Gericht op biofilm geassocieerde<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met behulp van Resazurin Gebaseerd Drug-gevoeligheid Assay

Samenvatting

De meeste bacteriële infecties produceren een biofilm. Vanwege hun omgeving zijn biofilm-geassocieerde bacteriën vaak fenotypisch resistent tegen geneesmiddelen. Nieuwe antibacteriële moleculen die bacteriën in biofilms doden, hebben dus een hoge prioriteit. We stellen een test op om snel te screenen op antimicrobiële verbindingen die effectief zijn bij het uitroeien van biofilms.

Samenvatting

De meeste pathogene bacteriën zijn in staat om biofilms te vormen tijdens infectie, maar vanwege de moeilijkheid van het manipuleren en beoordelen van biofilms, wordt het overgrote deel van het laboratoriumwerk uitgevoerd met planktonische cellen. Hier beschrijven we een peg plate-biofilm-assay zoals uitgevoerd met Staphylococcus aureus. Bacteriële biofilms worden gekweekt op pinnen bevestigd aan een 96-wells microtiterplaatdeksel, gewassen door middel van zachte onderdompeling in buffer, en geplaatst in een drug challenge-plaat. Na verdere incubatie worden ze opnieuw gewassen en verplaatst naar een laatste herstelplaat, waarin de fluorescerende kleurstof resazurin dient als levensvatbaarheidsindicator. Deze assay biedt een veel grotere gebruiksgemak, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid, evenals een schat aan gegevens wanneer het wordt uitgevoerd als een kinetische lezing. Bovendien kan deze assay worden aangepast aan een medium-throughput drug screening-benadering waarbij een eindfluorescentie-uitlezing wordt gemaakt, wat een pad biedt voor drug discovery-inspanningen.

Inleiding

Pathogene bacteriën kunnen biofilms in vivo leidt tot niet-acute chronische infecties ¹ vormen. Biofilm geassocieerde infectie is een ernstige risicofactor van medische procedures die de implantatie van vreemde voorwerpen (bijvoorbeeld kunstbot vervangingen, borstimplantaten) of de installatie van tracheale buizen of urine-katheters ² te betrekken. In deze context, anti-infectieuze therapie is vrijwel altijd nodig als biofilm-gebaseerde infecties zelden gewist als zodanig, zelfs bij immuuncompetente individuen. Staphylococcus aureus is een van de meest voorkomende pathogenen betrokken in biofilm-gerelateerde complicati....

Protocol

1. Biofilm Initiatie

1. Grow een cultuur van biofilm produceren organisme in een voedselrijke medium. Inoculeer Staphylococcus aureus stam Newman in 10 ml Mueller-Hinton medium uit een glycerol voorraad. Voer alle werkzaamheden waarbij het ​​hanteren van S. aureus met handschoenen en binnen een bioveiligheid kast.
2. Incubeer gedurende 16 uur bij 37 ° C op een roterende schudinrichting (100-200 rpm).
3. Bepaal de OD ₆₀₀ van de cultuur met behulp van een spectrofotometer en een standaard cuvette (weglengte: 1 cm).
4. Bereken het volume (V) van de cultuur om voorbereidende 20 ml inoculum bij OD _{600 (entmate....}

Resultaten

De resazurin test is gevoelig genoeg om zeer weinig levensvatbare cellen kan repliceren in drug vrij medium na challenge betrouwbaar detecteren. In deze methode, definiëren we de minimale biofilm uitroeiing concentratie als de laagste concentratie waarbij geen resazurin conversie waargenomen binnen 24 uur. De resazurin assay berust op oxidatieve moleculen gevonden in metabolisch actieve cellen die de kleurstof kleur omzetten van blauw naar roze. Kleurstof conversie is dus een indicatie v.......

Discussie

Hier beschrijven we een gemodificeerde biofilm gekwantificeerd door activiteit van geteste remmers op S. aureus biofilms gericht op de metabole toestand van biofilm geassocieerde cellen. Terwijl de beschreven biofilm initiatie en beroepsprocedures veelal nagebootste aanbevelingen van de fabrikant, het gebruik van Resazurin kleurstof-biofilm geassocieerde cellen die een 24-uurs-remmer uitdaging overleven detecteren en te kwantificeren vereenvoudigt volgens de methode van de cel herstel (via waterbad sonificatie).......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Volg de aanbevelingen van de fabrikant
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 medium chelexed gedurende 1 uur met Chelex 100 resin en vervolgens aangevuld met 10% onchelexed RPMI-1640
Chelex 100 Resin	Bio Rad	142-2822
MBEC-platen	Innovotech	19111
Resazurin Sodium Salt	Sigma	R7017	800 µg/ml in DI water     Filter steriel
Micro Plate Shaking Platform	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plate Reader	Biotek
Gen5 software	Biotek		Opname en analyse van resazurin conversie
Neocuproine	Sigma	N1501	bereid 10 mM stock in 100% Ethanol, bewaar bij -80 ºC
Copper sulfate	Acros Organics	7758-99-8	bereid een 100 mM stockoplossing in water, bewaar bij 4 ºC
Cu-Neocuproine	Zelf gemaakt		Gegenereerd door gelijke molariteiten van neocuproine en kopersulfaat te mengen. Mix werd verdund in CRPMI medium tot de gewenste concentratie.
Gentamicin	Sigma	G3632-1G