Methodenartikel

Procedure Om de efficiëntie van Flocculanten Evalueer voor de opheffing van de gedispergeerde deeltjes van plantenextracten

8.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53940

⸱

9 april 2016

1Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University

In dit artikel

Samenvatting

De hier gepresenteerde ontwerpprocedure voor experimenten maakt de evaluatie van verschillende flocculanten mogelijk op basis van hun vermogen om verspreide deeltjes in plantenextracten te bundelen, waardoor de troebelheid en de kosten van downstreamverwerking worden verminderd.

Samenvatting

Planten zijn voor de mens niet alleen belangrijk omdat ze producten zoals voedsel, diervoeding en grondstoffen leveren, maar ook omdat ze steeds vaker kunnen worden gebruikt als productieplatforms voor toegevoegde waarde producten zoals biofarmaceutische middelen. In beide gevallen kunnen vloeibare plantenextracten mogelijk moeten worden opgehelderd om deeltjes te verwijderen. Optimale opheldering verlaagt de kosten van filtratie en centrifugatie door de capaciteit en levensduur te verhogen. Dit kan worden bereikt door het introduceren van geladen polymeren, bekend als flocculanten, die gedispergeerde deeltjes kruis-linken om scheiding van vaste en vloeibare stoffen te vergemakkelijken. Er zijn geen mechanistische flocculatiemodellen voor complexe mengsels zoals plantenextracten, dus empirische modellen worden in plaats daarvan gebruikt. Hier wordt een ontwerp-van-experimentenprocedure beschreven die het mogelijk maakt om snel verschillende flocculanten te screenen, de opheldering van plantenextracten te optimaliseren en de turbiditeit aanzienlijk te verminderen. De resulterende voorspellende modellen maken het mogelijk om robuuste procescondities en sets van polymeren met complementaire eigenschappen te identificeren, bijvoorbeeld effectieve flocculatie in extracten met specifieke geleidbaarheden. De resultaten die worden gepresenteerd voor tabaksbladextracten kunnen eenvoudig worden aangepast aan andere plantensoorten of weefsels en zullen dus de ontwikkeling van meer kosteneffectieve downstream processen voor grondstoffen en plantaardige farmaceutische middelen vergemakkelijken.

Inleiding

Planten worden wijd gebruikt om levensmiddelen zoals vruchtensappen produceren, maar kunnen ook worden ontwikkeld als platforms voor de vervaardiging van hogere waarde biofarmaceutische producten 1-3. In beide gevallen, downstream processing (DSP) begint vaak met het verwijderen van vloeistoffen uit weefsels zoals bladeren en vruchten, gevolgd door de verduidelijking van deeltjes beladen extracten 4,5. Voor de vervaardiging van geneesmiddelen, kunnen de kosten van DSP oplopen tot 80% van de totale productiekosten 6,7 en dit gedeeltelijk weerspiegelt de hoge belasting deeltjes aanwezig in extracten bereid met werkwijzen zoals verstorende-blade gebaseerde homogenisering 8,9 . Hoewel de rationele selectie filterlagen de deeltjesgrootteverdeling overeen in het extract kan filtercapaciteit en lagere kosten 10,11, kan de verbetering niet meer dan een maximum van bepaald door het aantal deeltjes dat per behouden moeten blijven absolute capaciteit-eenheid van het filter gebied om opheldering te bereiken.

Het plafond kan worden opgeheven indien minder deeltjes het oppervlak van de beste filters in de filtratietrein bereiken en dit kan worden bereikt als gedispergeerde deeltjes zijn gemengd met polymeren bekend als vlokmiddelen die aggregatie bevorderen grote vlokken 12 vormen. Dergelijke vlokken kunnen verder stroomopwaarts van grovere en goedkoper zakkenfilters worden gehandhaafd, waardoor de deeltjes belasting bereiken hoe fijner en duurder dieptefilters. De polymeren moeten veiligheid profielen die geschikt zijn voor hun applicaties, bijvoorbeeld voor biofarmaceutische producten ze moeten voldoen aan Good Manufacturing Practice (GMP) te hebben, en meestal moeten ze een molmassa> 100 kDa hebben en kan zowel neutraal of geladen 13. Overwegende neutrale flocculatoren het algemeen werken door het verknopen van verspreide deeltjes waardoor hun aggregatie en de vorming van vlokken met een diameter> 1 mm 11, geladen polymeren neutraliseren van de lading van dispersed deeltjes, waardoor hun oplosbaarheid en derhalve precipitatie 14 veroorzaakt.

