Gericht op biofilm geassocieerde<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met behulp van Resazurin Gebaseerd Drug-gevoeligheid Assay

Samenvatting

De meeste bacteriële infecties produceren een biofilm. Vanwege hun omgeving zijn biofilm-geassocieerde bacteriën vaak fenotypisch resistent tegen geneesmiddelen. Nieuwe antibacteriële moleculen die bacteriën in biofilms doden, hebben dus een hoge prioriteit. We stellen een test op om snel te screenen op antimicrobiële verbindingen die effectief zijn bij het uitroeien van biofilms.

Samenvatting

De meeste pathogene bacteriën zijn in staat om biofilms te vormen tijdens infectie, maar vanwege de moeilijkheid van het manipuleren en beoordelen van biofilms, wordt het overgrote deel van het laboratoriumwerk uitgevoerd met planktonische cellen. Hier beschrijven we een peg plate-biofilm-assay zoals uitgevoerd met Staphylococcus aureus. Bacteriële biofilms worden gekweekt op pinnen bevestigd aan een 96-wells microtiterplaatdeksel, gewassen door middel van zachte onderdompeling in buffer, en geplaatst in een drug challenge-plaat. Na verdere incubatie worden ze opnieuw gewassen en verplaatst naar een laatste herstelplaat, waarin de fluorescerende kleurstof resazurin dient als levensvatbaarheidsindicator. Deze assay biedt een veel grotere gebruiksgemak, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid, evenals een schat aan gegevens wanneer het wordt uitgevoerd als een kinetische lezing. Bovendien kan deze assay worden aangepast aan een medium-throughput drug screening-benadering waarbij een eindfluorescentie-uitlezing wordt gemaakt, wat een pad biedt voor drug discovery-inspanningen.

Inleiding

Pathogene bacteriën kunnen biofilms in vivo leidt tot niet-acute chronische infecties ¹ vormen. Biofilm geassocieerde infectie is een ernstige risicofactor van medische procedures die de implantatie van vreemde voorwerpen (bijvoorbeeld kunstbot vervangingen, borstimplantaten) of de installatie van tracheale buizen of urine-katheters ² te betrekken. In deze context, anti-infectieuze therapie is vrijwel altijd nodig als biofilm-gebaseerde infecties zelden gewist als zodanig, zelfs bij immuuncompetente individuen. Staphylococcus aureus is een van de meest voorkomende pathogenen betrokken in biofilm-gerelateerde complicaties optreden gedurende het gebruik van invasieve medische hulpmiddelen ^3.

Helaas, de aard van biofilms als een beschermende barrière maakt ze beter bestand zijn tegen de behandeling dan plankton cellen ^1,4, en de evaluatie van de voorspelde klinische werkzaamheid is een cruciaal onderdeel van zowel de initiëlegeneesmiddelontwikkeling en resistentie surveillance. Er is steeds meer erkenning dat laboratoriumomstandigheden, gericht op planktonische culturen, mag niet getrouw vertegenwoordigen real-world ziekte ^5. Verdere compounding het probleem, replicatie van biofilm fenotypes is moeilijk, en de bestaande biofilm modellen zijn vervelend en lijden aan hoge inter- en intra-assay variabiliteit ^6. Zo veel onderzoekers, noodgedwongen uit standaard planktonische celbepalingen drug gevoeligheid, waardoor mogelijk dat daarbij een belangrijk aspect van bacteriële virulentie en ziekte.

