Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft de methoden voor inductie en scoren van het experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE) model, samen met de beoordeling van immuunceldistributie en mRNA-cytokineniveaus in lymfeklieren, milt, bloed en ruggenmerg met behulp van flowcytometrie en kwantitatieve PCR, respectievelijk, in verschillende fasen van de ziekte.

Samenvatting

Multiple sclerose wordt als een autoimmune ziekte, die wordt gekenmerkt door laesievorming in het centrale zenuwstelsel (CNS) leidt tot cognitieve en motorische stoornissen zijn. Experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) een nuttig diermodel van MS, omdat het ook gekenmerkt door laesievorming in het CNS, motorische beschadiging en wordt ook aangedreven door auto-immuunziekten en inflammatoire reacties. Een van de modellen EAE wordt geïnduceerd met een peptide afgeleid van myeline oligodendrocyt-eiwit (MOG) _35-55 bij muizen. De EAE muizen ontwikkelen een progressieve ziekte natuurlijk. Deze cursus is verdeeld in drie fasen: de preklinische fase (dag 0-9), het begin van de ziekte (dag 10 - 11) en de acute fase (dag 12 - 14). MS en EAE geïnduceerd door autoreactieve T-cellen die infiltreren het CZS. Deze T-cellen scheiden chemokines en cytokines die leiden tot de aanwerving van verdere immuuncellen. Daarom is de immune celverdeling in het ruggenmerg dijdens de drie fasen ziekte onderzocht. Het tijdstip van de ziekte waarop de activering / proliferatie / accumulatie van T-cellen, B-cellen en monocyten begint markeren werd de immuuncel verdeling lymfklieren, milt en bloed ook beoordeeld. Bovendien voert de verschillende cytokines (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) in de drie ziekte fasen werden bepaald, inzicht in de ontstekingsprocessen van de ziekte. Concluderend, de data geven een overzicht van de functionele profiel van immuuncellen in EAE pathologie.

Inleiding

Multiple sclerose (MS) en de bijbehorende diermodel, experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE), tonen autoimmune neuroinflammatie veranderingen in het centrale zenuwstelsel (CNS). Vroege actieve MS en EAE letsels worden gekenmerkt door de aanwezigheid van geïnfiltreerde immuuncellen. De etiologie van MS nog steeds onbekend, maar wordt algemeen beschouwd als de vernietiging van myeline gemedieerd door autoreactieve T-cellen omvatten. Deze autoreactieve T-cellen scheiden cytokines en chemokines die andere immune cellen zoals B cellen, monocyten en neutrofielen uit de circulatie te trekken. Monocyten differentiëren tot macrofagen. Interferon gamma (IFNy) uitgescheiden door autoreactieve T cellen polariseert de macrofagen in pro-inflammatoire macrofagen. De pro-inflammatoire cytokinen macrofagen afgifte en reactieve zuurstofdeeltjes die apoptose in oligodendrocyten te bevorderen. De dood van de oligodendrocyten leidt tot demyelinisatie. Voorts B-cellen differentiëren tot pLasma cellen en afgifte autoantilichamen tegen de myelineschede, uiteindelijk leidt tot afbraak van myeline. Het verlies van myeline leidt tot afbraak van axonen en neuronen en daardoor de vorming van laesie plaatsen in het CZS die de belangrijkste kenmerk van MS ¹ vertegenwoordigen. In de periferie, worden T-cellen en B-cellen geactiveerd in de lymfeklieren, ze prolifereren in de milt en migreren door de circulatie in het centrale zenuwstelsel. Monocyten en neutrofielen prolifereren in het beenmerg en ook migreren door de circulatie in het centrale zenuwstelsel.