Flocculatie kan worden verbeterd door het instellen van parameters zoals pH of geleidbaarheid, en het polymeer type of concentratie op de eigenschappen van het extract 15,16 passen. Tabak extracten voorbehandeld met 0,5-5,0 g L -1 polyethyleenimine (PEI), een meer dan 2-voudige toename dieptefilter capaciteit werd gerapporteerd in een 100-L proefschaal proces. De kosten van dit polymeer is minder dan € 10 kg -1, zodat de invoering ervan in het proces heeft geleid tot een kostenbesparing van ongeveer € 6.000 voor filters en verbruiksmaterialen per batch 16 of zelfs meer in combinatie met cellulose gebaseerde filter aids 17. Toch zijn voorspellende modellen nodig om de a priori economische voordelen van flocculanten evalueren, omdat hun opname greep stappen van 15-30 min 16,18 kan eisen, wat resulteert in verdere investeringen kosten voor opslagtanks. Echter, er zijn geen mechanistische modellen beschikbaar die de uitkomst van dergelijke experimenten kunnen voorspellen als gevolg van de complexe aard van flocculatie. Daarom is een meer passend ontwerp-of-experimenten (DoE) benadering 19 werd ontwikkeld zoals beschreven in dit artikel. Een protocol voor de algemene DoE procedure is onlangs verschenen 20.

Kleinschalig apparaten zijn nu beschikbaar voor de high-throughput screening van flocculatie omstandigheden 21. Echter, deze apparaten niet realistisch simuleren tijdens het uitvlokken van plantenextracten vanwege de afmetingen van het reactievat (~ 7 mm voor putten op een 96-wells plaat) en de deeltjes of vlokken kleiner dan een orde van grootte van elkaar kunnen zijn. Dit kan invloed mengen patronen en aldus de voorspellende kracht van het model. Bovendien kan het moeilijk zijn om de omvang van processen waarbij precipitatie als gevolg van niet-lineaire veranderingen in de menggedrag en neerslag stabaarheid 22. Daarom is dit artikel schetst een bench-top-scale screening systeem met een debiet van 50-75 monsters per dag, waardoor de resultaten die schaalbaar van de eerste 20 ml reactie volume op een 100 liter pilot-schaal proces 16 zijn. In combinatie met een DoE benadering, dit maakt de voorspellende modellen worden gebruikt voor procesoptimalisatie en documentatie van een kwaliteit-van-concept.

De hieronder beschreven methode kan ook worden aangepast om biofarmaceutica geproduceerd in celkweek gebaseerde processen, waarbij flocculanten ook als een kostenbesparende gereedschap 23 overwogen. Het kan ook worden gebruikt voor het neerslaan van doeleiwitten modelleren van een ruw extract als onderdeel van een zuiveringsstrategie, zoals aangetoond voor β-glucuronidase geproduceerd in canola, maïs en sojaboon 24,25. Een gedetailleerde beschrijving van flocculant eigenschappen kunnen elders worden gevonden 16,26 en het is belangrijk dat het polymeer concentraties ofwel niet giftig of minder schadelijke niveaus in het eindproduct 11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Ontwikkel een adequate experimentele strategie