Hier beschrijven we het protocol voor het testen van bacteriën, in het bijzonder S. aureus, in pre-biofilms gegroeid onder toepassing van een 96 putjes gebaseerde biofilmsysteem ^7,8. Terwijl het protocol voor de vorming en uitdaging biofilm volgt in wezen de aanbeveling van de fabrikant, presenteren we een alternatieve informatie-rijke methodologie voor het kwantificeren van de levensvatbaarheid van de BIOFilm na challenge. Kort bacteriën worden gekweekt in de penplaat, waarbij biofilms gevormd op de uitstekende pennen bevestigd aan het deksel van de plaat. Na de vorming van biofilm, worden de haringen zachtjes gedoopt in putjes van een nieuwe plaat gevuld met PBS om plankton cellen te verwijderen. De peg-deksel, met biofilms bevestigd, wordt overgebracht naar een nieuwe uitdaging plaat gemaakt met verschillende concentraties antibiotica te testen. Na een tweede incubatie worden deksels weer verwijderd, gewassen en overgebracht naar een plaat die herstel Resazurin kleurstof, waar een laatste incubatie. Resazurin conversie kan kinetisch worden opgenomen of genomen als een eindpunt lezen na een bepaalde herstelperiode. Deze dye-gebaseerde methode voor het kwantificeren van de levensvatbaarheid van biofilms verschilt aanzienlijk van de vervelende CFU (kolonievormende eenheden) count-gebaseerde methode in het oorspronkelijke protocol ⁷ beschreven. OD ₆₀₀ metingen van de drug uitdaging bord en resazurin conversie kinetiek dienen als levensvatbaarheid gelezenouts van planktonische en biofilm cellen, respectievelijk, het aanbieden van een snelle, betrouwbare, informatie-rijke en technisch eenvoudige test voor biofilm te overleven.

Protocol

1. Biofilm Initiatie

1. Grow een cultuur van biofilm produceren organisme in een voedselrijke medium. Inoculeer Staphylococcus aureus stam Newman in 10 ml Mueller-Hinton medium uit een glycerol voorraad. Voer alle werkzaamheden waarbij het ​​hanteren van S. aureus met handschoenen en binnen een bioveiligheid kast.
2. Incubeer gedurende 16 uur bij 37 ° C op een roterende schudinrichting (100-200 rpm).
3. Bepaal de OD ₆₀₀ van de cultuur met behulp van een spectrofotometer en een standaard cuvette (weglengte: 1 cm).
4. Bereken het volume (V) van de cultuur om voorbereidende 20 ml inoculum bij OD _{600 (entmateriaal)} van 0,1 in chelexed Roswell Park Memorial Institute medium (CRPMI) ⁹ met de formule: [V = 20 ml * 0,1 / OD _{600 (cultuur )]}
   Let op: Reference 9 geeft details over CRPMI voorbereiding.
   1. Voeg de berekende kweekvolume (van boven) naar een centrifugebuis en pellet cellen door spinnen gedurende 1 min bij 10.000 x g. om preparre biofilm entstof, zuigen de gebruikte groeimedium en resuspendeer celpellet in 20 ml CRPMI.
5. Giet entstof in een 25 ml reservoir.
6. Haal het deksel van een steriele 96-well peg plaat door recht omhoog te trekken.
   Opmerking: Let erop dat de pennen opknoping vaststelling van het deksel niet te besmetten. De deksel kan ondersteboven op een schone ondergrond binnen een bioveiligheid kast worden geplaatst.
7. Met behulp van een 200 gl multichannel pipet 125 ul inoculum aan elk putje rijen A tot en met G van de bodemplaat.
8. Vul 125 ul steriel CRPMI medium in elk putje van de toer H als een steriliteit controle.
9. Neem de peg-deksel en houd deze boven de plaat bodem met de pinnen naar beneden. Lijn de individuele pinnen met hun respectievelijke putten. Vermijd fysiek contact tussen de plaat en de haringen. Eenmaal uitgelijnd, laat de deksel voorzichtig naar beneden. Vermijd verplaatsingen zoals aanpassingen uitgevoerd nadat de pinnen hebben raakte de bodemplaat kunnen contaminate steriliteit controles in rij H.
10. Sluit de deksel op de plaat met paraffine film verdamping plaats en voorkomen in een afsluitbare kunststof zak, verzegelen goed. Houd het luchtvolume in de zak zo laag mogelijk om verdamping te minimaliseren.
11. Incubeer zonder schudden bij 37 ° C gedurende 48 uur in een _5% CO2 incubator.
    Opmerking: 48 h groei optimale al S. aureus, maar zal variëren op basis van het gebruikte organisme.
    Opmerking: hoewel statische incubatie is een goed uitgangspunt om de test te optimaliseren, zachtjes schudden bij 150 rpm op een microplaat shaker is een mogelijke variatie die biofilm vorming van een aantal S. kan versterken aureus isolaten.

