Method Article

Receptor Autoradiografie Protocol voor de gelokaliseerde Visualisatie van Angiotensine II-receptoren

DOI:

10.3791/53866

⸱

June 7th, 2016

 ,  ,  , 
1Farquhar College of Arts and Sciences, Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Nova Southeastern University, 3School of Medicine, University of Colorado

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om de lokalisatie van angiotensine II Type 1 receptoren in de hersenen van ratten te beschrijven door kwantitatieve, densitometrische, in vitro receptor autoradiografie met behulp van een jodium-125 gelabeld analoog van angiotensine II.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft receptor bindende patronen voor angiotensine II (Ang II) in de rattenhersenen met een radioligand specifiek voor Ang II receptoren receptor autoradiografische mapping uitvoert.

Weefselmonsters geoogst en opgeslagen bij -80 ° C. Een cryostaat wordt gebruikt om coronaalwaarts sectie van het weefsel (hersenen) en dooi-mount de secties op geladen dia's. De slide gemonteerde weefselcoupes worden uitgebroed in 125 I-SI-Ang II naar Ang II receptoren radioactief te merken. Aangrenzende glijbanen zijn gescheiden in twee groepen: "niet-specifieke binding (NSP) in aanwezigheid van een receptor verzadigende concentratie van niet- radioactief gemerkt Ang II, of een AT 1 Ang II receptor subtype (AT 1 R) selectieve angiotensine II receptorantagonist en 'totale binding' zonder AT 1 R antagonist. Een verzadigende concentratie van 2 Ang II receptor subtype (AT 2 R) antagonist (PD123319, 10 uM) is ook aanwezig in de incubatiop buffer te beperken 125 I-SI-Ang II binding aan de AT 1 R subtype. Gedurende een 30 min pre-incubatie bij ~ 22 ° C, NSP objectglaasjes worden blootgesteld aan 10 uM PD123319 en losartan, terwijl 'de totale binding' objectglaasjes worden blootgesteld aan 10 uM PD123319. Objectglaasjes worden vervolgens geïncubeerd met 125I-SI-Ang II in aanwezigheid van PD123319 voor 'totale binding' en PD123319 en losartan voor NSP in assay buffer, gevolgd door verscheidene "wassingen in buffer, water en zout en niet- verwijderen specifiek gebonden radioligand. Droog de glaasjes gebruikt blow-drogers, vervolgens blootgesteld aan autoradiografie film met een speciale folie en cassette. De film wordt ontwikkeld en de beelden worden gescand in een computer voor visuele en kwantitatieve densitometrie behulp van een eigen imaging-systeem en een spreadsheet. Een extra set van dia's worden thionine-gekleurd voor histologische vergelijkingen.

Het voordeel van autoradiografie receptor is de mogelijkheid om te visualiserenAng II receptoren in situ binnen een sectie van een weefselspecimen en anatomisch bepalen het gebied van het weefsel door het te vergelijken met een aangrenzend histologische referentiesectie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hart- en vaatziekten nog steeds de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit in de Verenigde Staten, waardoor meer dan 30% van de sterfgevallen in de VS in 2011 1. De meest recente statistieken van de American Heart Association geven aan dat meer dan één op de drie mensen heeft één of meer typen van cardiovasculaire ziekte. Cardiovasculair onderzoek blijft stappen te maken tegen het begrijpen van deze ziekte, maar als de generaties beginnen ouder is het noodzakelijk om deze inspanningen voort te zetten. Het renine-angiotensine systeem (RAS) speelt een centrale rol in de regulatie van het cardiovasculaire systeem voornamelijk door het bevorderen atherosclerose, ontsteking, systemische vasoconstrictie en activatie van het sympathische zenuwstelsel (figuur 1) 2-8.