Leukocytextravasatie uit beenmerg, milt en lymfeknopen in het bloed of uit de bloedstroom in het centraal zenuwstelsel is een meerstaps proces dat afhankelijk is van verschillende factoren, waaronder moleculaire interacties tussen leukocyten en endotheel gemedieerd door chemokines en chemokinereceptoren. De productie van chemokinen van verschillende celtypen kunnen worden geïnduceerd tijdens de immune keuze reactietijdn door cytokinen zoals tumornecrosefactor-α (TNFa), IFNy en interleukine-6 ​​(IL-6), die vervolgens rekruteert immuuncellen naar de plaats van ontsteking ^2,3. Immune cellen vormen een subset van chemokine receptoren op hun oppervlak, afhankelijk van het celtype en migratie pad naar de ontstekingsplaats. Aldus CXCR2, CCR1 en CXCR1 uitgedrukt op rijpe neutrofielen in het beenmerg en bloed ⁴ en binding van de liganden, CXCL2, CCL5 of CXCL6 respectievelijk activeert neutrofielen en bevordert hechting aan het endotheel en vervolgens de migratie van de cellen in de weefsels ^5-9. CCL2 en CCL20 trekken monocyten en Th1 / Th17 cellen ^10, die CCR2 ¹¹ en CCR6 ¹² respectievelijk uit te drukken,. CCR1 en CCR5, door verschillende celtypen, waaronder T-cellen, monocyten en macrofagen ¹³ uitgedrukt, binden CCL3, CCL5 en CCL7 en worden opgereguleerd tijdens ^MS-14. CXCR3 wordt uitgedrukt op T-cellen en bindt CCL9, CCL10 enCCL11 ^15.

Een belangrijkste strategie bij MS behandeling is de uitputting van immuuncellen of voorkomen van immuuncellen infiltratie in het CNS. Daarom heeft de blokkade van specifieke chemokine receptoren onderzocht in EAE. Antagonisme of genetische deletie van CCR1 ^16, CCR2 ^17, CCR7 ¹⁸ of CXCR2 ¹⁹ vermindert EAE pathologie, terwijl antagonisme of genetische deletie van CCR1 ^20, leverde CCR5 ²⁰ of CXCR3 ²¹ niet de pathologie te verminderen. Daarom is de expressie van specifieke chemokine receptoren op leukocyten is cruciaal voor de infiltratie van de laatste in het CZS en bepaalt het verloop van EAE.

De uitputting van immuuncellen is een effectieve behandelingsstrategie voor MS-patiënten, omdat geïnfiltreerd immune cellen geven cytokines zoals TNFa, IL-6 en IL-1β, die op zijn beurt het bevorderen ontstekingsproces of afbraak van ²² neuronen. Bovendien auto-reactieve Th1 cellen geven IFNy, die op zijn beurt stimuleert macrofagen TNFa, IL-1β en IL-23 vrij.

Dit manuscript beschrijft de inductie van EAE, het bepalen van de immune celverdeling en cytokine niveaus (mRNA) in verschillende weefsels in muizen EAE. Cellen werden op verschillende tijdstippen die in het ziekteverloop een tijdsafhankelijke overzicht van inflammatoire processen die uiteindelijk leiden tot laesievorming in het CZS verschaffen.

Protocol

ETHIEK STATEMENT: Onze experimentele procedures worden goedgekeurd door de ethische commissie van het Regierungspräsidium Darmstadt (Duitsland) en bevestigen om nationale en Europese regelgeving. Alle inspanningen werden gedaan om het dierenleed te beperken en het aantal gebruikte dieren te verminderen.

1. EAE Model

1. Inductie van de EAE model
   1. Gebruik 10- tot 13-weken oude vrouwelijke 129S4 / SvJae x C57BL / 6 muizen voor de inductie van EAE.
   2. Geven de muizen een subcutane injectie in de bovenste en onderrug van de encefalitogene MOG _35-55 (myeline oligodendrocyt glycoproteïne) peptide (200 ug), geëmulgeerd in 200 gl compleet Freund`s adjuvant (CFA) dat 400 ug Mycobacterium tuberculosis.
      Opmerking: Als negatieve, niet-ziekteverwekkende sham control, incompleet Freund's adjuvans met Mycobacterium tuberculosis, in hetzelfde volume en via dezelfde weg, kan worden gebruikt.
   3. TherENadat en opnieuw 24 uur later, geven de muizen een intraperitoneale injectie van pertussis toxine (in totaal 0,2 g, verdund in 200 ul fosfaat-gebufferde zoutoplossing, PBS). Onbehandeld muizen als controlegroep, te kunnen vergelijken met zieke gezonde dieren.
      Opmerking: Het is ook mogelijk om EAE te induceren met 200-300 gg MOG _35-55 peptide 300-500 ug Mycobacterium tuberculosis in CFA en 0,2-0,3 ug pertussis toxine in een volume van 0,1-0,2 ml per injectie.
   4. Beginnend één week na de injectie, onderzoeken muizen die dagelijks voor de klinische symptomen (zie stap 1.2.1)
      Opmerking: de dag van begin van de ziekte varieert in verschillende experimenten, maar onder de omstandigheden in ons laboratorium, is rond dag 11 en dus hier dag 14 gedefinieerd als 3 dagen na het begin van de ziekte. Alle muizen in deze studie ontwikkelde klinische symptomen.
2. Scoren van de muizen
   1. Classificeren klinische symptomen van klinische scores als volgt:0) geen tekenen, 0,5) distale verlamming van de staart, 1) volledige verlamming van de staart, 1.5) slappe staart en een lichte zwakte van de achterpoten, 2) slappe staart en ernstige zwakte van de achterpoten, 2.5) slappe staart en verlamming van één achterpoot, 3) slappe staart en verlamming van beide achterpoten, 3.5) verlamming van beide achterpoten en zwakte van één voorste ledemaat (muizen het bereiken van deze score werden gedood, in overeenstemming met de lokale ethische richtlijnen).