2. Voorbereiding van de biofilm Challenge Plate

1. Op de dag van de biofilm uitdaging een nieuwe 96-well plaat en voeg 100 pl CRPMI, geëquilibreerd tot kamertemperatuur, aan elk putje rijen B tot H te inconsistente resultaten te vermijden, maken gebruik van een 96-well plaat die 200 gl kan bevattenvan media wanneer de pennen zijn binnen, en beschikt putjes met afmetingen gelijk aan die van de biofilm opening plaat.
2. Verdun tot 4 testverbindingen afzonderlijk in 1,0 ml CRPMI de gewenste eindconcentratie 2x, teneinde rekening te houden met een eindverdunning in stap 2,7.
   Opmerking: Een goed startpunt is 8-voudig boven de remmende concentratie van planktonische cellen.
3. Voeg 200 ul van verbinding 1 in putten A1 tot A3, verbinding 2 in putjes A4 tot A6, verbinding 3 in putjes A7 naar de A9 en de verbinding 4 in putjes A10 naar A12.
4. Serieel verdunde testverbindingen door een multichannel pipet overgebracht 100 ul van rij A naar B rij en meng.
5. Op die manier blijft 100 pl dragen tot goed. Meng na elke overdracht en stoppen in rij F.
6. Na mengen verdrijven 100 pi van rij F in een afvalcontainer. Gebruik geen vloeistof over te dragen aan rijen G en H.
7. Voeg 100 ul van CRPMI aan elk putje van de plaat met een multichannel pipetbreng het volume op 200 pi. Zie figuur 1 voor de uiteindelijke plaat lay-out.

3. Biofilm Challenge

1. Voeg 200 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) een nieuwe steriele 96-well plaat wells met afmetingen die gelijk zijn aan die van de biofilm opening plaat kenmerkt.
2. Verwijder de plastic zak en paraffine film van bebroede biofilm initiatie plaat.
3. Til het deksel recht omhoog. contact tussen de pennen en de plaatbodem als dit te vermijden kan de biofilm beschadigen. Houd onderste deel voor verdere OD ₆₀₀ analyse (zie 3.8).
4. Afspoelen plankton cellen door het plaatsen van de pin-deksel op de plaat met PBS (uit stap 3.1). Dompel haringen voor 5 sec, til PBS, en nog een keer onder water, zorg dat u de haringen tegen de put zijkanten niet te raken.
5. Plaats de gespoeld peg-deksel in de uitdaging plaat. Vermijd onnodig contact tussen haringen en bodemplaat, omdat dit schade zal toebrengen aan de biofilm leidt totinconsistente resultaten.
6. Afdichtplaat paraffine folie en plaats in een afsluitbare kunststof zak als beschreven in stap 1.10.
7. Incubeer de plaat zonder schudden gedurende 24 uur bij 37 ° C in een _5% CO2 incubator.
8. Neem onderkant van biofilm initiatie plaat van 3,3. Resuspendeer de bacteriën in elk putje met een multichannel pipet en meet de OD ₆₀₀ met een geschikte microplaat reader groei bevestigen zich in alle putjes maar steriliteitscontrole in rij H.