RAS is een hormonaal systeem dat wordt geactiveerd wanneer juxtaglomerulaire cellen in de nier scheiden renine in de bloedstroom in reactie op verlaagde bloeddruk, verhoogde sympathetic stimulatie, of verlaagd natrium stroom door de macula densa. Renine metaboliseert angiotensinogeen (gesynthetiseerd in de lever) op angiotensine I (Ang I) te vormen. Ang I wordt vervolgens gemetaboliseerd door angiotensine omzettend enzym (ACE), een ecto-enzym aan de luminale zijde van vasculaire endotheliale cellen, voornamelijk in de longen en de nieren, in angiotensine II (Ang II), de belangrijkste effector RAS peptide te vormen. Ang II kan activeren twee receptorsubtypen; type 1 receptor (AT 1 R) en type 2 receptor (AT 2 R), welke beide het cardiovasculaire systeem reguleren, onderhouden vocht en elektrolyten homeostase en wordt nu beschouwd als cognitieve functies en neurodegeneratieve ziekten beïnvloeden verwerkt 8,9. Een lokale, brain-specifieke RAS wordt gemeld om zelfstandig te synthetiseren Ang II. In de hersenen, wordt het precursoreiwit angiotensinogen gesynthetiseerd in astroglia 10 omgezet Ang I een renine enzym 3, eventueel prorenin gebonden aan de receptor prorenin11, en ​​vervolgens omgezet in Ang II-ACE die overvloedig op het extracellulaire oppervlak van neuronen tot expressie wordt gebracht in de hersenen 12. Dit intrabrain gegenereerd Ang II is de agonist voor de hersenen AT 1 en AT 2-receptoren die worden geïsoleerd uit bloed overgedragen Ang II.

Terwijl de AT 1 R een belangrijke fysiologische rol speelt, is beter bekend om de pathofysiologische effecten in het lichaam, vooral die de cardiovasculaire systeem en de nieren (afbeelding 2). Wanneer Ang II aan de AT 1 R bindt, veroorzaakt vasoconstrictie; toenemende weerstand tegen de bloedstroom en de bloeddruk te verhogen. Het bevordert ook de synthese en uitscheiding van aldosteron en vasopressine, leidt tot verhoogde natrium- en waterretentie. Deze effecten kunnen induceren ischemische hersenschade en cognitieve stoornissen die verband houdt met de ziekte van Parkinson, ziekte van Alzheimer en Diabetes, alsmede zijn recent geïdentificeerd beïnvloeden leren en geheugen 13-15. Er is een terugkoppellus in het RAS, dat AT 1 R op de juxtaglomerulaire cellen in de nier remt renine secretie. Interessant is dat de AT 2 R algemeen tegen regelt de werking van AT 1 R, waardoor vasodilatatie, neurietuitgroei, axonale regeneratie, anti-proliferatie en cerebroprotection onder vele anderen 16-20. De AT 2 R is ook geïdentificeerd als een doelwit voor anti-hypertensie en recent, antikankergeneesmiddelen 21. Het bepalen van de lokalisatie en concentratie van Ang II receptoren in verschillende weefsels en hoe ze worden beïnvloed door verschillende behandelingen en ziektetoestanden met behulp van kwantitatieve densitometrische receptor autoradiografie helpt onthullen de rol speelt in de RAS specifieke ziekten.