  1. Identificeer de milieu- en procesparameters die relevant zijn voor de flocculatie procedure worden vastgesteld of geoptimaliseerd, dat wil zeggen welke factoren de sterkste invloed op de flocculatie. Doorgaans zijn er meerdere van dergelijke parameters zodat een DOE benadering zoals recent beschreven 20 noodzakelijk is door het ontbreken van mechanistische modellen.
    1. Select parameters (factoren) op basis van gegevens uit de literatuur 12, voorkennis en ervaring met het systeem. Typische factoren omvatten pH, buffer geleidbaarheid, incubatietijd en de temperatuur als ook het type polymeer en de concentratie 15,16,27.
    2. Gebruik dezelfde referenties (zie 1.1) om zinvolle reeksen voor elke numerieke factor en niveaus definiëren voor categorische factoren.
    3. Definieer de experimentele resultaten (reacties) worden gecontroleerd en gebruikt om de efficiëntie van flocculatie evalueren. Afhankelijk van het systeem dit,kan filtraat of supernatant troebelheid, valsnelheid, de totale omvang of de capaciteit van een volgend filter 16,23,28-30 zijn.
    4. Zorg ervoor dat het wordt gebruikt om de reacties te meten testen zijn kwantitatieve, robuust en herhaalbaar / reproduceerbaar zodat de resulterende data van hoge kwaliteit kan worden uitgebreid met experimenten later, of door een andere operator uitgevoerd.
  2. Kies een DoE het type voldoet aan het aantal factoren te onderzoeken en de mate van kennis reeds opgebouwde over het systeem. Gebruik beschikbare literatuur om een geschikte DoE soort 20 identificeren.
    1. Selecteer een screening ontwerp als er weinig informatie over het uitvlokkingssysteem te onderzoeken, een groot aantal parameters worden afgeschermd of niet goed bekend betekenis voor de parameters. Typische screening ontwerpen zijn vol en fractionele factoriële ontwerpen. Omvatten middelpunten in het ontwerp wanneer parameters naar verwachting een niet-lineair effect heeft, bijvoorbeeld Verzadiging boven een bepaalde drempel 19.
    2. Selecteer een reactie oppervlak methode (RSM), bv centrale composiet ontwerp (CCD) 31 of optimale 32,33, al was het maar een paar factoren met bekende reeksen moeten nauwkeurig worden gekarakteriseerd.
  3. Stel de DoE met de juiste software, zorgen voor een priori kwaliteitscriteria zoals de fractie van het ontwerp ruimte wordt voldaan 20.

2. Bereid de Flocculatie Experimenten

figure-protocol-1
Figuur 1: Plant extract flocculatie workflow: proces schaal (links) en tafelmodel schaal (rechts). Na eiwit extractie met waterige buffers, gedispergeerd deeltjes van celresten verzameld door de toevoeging van vlokmiddelen. De aggregaten worden vervolgens verwijderd door een cascade van zak en dieptefiltratie en de capaciteit van dezefilters samen met het filtraat troebelingen kan direct worden gebruikt om de efficiëntie van flocculatie te meten.