4. Biofilm Bepaling

1. Gebruik een plaatlezer uitgerust met een incubatiekamer en in staat om kinetische fluorescentie metingen voor het detecteren resazurin conversie. Het opzetten van een 24-uurs kinetische fluorescentie meting met behulp van een 530 nm excitatie en 590 nm emissie.
2. Stel de kamertemperatuur tot 37 ° C en hebben de plaat lees elke 20 min. Zet de plaat reader meten van de bodem van de plaat volgens de instructies van de fabrikantgen.
3. Bereid wassen plaat door het toevoegen van 200 ul PBS met een multichannel pipet naar een steriele 96 wells plaat.
4. Bereid biofilm herstelmedium door toevoeging van 400 pl 0,8 mg / ml resazurine stockoplossing aan 20 ml CRPMI medium tot een uiteindelijke concentratie van 16 ug / ml resazurine.
   Let op: Resazurin is een bekend irriterend voor de huid. Gebruik een laboratoriumjas, veiligheidsbril en handschoenen tijdens het hanteren. CRPMI de biofilm recovery medium werd gebruikt omdat het de laagste achtergrondsignaal, maar kan worden vervangen door Mueller Hinton media indien nodig.
5. Voeg 150 ul van biofilm recovery medium met een multichannel pipet aan elk putje van een verse 96-well plaat.
6. Transfer uitdaging plaat uit incubator in een bioveiligheid kast en verwijder voorzichtig plastic zak en verzegeling film.
7. Verwijder de peg-deksel van de uitdaging plaat en spoel af plankton cellen in PBS, zoals beschreven in 3.4. Houd de onderkant van de uitdaging dienblad daaropvolgende OD ₆₀₀ analysis (zie 4.10).
8. Na het spoelen, plaatst u de pin-deksel in de plaat bodem met de biofilm herstel medium.
9. Wikkel de zijkant van de plaat met paraffine film, zorg dat u de onderkant van de perimeter putten niet te hinderen. Onmiddellijk na het verpakken van de plaat, leg het op de plaat lezer en start een kinetische gelezen over een periode van 24 uur door het initiëren van de eerder gemaakte resazurin kinetische protocol uit stap 4.1.
10. Groei van planktonische cellen die al dan niet optreden tijdens challenge kwantificeren, lees de OD ₆₀₀ van de hele uitdaging plaatbodem met een microplaat reader. Volg de instructies gegeven in stap 3.8.
    Opmerking: Voorzichtig resuspenderen van de inhoud van elk putje en cellen afstoten van de biofilm neiging om te groeien in groepjes aan de bodem van de put. Luchtbelletjes in de put zal sterk beïnvloeden _OD600 metingen en moeten worden vermeden of verwijderd voorafgaand aan het lezen.

Resultaten

De resazurin test is gevoelig genoeg om zeer weinig levensvatbare cellen kan repliceren in drug vrij medium na challenge betrouwbaar detecteren. In deze methode, definiëren we de minimale biofilm uitroeiing concentratie als de laagste concentratie waarbij geen resazurin conversie waargenomen binnen 24 uur. De resazurin assay berust op oxidatieve moleculen gevonden in metabolisch actieve cellen die de kleurstof kleur omzetten van blauw naar roze. Kleurstof conversie is dus een indicatie v...

Discussie

Hier beschrijven we een gemodificeerde biofilm gekwantificeerd door activiteit van geteste remmers op S. aureus biofilms gericht op de metabole toestand van biofilm geassocieerde cellen. Terwijl de beschreven biofilm initiatie en beroepsprocedures veelal nagebootste aanbevelingen van de fabrikant, het gebruik van Resazurin kleurstof-biofilm geassocieerde cellen die een 24-uurs-remmer uitdaging overleven detecteren en te kwantificeren vereenvoudigt volgens de methode van de cel herstel (via waterbad sonificatie)...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Volg de aanbevelingen van de fabrikant
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 medium chelexed gedurende 1 uur met Chelex 100 resin en vervolgens aangevuld met 10% onchelexed RPMI-1640
Chelex 100 Resin	Bio Rad	142-2822
MBEC-platen	Innovotech	19111
Resazurin Sodium Salt	Sigma	R7017	800 µg/ml in DI water     Filter steriel
Micro Plate Shaking Platform	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plate Reader	Biotek
Gen5 software	Biotek		Opname en analyse van resazurin conversie
Neocuproine	Sigma	N1501	bereid 10 mM stock in 100% Ethanol, bewaar bij -80 ºC
Copper sulfate	Acros Organics	7758-99-8	bereid een 100 mM stockoplossing in water, bewaar bij 4 ºC
Cu-Neocuproine	Zelf gemaakt		Gegenereerd door gelijke molariteiten van neocuproine en kopersulfaat te mengen. Mix werd verdund in CRPMI medium tot de gewenste concentratie.
Gentamicin	Sigma	G3632-1G