Receptor autoradiografie is gebruikt voor meer dan 30 jaar als een effectieve methode voor het aangeven van de aanwezigheid van angiotensine II receptoren en andere componenten van de RAS in de hersenen en andere weefsels van de rat, muis, cavia, hond en mens onder verschillende experimentele omstandigheden 22-34. Het belang van het vinden Ang II receptoren in de hersenen is dat één functionele neuroanatomy kunnen toepassen op de werking van angiotensine II in de hersenen, bijvoorbeeld de aanwezigheid van AT 1 R in de paraventriculaire kern van de hypothalamus (PVN) suggereert een functie van Ang II in de hersenen vasopressine, oxytocine of corticotropine releasing hormoon (CRH) afgifte of activering van het sympathische zenuwstelsel stimuleren. Aldus geneesmiddelen die de AT 1 R blokkeren kunnen sommige PVN gemedieerde effecten geassocieerd met overactiviteit van de hersenen RAS verlagen. Werk in uitvoering suggereert dat het gebruik van AT 1 R-antagonisten Post-Traumatische Stress Stoornis (PTSS) geïnduceerde afgifte van CRH kan verminderen en verbeteren van de symptomen van PTSS (Hurt et al., Ingediend voor publicatie). De PVN, subfornicaleorgel (SFO), en de amygdala zijn bekend voor de regulering van homeostase, honger / dorst, slaap, geheugen, emotionele reacties, en zijn de doelgebieden van deze demonstratie studie. Deze gebieden werden onderzocht door het verzamelen van coronale secties van hersenen op microscoopglaasjes, en behandelen van de secties met specifieke remmers samen met een specifiek radioligand voor Ang II receptoren. In deze studie, alle materialen en reagentia met voorgestelde leveranciers staan, jodium-125 werd gebruikt om een angiotensine II receptor antagonist, sarcosine 1, isoleucine 8 Ang II (SI Ang II), dat vervolgens werd gezuiverd zoals de mono 125I radioactief te -SI Ang II onder toepassing van HPLC methodes zoals eerder 35 beschreven. Het gebruik van deze hoge specifieke activiteit radioligand maakt de visualisatie van gebieden van lage, matige en hoge receptordichtheid na blootstelling van de radioactief gemerkte secties röntgenfilm. Door het kalibreren van de film met de hersenen plakken normen die bekende hoeveelheden jodium-125, het specifieke bedragvan Ang II receptor binding in een gebied kunnen worden gekwantificeerd. In experimentele studies, kunnen de angiotensine II receptor binding in de hersenen van proefpersonen worden vergeleken met die in de hersenen van controlepersonen. Dit kan aangeven of het optreden van Ang II worden gewijzigd als reactie op een genetische aandoening, fenotypische afwijking, ziekte of behandeling met geneesmiddelen. Deze kennis kan vervolgens worden toegepast op de ontwikkeling van therapieën voor ziekten geassocieerd met ontregeling van het RAS behandelen. Alternatieve technieken receptorbindingsplaatsen identificeren, maar met beperkte anatomische resolutie, bindingsonderzoeken die weefselmembraan preparaten uit weefsel homogenaten, die zijn geïncubeerd met het radioligand over een bereik van concentraties radioligand bindingsaffiniteit als de dissociatieconstante beoordelen gebruiken (KD ) en maximaal bindingsvermogen (B max) van het weefsel van belang.

De hier beschreven protocol kunnen worden onderverdeeld in 5 grote components: Het voorbereiden van coupes voor Receptor Autoradiography; Receptor Autoradiografie; Film belichting en ontwikkeling; histologie; en Densitometrische Image Analysis.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierlijke procedures voor deze studie uitgevoerd werden in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Nova Southeastern University, 8 e editie (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ).

1. Voorbereiden Tissue Secties voor Receptor Autoradiography

  1. Bij het offer, oogst verse hersenweefsel, en wikkel in aluminiumfolie en plaats in een -20 ° C vriezer zo snel mogelijk. Om de juiste vorm te behouden, plaats de hersenen in de hersenen schimmel die de binnenkant van de schedel simuleert, wikkel in aluminiumfolie en plaats in een - 20 ° C vriezer. Na 30 min, plaats weefsels in een afsluitbare zak en vriezer naar een -80 ° C vriezer voor langdurige opslag.
    1. Haal de bevroren weefselspecimen plaats van de -80 ° C vriezer, en overbrengen in een cryostaat ingesteld op een minimum van -10 ° C en ten hoogste -18 ° C, om te voorkomen ontdooien.
    2. Plaats het monster op het weefsel houder met een glycol en harsbasis inbeddingmedium, Insluiten alleen een klein deel van het monster in het medium. Voor de hersenen, wordt de hersenen verticaal gemonteerd in staat te stellen het snijden in het frontale vlak.
  2. Plaats het weefsel monteren op de microtoom binnen de cryostaat en stevig vast op zijn plaats. Zorgen de linker- en rechterkant van de hersenen dezelfde antero-postero coördinaten en de dorso-ventrale as loodrecht op gebruikte atlassen hersenen.
  3. Gaan knippen op de gewenste dikte (20 um aanbevolen) en ontdooien monteer de secties op objectglaasjes in een verticale richting naar een groter oppervlak van de ruimte in de schuif hebben. Verzamel secties op objectglaasjes in opeenvolgende groepen van vijf, dat wil zeggen de eerste reeks dia gelabeld 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 en 1-5 (figuur 3).
  4. Na het invullen van een reeks dia met secties, laat dia's aan de lucht drogen voor maximaal 1 uur, plaats dan de slides in een plastic dia doos in een zelfdichtende vriezer opbergtas, en bewaar bij -20 ° C.