2. Voorbereiding van de Single Cellen voor Flowcytometrieanalyse

Opmerking: Het antilichaam mengsel bestaat uit 1 pi CD45-Vioblue, 2 pl CD8-eFluor650, 0,5 gl CD11b-eFluor605, 0,5 gl F4 / 80-PE-Cy7, 1 ui CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 gl CD11c -AlexaFluor700, 1 ul CD19-APC-H7 en 1 pl Ly6G-APC-Cy7.

Let op: Als je bloed, lymfeklieren, milt en het ruggenmerg neem vervolgens de procedure is als volgt: Muizen zijn diep verdoofd met een combinatie van isoflUrane (2% in carbogen per minuut) en ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht). Volgende open de thorax, verwijder het bloed met een intracardiale stick en perfuseren de muizen intracardiaal met koude PBS. verwijder de lymfeklieren gevolgd door milt en tenslotte het ruggenmerg. Als u niet nodig om de muizen intracardiaal perfuseren dan euthanaseren de muizen onder diepe narcose door luxatie van de nek.

1. Isolatie van splenocyten
   1. Verdoven muizen met een combinatie van isofluraan (2% in carbogen per minuut) en ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht).
   2. Natte incisie met 80% isopropanol om eventuele besmetting met haren te voorkomen en open de thorax de lengterichting, zonder prikken diepere weefsels, met een schaar.
   3. Perfuseren muizen intracardiaal met koude PBS pH 7,0 ^23.
      Opmerking: De milt is gelegen in de linker superieure abdominale kwadrant onder de ribbenkast. Als alleen de milt worden bestudeerd, kan dit orgaan worden verwijderd voordat de perfusie om retain alle celtypen van belang.
   4. Verwijder de milt en afgesneden ongeveer 1/8 en wegen. Bewaar het monster in PBS op ijs.
   5. Knijp het miltweefsel door een 70 urn mesh zeef (geplaatst over een 50 ml buisje) met de zuiger van een 2 ml injectiespuit.
   6. Was de zeef met 5 ml PBS. Centrifugeer bij 1800 xg gedurende 3 min. Resuspendeer de pellet in 500 pl lyserende oplossing.
      Opmerking: In dit stadium kan het nodig zijn om een ​​differentiële celtelling wanneer later een alternatieve FACS analyse methode toegepast die geen kralen (zie hoofdstuk 3) dienst heeft.
   7. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (KT) en voeg 500 ul PBS. Centrifugeer 6 min bij 650 xg bij kamertemperatuur (RT).
   8. Herhaal de wasstap met 500 pi PBS. Verwijder het supernatant, resuspendeer de celpellet in 100 gl 0,2% runderserumalbumine (BSA) / PBS, voeg 2 pl Fc-receptor-1 (FcRI) blokkerende buffer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
   9. Voeg 13 ul van eentibody mengsel, incubeer 15 min bij kamertemperatuur in het donker, voeg 500 ul PBS en centrifugeer gedurende 6 min bij 650 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant.
      Opmerking: kleuringsprocedure de fabrikant aanbevolen één wasbeurt, maar extra reductie van achtergrondkleuring kan worden bereikt door eventueel herhalen van de wasstap een of twee keer.
   10. Resuspendeer de celpellet in 500 ui PBS (of eventueel loopbuffer voor eiwitscheiding om te beperken die cel klonteren) en mogelijk in de flowcytometrie buis. Houd cellen op ijs.
2. Isolatie van lymfeknoopcellen
   1. Verdoven muizen met een combinatie van isofluraan (2% in carbogen per minuut) en ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht).
   2. Natte incisie met 80% isopropanol en open de thorax in lengterichting met een schaar. Perfuseren muizen intracardiaal met koude PBS pH 7,0 ^23.
   3. Om de lies lymfeklier te isoleren, verwijder voorzichtig de huid in het gebied van de hip en kies de lymfeklier voorzichtig uit het vetweefsel met een tang. Weeg de lies lymfeklier en bewaar het monster in PBS op ijs.
      Opmerking: We gebruikten inguinale lymfeklieren in onze studies omdat O`Connor et al. gevonden dat grote aantallen van geactiveerde monocyten, macrofagen, neutrofielen en T-cellen waren aanwezig in de inguinale lymfeknopen na EAE inductie ^24.
