenten plasmide gebaseerde dominant negatief repressor constructen, of RNAi, of morfolino constructen commonly gebruikt 15,16. Om microRNA (miRNA) functie miRNAs spons constructen, die typisch gebaseerd plasmide remmen, kan worden gebruikt 17. De hier beschreven werkwijze maakt het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die de proliferatie en differentiatie regelen in het auditieve orgaan, zoals de in ovo micro-elektroporatiewerkwijze gemakkelijk met in ovo celproliferatie assay kan worden gecombineerd door toevoeging EDE het hele embryo.

De elektroporatie en toevoeging van EDU wordt uitgevoerd bij E4 in het otische vesikel, één dag voor het begin van celcyclus exit in het auditieve orgaan. Analyse van het gehoororgaan is meestal uitgevoerd 18-96 uur na elektroporatie bij E5 (aanvang van zintuiglijke voorlopercellen celcyclus exit), E6 (begin van de HC differentiatie), en E7 (bij HC differentiatie); en later tot ~ E9 (einde van HC differentiatie). Dit elektroporatie methode van genoverdracht is van voorbijgaande aard blijvende ongeveer ~ 4 dagen, because de genen van belang niet integreren in het genoom, maar de methode is toepasbaar voor gebruik met geschikte plasmide-DNA-expressievectoren, die wel de mogelijkheid om te integreren in het genoom, zoals Tol2 gemedieerde genoverdracht 11. Met deze methode robuuste GFP of RFP expressie duurt ~ 4 dagen in het slakkenhuis, waarna wijzen de signalen vervagen, maar toch zorgen voor een ruime tijd venster naar de ingewikkelde ontwikkeling van het gehoororgaan te bestuderen. Dit in ovo genoverdracht werkwijze is nieuw en maakt specifiek te richten de vermoedelijke gehoororgaan in E4, die optimaal is voor onderzoeken die gericht zijn op HC ontwikkeling in het auditieve orgaan. Het is een goede aanvulling op alternatieve werkwijzen die elektroporatie bij veel jongere ontwikkelingsstadia 11,12 of vergelijking met het gebruik van in vitro basilaire papillae explantkweken 18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De eieren en unhatched embryo's worden verzorgd en ethisch en humaan behandeld. Alle protocollen voor unhatched embryo gebruik werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite aan de Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, Maryland.

1. Eieren en Voorbereiding van de expressieconstructen

  1. eieren:
    1. Incubeer 3-4 dozijn bevruchte kippeneieren (Gallus gallus) plat op hun zij bij 37 ° C.
      1. Na 24 uur incubatie, trekken 3 cc eiwit met een spuit uit de ronde achterkant van het ei en het boorgat afdicht met doorzichtige tape. Hierdoor ontstaat een luchtkamer tussen de embryo en de eierschaal, waardoor gemakkelijke toegang tot de embryo zonder embryo kleven aan de schaal bij het ​​snijden van het venster om toegang bovenop het ei 19.
      2. Bij 117 uur van de incubatietijd, stadium de embryo volgens Hamburger en Hamilton 20 ontwikkelingsstadiabij E4 (HH24-25) (zie figuur 1D).
  2. Expressieconstructen:
    1. Bereid het plasmide DNA met behulp van reagentia en het protocol van de fabrikant van een commercieel verkrijgbare kit preparaat. Bij de laatste stap van de bereiding, elueren de DNA in 500 ui TE (Tris-EDTA) buffer die in de kit in een 1,5 ml buis.
    2. Ethanol precipiteren van het DNA te concentreren door toevoeging van 50 pl 3 M natriumacetaat en 1 ml 100% ethanol aan de buis. Plaats de buis bij -20 ° CO / N.
    3. Centrifugeer de buis gedurende 30 minuten bij 14.000 rpm bij 4 ° C. De bovenstaande vloeistof en lucht-droog de pellet gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Los het pellet in 15 ui TE-buffer, waarbij een concentratie van ~ 4 ug / ul moet opleveren.
      Noot: De expressieconstructen hier gebruikte PME-IRES-GFP 10, die wordt aangedreven door een kip β-actine promoter of pCI-H2B-IRES-RFP 10, die wordt aangedreven door de CMV promoter.