2. Receptor Autoradiografie

LET OP: De radioactiviteit. Gebruik beschermende kledij om radioactiviteit te behandelen. Verwijdering wordt afhing van vestiging, en moeten richtlijnen te volgen om goed te vervallen (halfwaardetijd 60 dagen) of worden opgepikt door een gecertificeerd bedrijf.

  1. Verwijder de "-1" en "-2" dia's van de belangstelling van de -20 ° C vriezer en monteer in slide grepen (Figuur 5). Monteer de "-1" slides samen voor 'niet-specifieke' behandeling en de '-2' slides voor 'totale' behandeling. 'Niet-specifieke' potten zal 10 pM uiteindelijke concentraties van PD123319 een bevatten AT 2 R-antagonist, en losartan een AT 1 R-antagonist, in testmedium buffer (AM5) (tabel 1), de 'totale' binding potjes bevat alleen 10 uM PD123319 in AM5.
  2. Keren de diagrepen de dia's in het pre-incubatie Coplin potten gevuld met 35-40 ml AM5 en respectievelijke inhibitoren plaats gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Begin volgende sets hun voorincubatie bad bij 4 min intervallen.
  3. Onmiddellijk overdracht dia's uit de pre incubatieoplossing de incubatie slide mailers gemaakt met 10 ml AM5, plus een vooraf bepaalde concentratie van 125I-SI-Ang II (berekend figuur 4) met de respectieve remmers gedurende 60-90 minuten bij kamertemperatuur temperatuur. Bij voldoende radioligand, kunnen 10 slides worden geplaatst (rug aan rug) in gewijzigde Preparaathouders en geïncubeerd met 125I-SI-Ang II Coplin potten.
  4. Plaats schuift terug in de slede grepen (indien nodig), blot en spoel onder voorzichtig schudden gedurende 1-2 seconden in 400 ml gedestilleerd water in twee afzonderlijke houders.
  5. Breng de dia achtereenvolgens in vier Coplin potten met 35-40 ml AM5 gedurende precies 1 min ieder (zie figuur 4 </ Strong>).
  6. Na de laatste 1 min spoelen, zachtjes swirl de secties voor 1-2 sec in vier veranderingen in ijskoud gedestilleerd water.
  7. Föhnen van de dia's met koele lucht (Let op: hete lucht volatizes de radioactieve stof) met behulp van vier föhn opgezet vanuit verschillende hoeken voor 4 min (Figuur 5), totdat alle onderdelen droog zijn, plaats dan op een papieren handdoek.
  8. Mount dia's met de weefsels naar boven op een karton voor bijstelling naar X-ray film met behulp van dubbelzijdig plakband.
  9. Mount tenminste één, 125 Jodium kalibratiestandaard dia op elk karton (figuur 6).
    Opmerking: Kalibratienormen bestaan ​​uit de hersenen pasta grondig gemengd met 125 Jodium gebonden aan een verbinding die een fenol ring, verdicht door centrifugatie in een 1 ml tuberculine spuit, dat cryostaat coupes dezelfde dikte als de hersencoupes en ontdooien gemonteerd op microscoop slides. Als alternatief, 125 ik kalibratie normenkunststofhars coupes 20 urn dikte kan commercieel verkregen worden. De kunststof hars in deze normen beschermt gedeeltelijk de film uit de straling zodanig dat een weefsel gelijkwaardigheid van ~ 40% moet worden verwerkt in de kalibratie.