   4. Knijp de lymfeklier door een 70 um mesh zeef (geplaatst over een 50 ml tube) met behulp van de zuiger van een 2 ml spuit.
   5. Was de zeef met 5 ml PBS. Centrifugeer bij 2400 xg gedurende 8 minuten. Resuspendeer de celpellet in 100 gl 0,2% BSA / PBS, voeg 2 ul FcRI blokkeerbuffer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
   6. Voeg 13 ul antilichaam mengsel, incubeer 15 min bij kamertemperatuur in het donker, voeg 500 ul PBS en centrifugeer gedurende 6 min bij 650 x g bij kamertemperatuur.
   7. Verwijder het supernatant, resuspendeer de celpellet in 300 ui PBS (of een geschikte loopbuffer) en overbrengeneen flowcytometrie buis.
3. Isolatie van bloedcellen
   1. Voeg 50 ul 20 mM HEPES bij 50 pl bloed (gestabiliseerd met EDTA) en voeg 500 ul lyserende oplossing. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en voeg 500 ul PBS. Centrifugeer 6 min bij 650 x g bij kamertemperatuur. Gooi supernatant en herhaal de wasstap.
   2. Resuspendeer de celpellet in 100 gl 0,2% BSA / PBS, voeg 2 ul FcRI blokkeerbuffer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
   3. Voeg 13 ul antilichaam mengsel, incubeer 15 min bij kamertemperatuur in het donker, voeg 500 ul PBS en centrifugeer gedurende 6 min bij 650 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant, resuspendeer de celpellet in 300 pi PBS en mogelijk in de flowcytometrie buis.
4. Isolatie van het ruggenmerg cellen
   1. Verdoven muizen met een combinatie van isofluraan (2% in carbogen per minuut) en ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht).
   2. Natte incisie met 80% isopropanol en open de thorax lengterichtingmet een schaar. Perfuseren muizen intracardiaal met koude PBS pH 7,0 ^23.
   3. Bevochtig de incisie gebied op de rug en maak weer een longitudinale snit met een scalpel en verwijder de huid.
   4. Knip het lumbale deel van de wervelkolom (die de achterpoten innervates) en spoelen met PBS een injectiespuit aan het ruggenmerg extraheren. Knip ongeveer 1/3 van de lumbale koord, weegt dit en bewaar het monster in PBS op ijs.
   5. Centrifugeer bij 250 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, voeg 500 ul cel losraken oplossing en HBSS (1: 1). Voeg 3 mg / ml collagenase A en 1 eenheid / ml DNase I, onthalzen de cellen door herhaaldelijk op en neer pipetteren en incubeer gedurende 30 minuten onder schudden bij 37 ° C bij 400 rpm.
      Opmerking: Desgewenst kan de celsuspensie worden vrijgemaakt van verontreinigende myeline en celresten door dichtheidsgradiënt centrifugatie die de gevoeligheid van de meting kan flowcytometrie verbeteren daardoor reducerende achtergrond autofluorescentie eend het aantal gebeurtenissen die moeten worden overgenomen (zie paragraaf 3.5).
   6. Centrifugeer bij 250 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 1 ml 10% foetaal kalfsserum (FCS) / Dulbecco's minimaal essentieel medium (DMEM) en onthalzen de cellen opnieuw door herhaaldelijk op en neer te pipetteren.
   7. Centrifugeer bij 250 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de wasstap.
   8. Resuspendeer de celpellet in 1 ml PBS en knijp het ruggenmerg door een 70 urn mesh zeef (geplaatst over een 50 ml buisje) met de zuiger van een 2 ml injectiespuit.
   9. Was de zeef met 4 ml PBS. Centrifugeer bij 1800 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant, resuspendeer de celpellet in 100 gl 0,2% BSA / PBS, voeg 2 ul FcRI blokkerende reagens en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
   10. Voeg 13 ul antilichaam mengsel, incubeer 15 min bij kamertemperatuur in het donker, voeg 500 ul PBS en centrifugeer gedurende 6 min bij 650 x g bij kamertemperatuur.
   11. Verwijder het supernatant, resuspendeer de cel pellet in 500 pl PBS (of een geschikte loopbuffer) en mogelijk in de flowcytometrie buis.

