We presenteren methoden voor de constructie van elektroden om gelijktijdig extracellulaire neurale activiteit op te nemen en meerdere neuroactieve stoffen in de buurt van de opnameplaatsen bij wakkere muizen vrij te geven. Deze techniek maakt de gedetailleerde analyse van veronderstelde lokale synaptische input naar de belangrijke neuron mogelijk.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Extracellulaire van neuronale activiteit Gecombineerd met Microiontophoretic Toepassing van neuroactive stoffen in Awake Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Verschillen in de activiteit van neurotransmitters en neuromodulatoren, en bijgevolg verschillende neurale respons, is beschikbaar tussen verdoofde en wakkere dieren. Daarom werkwijzen waardoor het manipuleren van synaptische systemen in wakkere dieren vereist om de bijdrage van synaptische inputs neuronale verwerking beïnvloed door verdoving bepalen. Hier presenteren we methode voor de constructie van elektroden gelijktijdig extracellulaire neurale activiteit registreren en meerdere neuroactieve stoffen vrijkomt de nabijheid van de opname locaties wakkere muizen. Door het combineren van deze procedures, voerden we microiontophoretic injecties van gabazine om selectief blokkeren GABA A-receptoren in neuronen van de colliculus inferior van het hoofd ingetogen muizen. Gabazine succes gemodificeerde neurale respons eigenschappen, zoals de frequentierespons gebied en stimulus-specifieke afstemming. Zo tonen we dat onze methoden geschikt voor recording enkele eenheid activiteit en voor het ontleden van de rol van specifieke neurotransmitter receptoren in auditieve verwerking.
De belangrijkste beperking van de beschreven procedure is relatief kort is (~ 3 uur), die wordt bepaald door het niveau van gewenning van de dieren aan de opnames. Anderzijds kunnen meerdere opnames worden uitgevoerd in hetzelfde dier. Het voordeel van deze techniek andere experimentele procedures gebruikt om het niveau van neurotransmissie of neuromodulatie (zoals systemische injectie of het gebruik van optogenetic modellen) te manipuleren, dat het effect van het geneesmiddel beperkt tot de lokale synaptische ingangen naar het doel neuron. Bovendien is de maat vervaardiging van elektroden maakt aanpassing van specifieke parameters volgens de neurale structuur en type neuron plaats (zoals de punt weerstand ter verbetering van de signaal-ruisverhouding van de opnamen).
Inleiding
Het samenspel van neurale excitatie en inhibitie van fundamenteel belang is voor de verwerking van zintuiglijke informatie 1. Het is ook bekend dat verdoving een sterke invloed op de dynamiek van corticale activatie en tijdspatroon van synaptische inputs 2,3. Zo is waargenomen dat anesthetica verandert de duur van visueel opgewekte responsen in corticale neuronen 3,4. Bovendien is de verhouding tussen de prikkelende en remmende synaptische inputs is anders in verdoofde en wakkere dieren 4,5, het veranderen van zowel opgeroepen en spontane activiteit tarieven 6,7. Door het meten van de synaptische conductances, Ha....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd bij de Universiteit van Salamanca met de goedkeuring van de uitgevoerd en met behulp van methoden die voldoen aan de normen van de Universiteit van Salamanca Animal Care Committee evenals de normen van de Europese Unie (Richtlijn 2010/63 / EU) voor het gebruik van dieren in de neurowetenschappen onderzoek.
1. Tungsten Elektroden
Opmerking: De vervaardiging wolfraamelektroden is gebaseerd op de originele techniek Merrill Ainsworth en 27 en Ainsworth et al 28 beschreven en uitgevoerd met de inrichting van een werkstation in Bullock et al 17 beschreven.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We namen de single-eenheid activiteit van 4 goed geïsoleerde neuronen van het IC. Typische signaal-ruisverhouding verkregen bij extracellulaire opnames wakker muizen zijn getoond in Figuur 3B. Figuur 4A geeft de frequentierespons gebied (FRA) van elk neuron voor en tijdens de blokkade van de GABAA-receptoren met gabazine. Een toename in de reactie kracht (spikes / stimulus) en een verbreding van de spectrale tuning waargenomen. De toename in d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De microiontophoresis van neuro-actieve stoffen in wakkere dieren is een krachtige techniek sonderen en ontleden de rol van specifieke synaptische ingangen van de activiteit van enkele neuronen 40,41. Nog belangrijker, deze procedure maakt de bepaling van het effect van de neurotransmitters en neuromodulatoren op neurale circuits zonder de mogelijke storing van anesthetica. Hier laten we zien dat de toepassing van gabazine in de IC van wakkere muizen krachtig heeft de frequentie tuning (figuur 4A),
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit project werd gefinancierd door de MINECO verleent BFU201343608-P en PSI2013-49348-EXP, en de JCYL subsidie SA343U14 aan MSM en MRC basisfinanciering aan ARP. YAA hield een CONACyT (216.106) en een fellowship september.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Tungstendraad | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0,005 inch x 3 inch |
| Borosilicaat glas capillair | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicaat standaardwand zonder filament, 1,5 mm OD, 0,86 mm ID, 100 mm lang |
| Multibarrel glas capillairen | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillair, 4 inch lang, 1,2 mm OD, met filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Lichthardende lijm, gebruikt om de wolfraamelektrode aan de glas multibarrel pipet te bevestigen |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Lichthardende lijm, gebruikt om de hoofdpost aan de schedel van het dier te bevestigen |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Lichthardend composiet, gebruikt om de binding van de hoofdpost met de schedel te versterken |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-componenten epoxy, gebruikt om de bevestiging van de wolfraamelektrode aan de glas multibarrel pipet verder te beveiligen | |
| Verwarmingsdeken | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactische frame | Narishige | SR-6N | Gemodificeerd voor muizen |
| Microiontoforetisch apparaat | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Inclusief IP-2 iontoforesepompen (één voor elke medicijnafgifte kanaal) en een balanceermodule |
| Multibarrel glas pipet puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexibele plastic naald, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazin, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Bereiden ~ 1000µl van 20 mM gabazine in gedistilleerd water en pas de pH aan 4 |
Referenties
- Harris, K. D., Thiele, A. Cortical state and attention. Nat Rev Neurosci. 12 (9), 509-523 (2011).
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
- Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