3. Film Exposure and Development

  1. Overgaan tot een donkere kamer met een strap-back röntgencassettehouder en autoradiografie film. Open de cassette en plaats het karton met glijbanen binnen (figuur 6).
    1. Doe het licht uit en zet de safelight. Open voorzichtig de doos van X-Ray film, verwijder dan één film, en plaats de film glanzende zijde naar boven (met de scherpe rand aan de rechterbenedenhoek) op de top van de dia's in de cassette. Sluit voorzichtig de cassette, en draai de vergrendeling bars voor het afdichten van het licht (Figuur 6). Expose de dia's voor enkele dagen tot enkele weken bij -20 ° C.
  2. In de donkere kamer, opent u de cassette en door te gaan met de film ontwikkelen process.
    1. Zet de objectglaasjes in de bakken na elkaar; ontwikkelaar 2 min, water dat 5% ijsazijn gedurende 30 sec, en fixeer 5 min. De films worden de geplaatst in een bak met stromend water gedurende 20 min, vervolgens in Photoflo niet langer dan 10 seconden en hing.
      Opmerking: De belichtingstijd wordt empirisch bepaald en kan meerdere films met verschillende belichtingstijden omvatten: lang genoeg om meetbare signalen uit gebieden met lage bindingsaffiniteit te verkrijgen, maar niet zo lang dat de film verzadigen door gebieden met een hoge bindingsaffiniteit. Zodra aanvaardbare risico's worden verkregen, ga dan naar de volgende stap.

4. Histologie

  1. Bereid de thionine vlek en kleurstoffen (tabel 2, figuur 7).
    1. Plaats de "-3" in de slede-rek en overschrijving volgorde beginnend met gedemineraliseerd water gedurende 1 min, vervolgens thionine vlek gedurende 10 minuten gevolgd door drie onderdompelingen in Deionized wateren, en een 30 sec wassen in gedemineraliseerd water.
    2. Naar aanleiding van het water, plaats de dia rek in ethanol wast als volgt; 50%, 70% en 90% gedurende 30 seconden, gevolgd door twee wasbeurten ethanol bij 100% gedurende 1 min elk. Tenslotte zet de schuif rek in xyleen gedurende 3 min, vervolgens over naar een tweede xyleen oplossing gedurende 5 min.
  2. Verwijder een dia in een tijd van de laatste xyleen bad, en hebben betrekking op de bovenste rand van de dia met een hars base in een organisch oplosmiddel montage medium, en plaats een 24 mm x 60 mm dekglaasje op de dia. Laat dia's voldoende droog voor ~ 48 uur en vervolgens te scannen naar de computer op 2400 dpi grijstinten.

5. Densitometrische Beeldanalyse

  1. Plaats de film glimmende kant naar beneden, met de scherpe rand aan de linker onderhoek en scannen met behulp van een eigen scanner in staat is het verzenden van de informatie film dichtheid zonder enige vervorming in de imaging-systeem computer.
  2. Open de eigen beeldvorming system en gebruik maken van de kalibratie bars om de kalibratie normen vast te stellen voor toekomstige densitometrische analyse van de beelden op de film (figuren 9-12).
  3. Maatregel gebieden van belang door ofwel de oprichting van een sjabloon of empirisch waarin de gebieden van belang. De gegevens worden verzameld en de gescheiden op basis van film, ofwel controle of wild-type (sectie), en de regio. Zorg ervoor dat de dichtheid (fmol / g), scan-gebied, en de totale doelgebied in de metingen omvatten (Figuur 9).
    1. Pas scangebied bars door ervoor te zorgen dat de regio van belang valt tussen parameters van aandacht voor (Figuur 10).
    2. Exporteer gegevens in een spreadsheet (tabel 4). Vermenigvuldig de dichtheid maal de totale doelgebied, dan delen door het scangebied om de waarde voor de binding van die specifieke gebied te verkrijgen. Zodra dit is gedaan om alle waarden gemeten, substraat de gevestigde niet-specifieke van total tot de specifieke binding p opleverenkwalijk. Gemiddelden kan ook worden uitgevoerd voor deze waarden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het overzicht van de metabole route van het renine-angiotensine-systeem is getoond in figuur 1 en de directe aandacht voor de angiotensine II-receptor subtypen (AT1 R en AT 2R) is beschreven in figuur 2. Figuur 3 toont de overdracht van coronale hersenen delen op microscoopglaasjes, die vervolgens worden geleid door een receptor autoradiografie werkwijze volgens een vooraf bepaalde 125I-siang II concentra...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschreven identificeert de visualisatie van "totale" en "niet-specifieke" binding van de radioligand in aangrenzende secties van coronale secties van een knaagdierhersenen eerder geoogst en opgeslagen bij -80 ° C, en kan goed toepasbaar op vrijwel elk weefsel dat heeft anatomisch opgelost substructuren die differentiële bedragen van receptoren of radioligand bindende websites. De beschreven binnen het protocol procedures zijn eenvoudig en de analyse is van cruciaal belang voor de juiste...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Robert Speth heeft antilichamen voor angiotensine II-receptoren in licentie gegeven aan een commerciële leverancier en ontvangt royalty's van de verkoop van genoemde antilichamen. De andere auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NIH Grant HL-113905