3. Flow cytometrische analyse

1. Titreer alle antilichamen vooraf optimale concentraties te bepalen zoals beschreven door Olesch et al. ^25.
2. Gebruik antilichaam vastleggen compensatie kralen voor eenkleurige compensatie multi-color compensatie matrices maken volgens de instructies fabrikant `.
3. Controle van de kalibratie dagelijks met behulp van specifieke kralen volgens de instructies de fabrikant.
4. Direct voor de flowcytometrie meting, voeg 30 ul flowcytometrische absolute aantal standaard om de cellen (voor isolatie zie paragraaf 2,1, 2,2, 2,3, 2,4) absolute celtellingen bepalen. In plaats van het tellen van kralen van de cellen kunnen worden geteld.
5. Neem monsters (cellen uit de milt, lymfeklieren en bloed: 100.000 gebeurtenissen, het ruggenmerg: 500.000 events) in een flowcytometer eennd analyse met behulp van specifieke software flowcytometrie.
   1. Open de flowcytometrie software en FCS toe te voegen 3.0-bestanden door te drukken op de knop "add samples".
   2. Open het bestand toegevoegd door te dubbelklikken. Stel de kanalen voor de x- en y-as. Om selecteert u de cel populaties van belang te creëren een poort (zie figuur 4).

4. Kwantitatieve PCR analyse

1. Isolatie van mRNA en transcriptie in cDNA
   1. Pak het mRNA van lumbale ruggenmerg (1/3), milt (1/8) en lies lymfeklieren door fenol-chloroform en neerslaan met ethanol ^26.
      1. Hiervoor Homogeniseer het weefsel in 1 ml guanidinium thiocyanaat-fenol mengsel, incubeer gedurende 10 minuten. Voeg 200 ul chloroform en opnieuw incubeer gedurende 10 minuten.
      2. Na een centrifugatie stap (18.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C), was de bovenste waterige fase met 500 pl isopropanol en centrifugeer (18.000 xg gedurende 8 minuten bij 4° C).
      3. Was de pellet met 500 pi ethanol en na centrifugatie stap (18.000 g gedurende 5 min bij 4 ° C), droog de pellet in de vacuümconcentrator (5 min bij 30 ° C). Daarna resuspendeer de pellet in 30 ul water.
   2. Om het mRNA te extraheren uit bloed, centrifuge 500 gl EDTA-bloed gestabiliseerd (300 x g 10 min 4 ° C).
      1. Neem de bufferlaag, die witte bloedcellen en verdund in 1 ml lyserende oplossing (150 mM _NH4Cl, 100 mM NaHCO _3, 0,1 mM Na-EDTA pH 7,4).
      2. Na 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur, gecentrifugeerd cellen bij 650 g gedurende 6 minuten en vervolgens tweemaal wassen met PBS.
      3. Extraheer het mRNA van witte bloedcellen (WBC's) met een kit voor RNA extractie volgens de instructies van de fabrikant.
   3. Voeren cDNA-synthese onder toepassing van een kit voor cDNA-synthese zoals willekeurige hexameren volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik 200 ng mRNA voor het CDNEen synthese.
2. kwantitatieve PCR
   1. Om de hoeveelheid van een specifiek mRNA te kwantificeren, gebruiken 1 ui cDNA, 1 uM vooruit / achteruit primer en een fluorescerende DNA-bindende kleurstof volgens de instructies van de fabrikant ^27. Zie Tabel 1 voor de sequenties voor de primer sets. Meet de CT-waarden van IL-1β, IL-6, IL-23, IFNy, TNFa en PPIA (peptidyl prolyl isomerase) met een kwantitatieve PCR systeem.
   2. Om te bepalen van de relatieve mRNA expressie gebruik maken van de vergelijkende methode ²⁷ CT (cyclus drempelwaarde).
      1. Hiervoor normaliseren CT-waarden van de doelgenen de expressieniveaus van PPIA door het aftrekken van de gemiddelde CT-waarde PPIA van het doelwitgen, zoals in eerdere studies (Barthelmes et al. ^28, Schiffmann et al. ^29, Schiffmann et al. ^30). Vervolgens berekent de zogenaamde ΔΔCT-waarden, met behulp waarvan de AC T-waarden normaliserenvan de doelgenen van EAE muizen om het expressieniveau van de doelwitgenen van onbehandelde muizen, weer door het aftrekken van de gemiddelde AC T-waarde in de onbehandelde muizen uit de AC T-waarde in EAE muizen.
      2. De relatieve mRNA-expressie van het doelwitgen te krijgen, berekent de verhouding met de volgende formule: 2 ^{- ΔΔct.}
3. Test de specificiteit van elke primer. Bepaal het geamplificeerde fragment in door middel van een 2% agarosegel ^31. De fragmentgrootte is weergegeven in tabel 1.