2. Kip In Ovo Micro-elektroporatie en In Ovo Cell Proliferation Assay

  1. In Ovo Micro-injectie van Expression Construct en Micro-elektroporatie:
    1. Trek de glazen capillaire buizen in fijne naalden met behulp van een micro-pipet trekker met de volgende geoptimaliseerde parameters voor een 2,5 x 2,5 mm Box Platinum Verwarming Filament: Druk = 500, Heat = 600 ° C, Pull = 64, Velocity = 105, en Time = 150 msec (zie tabel 1).
    2. Stel de linker- en rechter-handed micro-manipulator stadia aan weerszijden van de microscoop (zie figuur 1A). The Right-handed micro-manipulator houdt het glas capillaire naald en de linkshandige micro-manipulator houdt de elektroden (Figuur 1A).
    3. Bereid de fijn getrokken glazen capillaire naald voor micro-injectie door te snijdende punt van de naald met een tang tijdens het werken onder de microscoop.
    4. handmatig vullen van de naald met de hand met het micro-manipulator met 2,5 pi plasmide-DNA gekleurd met 0,1% Fast Green tijdens het werken onder de microscoop.
    5. Leg het ei liggend op zijn kant in een mal / ei vasthoudinrichting (zie figuur 1A). Snijd een rond venster bovenop het ei met een schaar 19 (Figuur 1A).
    6. Tijdens het werken onder de microscoop, voorzichtig openen de twee membranen overlappen het embryo met behulp van een tang.
    7. Tijdens het werken onder de microscoop, levert ongeveer ~ 0,5 pi plasmide-DNA naar rechts otische vesikel lumen door micro-injectie handmatig met de rechterhand met de micro-manipulator en door micro-elektroporatie.
      1. Hiertoe, micro-injecteren rechts otic vesicle lumen met het DNA met de rechterhand micro-manipulator (Figuur 1B-D), terwijl tegelijkertijd met de linkerhand holdinga pincet aan het hoofd van het embryo te stabiliseren, omdat het hoofd van het embryo dips in fase E4. Niet micro-injecteren langs de otic blaasje lumen, omdat dit de otic blaasje zal beschadigen.
      2. Onmiddellijk na micro-injectie, terwijl het werken onder de microscoop, gebruik dan de linkerhand micro-manipulator met de positieve (anode) 2 mm platina-elektrode anterior-ventrale naar rechts otic blaasje en de negatieve 2 mm elektrode (kathode) in parallel te plaatsen 1 mm van elkaar (zie Figuur 1 C). Lever 4 pulsen op 12 V met 100 msec duur en 200 msec afstand. De linker otische vesikel dient als interne onbehandelde controle.
        LET OP: Maak de elektroden tussen electroporations met een wattenstaafje gedoopt in 1x PBS.
  2. In Ovo Cell Proliferation Assay:
    1. Onmiddellijk na elektroporatie voeg 50 ul van 0,25 mg / ml Edu in 1x PBS door de 50 ul EDE oplossing handmatig laten vallen op de heleembryo in ovo met een pipet. Verzegel de eieren met tape en terug naar de incubator gedurende 18-96 uur.
    2. Verwijder voorzichtig de tape en controleer de embryo's voor fluorescentie GFP of RFP signaal binnen de otic blaasje na 18-24 uur met behulp van een standaard fluorescentie microscoop (zie figuur 1 EE '). Als fluorescent signaal aanwezig is, op dit moment de oogst van de embryo's voor analyses en verzegelt met tape en terug te sturen naar de incubator voor het oogsten en analyses in een later stadium (zie figuur 1 FP '').
      OPMERKING: Expressie van GFP signaal met het PME-IRES-GFP-construct blijkt 6-7 uur na elektroporatie 10.

3. Embryo Oogsten en Tissue Processing voor RNA in situ hybridisatie en immunohistochemie

  1. Oogst de embryo behulp van een tang. Spoel de embryo in koude 1x PBS. Verwijder de hoofden van de embryo's, door te snijden het hoofd van zijn nekbehulp van een tang en plaats de koppen in 4% paraformaldehyde O / N bij 4 ° C. Doorboord hersenen met behulp van een tang om de penetratie van de 4% paraformaldehyde in het hoofd toe.
  2. Dehydrateer de koppen in 30% sucrose (in 1x PBS) O / N bij 4 ° C.
  3. Monteer de hoofden in cryobeschermende medium door snel invriezen in een suspensie van droog ijs en methylbutaan (2-methylbutaan). U kunt ook een snelle bevriezing van de hoofden in cryobeschermende medium met vloeibare stikstof. Bewaar de gemonteerde koppen bij -80 ° C.
  4. Cryosectie de koppen in 12 pm dikke coupes en het verzamelen van alle innerlijke-ear die weefsel secties op superfrosted microscoop glasplaatjes.
  5. Voeren standaard RNA in situ hybridisatie en immunohistochemie zoals hierboven beschreven 4,21 en analyseren EDU celproliferatie volgens het protocol van de fabrikant van de kit.
    LET OP: Haar cellen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van konijnen polyklonaal α-MyosinVIIa (Myo7a) eentibody (1: 1000, Proteus Biosciences) en fluorescentie-gemerkt secundair antilichaam (1: 250, geit anti-konijn AlexaFluor 488, Invitrogen).