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
500 ml Plastic BeakersFisher02-591-30
24 mm x 60 mm CoverslipsFisher22-050-25
Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cmCarestream-Biomax MR Film891-2560
Bacitracin (van Bacillus licheniformis)SigmaB-0125
Kartonplaat 8 x 11Crescent Illustration Board #201201
Coplin PottenFisher ScientificE94
Commerciële haardrogersConairModel SD6X
Enkelvoudig te gebruiken kweekbuisjesFisher14-961-26
EDTA (Dinatriumzout, Dihydraat)USB Corporation15-699
EthanolFisher16-100-210 
Vervangingsformule voor D-19 OntwikkelaarPhotographers Formulary, Inc. 01-0036
Glazuur AzijnzuurFisherA38 SI-212
Histoprep/OCTFisherSH75-125D
Film FixerKodak5160320
Photo floKodak1464502
LosartanFisher/Tocris37-985-0
MCID™ Core 7.0MCIDN/A
NaClFisherS271
Peel-A-Way DiagripsVWR48440-003
PermountFisherSP15-100
PD123319Fisher13-615-0
Premium Charged Slides, Fine Ground EdgePremiere Microscope Slides9308W
125I LigandenPerkin ElmerNEX- 248
125SI-Ang II George Washington UniversityGeradiojodeerd door Dr. Speth
Slide MailersFisher ScientificHS15986
Natriumdibasisch Fosfaat Anhydrous (Na2PO4)FisherRDCS0750500
Natriumacetaat (Anhydrous)FisherBP333-500
Tionine FisherT409-25
X-Ray Casette (10 x 12)Spectronics CorporationFour Square
XYleenFisher X3P-1GAL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
  2. Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
  3. Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
  4. Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U. Frontiers in Neuroendocrinology. Ganong, W. F., Martini, L. , Raven Press. N.Y. Vol. 5 61-99 (1978).
  5. Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, Suppl 5 19-24 (1995).
  6. von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
  7. Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004(2013).
  8. de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
  9. Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
  10. Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
  11. Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635(2012).
  12. Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
  13. Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
  14. Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
  15. Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
  16. Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
  17. Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
  18. Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
  19. Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
  20. Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
  21. Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
  22. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
  23. Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
  24. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
  25. Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
  26. Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
  27. Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
  28. Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
  29. Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
  30. Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
  31. Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
  32. MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
  33. Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
  34. Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
  35. Speth, R. C., Harding, J. W. Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. Wang, D. H. , Humana Press. 275-295 (2001).
  36. Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
  37. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
  38. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
  39. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
  40. Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
  41. Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
  42. Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
  43. Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
  44. Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
  45. Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
  46. Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
  47. Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
  48. Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31(2013).
  49. Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234(2013).
  50. Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Receptor AutoradiographyAngiotensin II ReceptorsBrain Tissue SectioningRadioligand Binding AssayNon Specific BindingTotal BindingCryostat SectioningAutoradiography Film ExposureThionin Histological StainingDensitometry Analysis

Related Articles