Resultaten

Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de verschillende methoden beschreven in dit artikel. 1) Muizen krijgen een injectie van MOG _35-55 antigen en de ontwikkeling van de eerste klinische symptomen na 10,7 ± 0,3 dagen ^28. Een vertegenwoordiger ziekteverloop van EAE muizen wordt weergegeven in figuur 1. 2) verschillende weefsels (milt, lymfeknopen, lumbale ruggenmerg) en bloed worden uit contro...

Discussie

EAE model beschreven heeft de meeste aandacht gekregen als een model van MS en wordt routinematig gebruikt in het testen van therapeutische strategieën voor MS ^32. De muis ziekte vertoont vele klinische en histologische kenmerken van MS en wordt veroorzaakt door de inductie van autoimmuniteit neuronale antigenen. Sensibilisatie tegen myeline antigenen geassocieerd met bloed hersenbarrière disfunctioneren en daardoor immune cel infiltratie in het CNS. Onze resultaten tonen aan dat immuuncellen verhogen tijdeli...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ABI Prism 7500 Sequence Detection System	Applied Biosystems, Austin, USA		kwantitatieve PCR-systeem
Accutase	Sigma Aldrich Munich, Germany	A6964	oplossing voor celdetachment
CD3-PE-CF594	BD, Heidelberg, Germany	562286
CD4-V500	BD, Heidelberg, Germany	560782
CD8-eFluor650	eBioscience, Frankfurt, Germany	95-0081-42
CD11b-eFluor605	eBioscience, Frankfurt, Germany	93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700	BD, Heidelberg, Germany	560583
CD19-APC-H7	BD, Heidelberg, Germany	560143
CD45-Vioblue	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-910
CompBeads	BD, Heidelberg, Germany	552843	compensatiekralen
Collagenase A	Sigma Aldrich Munich, Germany	C0130
Cytometric absolute count standard	Polyscience, Eppelheim, Germany	BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads	BD, Heidelberg, Germany	642412
DNase I	Sigma Aldrich Munich, Germany	D5025
EAE Kit	Hooke Laboratories, Lawrence, USA	EK2110
F4/80-PE-Cy7	BioLegend, Fell, Germany	123114
First Strand cDNA-Synthesis kit	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	K1612
Fc receptor-1 blocking buffer	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
Flow cytometric absolute count standard	Polyscience, Eppelheim, Germany	580
FlowJo software v10	Treestar, Ashland, USA		flowcytometriesoftware
LSRII/Fortessa	BD, Heidelberg, Germany		flowcytometer
Ly6G-APC-Cy7	BD, Heidelberg, Germany	560600
Lysing solution	BD, Heidelberg, Germany	349202
Maxima SYBR Green	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	K0221	fluorescente DNA-bindende kleurstof
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104	RNA-extractiekit