Meting van Calcium Schommelingen Binnen het sarcoplasmareticulum van gekweekte gladde spiercellen Met behulp van FRET-gebaseerde confocale Imaging

Samenvatting

Momenteel worden de meeste beschikbare calciumindicatoren gebruikt om cytoplasmatische calciumtransienten te kwantificeren als indirecte maatstaven voor calcium dat vrijkomt uit het sarcoplasmatisch reticulum in gekweekte gladde spiercellen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een specifieke FRET-gebaseerde indicator die directe meting van calciumsignalen binnen het sarcoplasmatisch reticulum lumen mogelijk maakt.

Samenvatting

Het handhaven van stabiele calcium (Ca²⁺) niveaus in het sarcoplasmatisch reticulum (SR) van vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) is essentieel voor hun algehele gezondheid. Een aanzienlijk deel van de intracellulaire Ca²⁺ inhoud wordt aangetroffen in de SR-voorraden in VSMC's. Aangezien het SR het enige intracellulaire orgaan is met een nauwe associatie met de omringende extracellulaire ruimte via plasmamembraan-SR-verbindingen, kan het SR worden beschouwd als de eerste lijn van respons op eventuele onregelmatigheden in Ca²⁺ transients, of stress die de cel ervaart. Onder zijn vele functies, is een van de belangrijkste zijn rol in de overdracht van Ca²⁺-gereguleerde signalen door de hele cel om verdere celbrede reacties stroomafwaarts te induceren. Het gebruik van cytoplasmatische Ca²⁺ indicatoren in dit opzicht is over het algemeen onvoldoende voor onderzoek naar de zeer dynamische veranderingen in de intraluminale SR Ca²⁺ winkel die nog niet volledig zijn gekarakteriseerd. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de directe en duidelijke meting van luminair SR Ca²⁺. Deze tool is nuttig voor onderzoek naar de genuanceerde veranderingen in SR Ca²⁺ die significante effecten hebben op de normale functie en gezondheid van de cel. Fluctuaties in SR Ca²⁺ inhoud kunnen ons specifiek een aanzienlijke hoeveelheid informatie geven over cellulaire reacties op ziekte of stressomstandigheden die de cel ervaart. In deze methode wordt een aangepaste versie van een SR-gerichte Ca²⁺ indicator, D1SR, gebruikt om Ca²⁺ fluctuaties te detecteren als reactie op de introductie van agenten bij gekweekte rat aorta gladde spiercellen (SMC's). Na incubatie met de D1SR indicator, worden confocale fluorescentiemicroscopie en fluorescentie resonantie energie transfer (FRET)-gebaseerde beeldvorming gebruikt om veranderingen in intraluminale SR Ca²⁺ niveaus direct te observeren onder controlecondities en met de toevoeging van agonistische agenten die functioneren om intracellulaire Ca²⁺ beweging te induceren.

Inleiding

Ca2 ⁺ is een belangrijk ion in overvloed in elke cel in het lichaam. Het heeft een belangrijke rol in verschillende cellulaire functies, waaronder groei, proliferatie, migratie en apoptose ^1-4. Het staat vast dat Ca ²⁺ deze processen kunnen beïnvloeden door middel van zowel directe als indirecte acties, en daarom wijzigingen in de normale intracellulaire concentraties van deze ionen kan gemakkelijk leiden tot negatieve gevolgen voor de getroffen cellen. De SR wordt beschouwd als de grootste intracellulaire Ca2 ⁺ opslag binnen de cel ^5. Steady state niveaus van Ca ²⁺ in zowel de SR en cytoplasma worden ....

Protocol

Ethiek statement: Alle experimenten en procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Laboratory Biosafety richtlijnen van de Universiteit van British Columbia, Vancouver, Canada.

1. Bereiding van 35 mm Glass-bottom Cultuur Gerechten voor FRET-gebaseerde confocale microscopie

1. Bereid platen met de volgende procedure 36-48 h voorafgaand aan experimenten.
2. Ophalen gekozen gelatineuze eiwitmengsel en 0,25% trypsine-EDTA van -20 ° C opslag en bewaar ze in de mobiele ijsbad tot gebruik.
   OPMERKING: De coating eiwitmengsel mag alleen bloot tot kamertemperatuur gedurende een korte tijd om te voorkomen dat het mengsel stollen vóór geb....

Resultaten

Deze sectie geeft voorbeelden van de resultaten die kunnen worden verkregen volgens de werkwijze die werd beschreven SR luminale Ca2 ⁺ -concentratie data vastleggen, vergeleken met de gewoonlijk gebruikte wijze van indirect meten van veranderingen in Ca2 ⁺ concentraties organel opslag door het observeren schommelingen in cytoplasmatische Ca2 ⁺ .

Figuur 1A toont een momentopname.......

Discussie

Dit protocol beschrijft de transfectie van VSMCs de D1SR adenovirus Ca2 ⁺ concentraties bestuderen binnen het lumen van de SR. Deze werkwijze maakt het direct meten van Ca2 ⁺ in het organel en zijn beweging naar / uit de SR als gevolg van de toepassing van verschillende calcium bewegende middelen. Deze methode heeft veel voordelen voor onderzoekers werken aan een beter begrip van hoe veranderingen in SR en cytoplasmatische Ca ²⁺ niveaus invloed op de algehele gezondheid van de cellen en .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml	Corning	356230	Bewaar bij -20 °C tot vlak voor gebruik
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Bewaar bij -20 °C tot vlak voor gebruik
35 mm glazen bodemplaatjes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0,2 μM ontluchte blauwe plugafdichtingkolf	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Oplossing	Life technologies	25200056	Bewaar bij -20 °C tot vlak voor gebruik
50 ml Polypropylene Conische Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Bewaar bij -20 °C tot vlak voor gebruik
1,5 ml Zwarte Microcentrifugebuizen	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocale microscoop	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (met FRET SE Wizard applicatie)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.