4. Fotolader en Verwerking

  1. Neem beelden met digitale imaging apparatuur. Afbeelding immunohistochemie resultaten met een standaard fluorescentiemicroscoop en de resultaten van de in situ met een standaard wide-field microscoop (van 5x tot 40x in vergroting).
  2. Verwerk de beelden met behulp van software voor beeldverwerking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bij deze werkwijze paper plasmide-DNA bestaat uit groene fluorescent eiwit (GFP) expressiecassettes werd gericht in de ontwikkelende kippenembryo basilaire papilla (BP) met geoptimaliseerde parameters van 12 V en 4 pulsen van 100 msec pulsduur en intervallen van 200 msec, hetgeen een ~ 50% embryo overleving en de efficiëntie van plasmide-DNA te richten in het BP. Fluorescente beeldvorming van natief GFP expressie in ontwikkelende embryo's vertoonden deze wijze van elektroporatie voor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier beschreven werkwijze in ovo micro-elektroporatie is geoptimaliseerd voor genoverdracht naar de ontwikkeling auditieve orgaan. Het is compatibel met plasmide-DNA-expressievectoren doorgaans gebruikt om genfunctie / expressie manipuleren. De timing van elektroporatie op E4 optimaal voor onderzoeken die gericht zijn op HC ontwikkeling in het auditieve orgaan. De meest kritische stappen worden micro-injecteren van de DNA in de otic vesicle lumen zonder te diep met de naald en beschadiging van de otic blaasj...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Dr. Doris K. Wu voor expressie plasmiden en in situ sondes, de Johns Hopkins University Center for Sensory Biologie imaging faciliteit en het Centrum voor gehoor en evenwicht. Dit werk werd ondersteund door NIDCD Grant T32 DC000023 LE

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sterile 1x PBS pH 7.4gibco10010-023
Fast Green FCF PowderSigmaF7252-5G
EdU PowderInvitrogenE10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging KitInvitrogenC10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)Qiagen12643
ECM 830 ElectroSquarePorator BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable KitBTX Harvard Apparatus45-0216
Rechtshandige & Linkshandige MicromanipulatorsWorld Precision Instruments Inc. M3301R & M3301L
Twee 12 mm Magnetische Houder Stages met 7 inch verticale potenWorld Precision Instruments Inc. M10
Metalen stalen bodemplaat 12x24 inchWorld Precision Instruments Inc. 5479
Scharen voor Eieren 12 cm lang gebogen, 12 mm extrafijne messen; VeerscharenWorld Precision Instruments Inc. 14120
Micropijptrekmachine voor het trekken van naaldenSutter Instrument Co.P-97
2.5x2.5 mm Box Platina VerwarmingsdraadSutter Instrument Co.
Glazen Capillaire Buizen/Naalden/Zonder Vezel/Borosil 1 mmFHC27-30-0
Hamilton Glazen Spuit 100 μlHamilton80601 Model 710LT
Mineraal Olie (Zwaar) voor Hamilton Glazen SpuitFisher ScientificO122-1
Polyethyleen Slang voor het verbinden van de Glazen Spuit en Glazen Capillaire Naalden/ Niet-ToxischBecton Dickinson and Company (BD)427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc WegwerpspuitenBecton Dickinson and Company (BD)309657
Wegwerp 21 Gauge NaaldenBecton Dickinson and Company (BD)305122
Eén paar 2 mm Platina ElektrodenBulldog Bio. / NepageneCUY611P3-2
Elektrode HouderBulldog Bio. / NepageneCUY580
Eén paar Dumont fijne pincetten nummer 5Fine Science Tools (FST)
Mat finish onzichtbaar plakband voor het afdichten van eierenOffice Depot520-928
Wattenstaafjes met katoenFisher Scientific23-400-101
Steriele filtertips

Referenties

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
  3. Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
  4. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
  5. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
  6. Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
  7. Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
  8. Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
  9. Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050(2008).
  10. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
  11. Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
  12. Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
  13. Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871(2012).
  15. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
  16. Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
  17. Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
  18. Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. , e306(2007).
  20. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
  21. Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
  22. Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

In ovo electroporatiemicroinjectietechniekEdU proliferatieassayGFP expressieplasmideRNA in situ hybridisatietargeting van de otische vesikelsensorische progenitorcellenhaarceldifferentiatieembryonale dag vier
Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.