  1. Het ontwikkelen van een Algemene experimentele Work Flow (figuur 1).
    1. Gebruik een afzuiginrichting die resulteert in dezelfde deeltjesgrootteverdeling verwacht (of reeds waargenomen) en eindtoepassing schaal, bijvoorbeeld een gespecialiseerde homogenisator. Indien mogelijk, het ontwerpen van een afbouw model van de extractor zoals beschreven voor de homogenisering van tabaksbladeren 10.
    2. Definieer het extract volumes tijdens flocculatie experimenten (hier 20 ml). Selecteer het volume waarmee een representatief aantal deeltjes aanwezig zijn in het reactievat, bijvoorbeeld flocculatie experimenten in 20 ml aliquots leverden reproduceerbare en schaalbaar resultaten tabak extracten die ~ 7% [w / v] vaste stoffen 34 en deeltjesgrootten van ~ 0,5 pm tot 3 mm ~ 16.
    3. Ontwerpen alle bewaking en post-flocculatie operaties zodat they representatief zijn voor de eindtoepassing schaal, bijvoorbeeld geselecteerd met dezelfde retentietijd deeltje gedrag als die gebruikt bij de productieschaal.
  2. Cultiveren van de planten waaruit de extracten zullen worden afgeleid.
    1. Gebruik dezelfde plant lijn, hier Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1 en kweekomstandigheden die worden gebruikt tijdens de productie zoals eerder beschreven 33.
    2. Als er andere voedselvoorraden zullen worden verwerkt, voor te bereiden deze voedermiddelen voorraden, zodat ze representatief zijn voor de uiteindelijke applicatie schaal bv gebruiken authentieke buffers, rekening te houden met een eventuele verdunning stappen tijdens het proces en vasthouden aan de verwachte pH en geleidbaarheid, hier pH 7,5 en geleidbaarheid 30 mS cm -1.
  3. Bereid Filtratie Utilities, troebelheid-bewakingssystemen en Sampling Vessels.
    1. Snijd de filtermaterialen de vereiste afmetingen, hier 15 x 15 cm 2, als ze niet klaar te onse modules. Zorg ervoor dat alle monitoring en analyse-apparaten zijn functioneel en labelen alle monsterbuizen.
    2. Hoewel deze zijn eenvoudige taken, voor te bereiden deze items in de tijd om ervoor te zorgen dat ze geen onderbrekingen zullen veroorzaken tijdens de eigenlijke flocculatie experimenten. Geen vertragingen optreden omdat ze kunnen interfereren met de gegeven uitvlokking resultaat is een tijdsafhankelijk proces.
  4. Bereid Flocculant Stock Solutions. LET OP: Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen bij het ​​hanteren van flocculanten, bijvoorbeeld handschoenen. De materialen kunnen gevaarlijk zijn (hazard labels volgens Europa UE 67/548 / EEG, 1999/45 / CE omvatten N, Xi of Xn). Vermijd stof en wordt verwezen naar de veiligheidsinformatiebladen. Werken onder een zuurkast.
    1. Kies een voorraad concentratie voor elke flocculant, hier 80,0 g L -1 voor de twee PEI flocculatoren die werden gebruikt. Selecteer concentraties zo hoog mogelijk monsterverdunning voorkomen bij het toevoegen van het vlokmiddel, welke deeltjes concentraties zou verminderentie en dus van invloed op flocculatie efficiency.
    2. Account voor voorverdunning deze formulering van het polymeer de fabrikant reflecteert, bijvoorbeeld wanneer het polymeer reeds wordt geleverd als een waterige 50% [w / v] oplossing. Vlokmiddel voorraadoplossingen van 4-8% [w / v] bleken tot nu toe de meest geschikte zijn.
    3. Rekening houdend met de bovenstaande punten besproken, zorg ervoor dat de flocculant concentratie niet een zeer viskeuze oplossing die pipetteren remt, wat kan leiden tot fouten, omdat de uiteindelijke flocculant concentratie niet goed is afgesteld te genereren.
    4. Gebruik dezelfde voorraad concentratie voor alle flocculatoren indien mogelijk, omdat dit zal de installatie van een pipetteren regeling (2,5), waardoor de kans op fouten verminderen vergemakkelijken.
    5. De pH en de geleidbaarheid van elk flocculatiemiddel stockoplossing aan de voorwaarden van de extracten hier pH 4-10 en geleidbaarheid 15-55 mS cm -1 passen. Bereid je individuele aandelen voor een enkele flocculant als merts dan één set van de pH en / of geleidbaarheid voorwaarden wordt getest op dat polymeer.
    6. Bereid voorraadoplossingen vlokmiddel vers, niet langer dan 48 uur voor gebruik. Hoewel flocculatie kan worden geïnduceerd met polymeer bestanden worden opgeslagen gedurende meer dan 4 weken, kan de efficiëntie dalen door polymeer hydrolyse bij hoge of lage pH-waarden. Zie documentatie van de fabrikant voor meer informatie.
    7. Zorg ervoor dat de voor de DOE parameters juist elk monster tijdens het experiment kan worden ingesteld, bijvoorbeeld zorgen voor zijn verwarming / koeling bad beschikbare incubatietemperaturen passen, hier 4 ° C, 20 ° C en 37 ° C. Als vermengen bij flocculatie is deel van het experiment op dat de menginrichting is representatief voor de eindtoepassing omvang in termen van de kritische parameters, zoals vermogen.
  5. Reken de DoE Schedule in een Pipetting Scheme.
    1. Omzetten van de verschillende vlokmiddel concentraties tes zijnted in volumes van de voorraad oplossing die aan het extract monsters worden toegevoegd: verdeel de uiteindelijke flocculant concentraties door de voorraad concentratie en vermenigvuldigen met de sample volume gebruikt in de flocculatie experimenten. Vind de grootste resulterende eindvolume, bijvoorbeeld als 20 ml monster wordt gemengd met een maximum van 2 ml flocculant voorraadoplossing zal dit 22 ml.
    2. Bereken volumes buffer nodig is om hetzelfde eindvolume in elke flocculatie aliquots basis van de grootste hoeveelheid flocculatiemiddel voorraad houden worden toegevoegd, bijvoorbeeld als 0,75 ml flocculant voorraad moet worden toegevoegd aan een monster dan 1,25 ml buffer moet het handhaven uiteindelijke steekproef volume van 22 ml (2.5.1).
    3. Samengevat volumes flocculatiemiddel voorraadoplossing per polymeer en flocculatie voorwaarde om de absolute hoeveelheden voorraadoplossing die nodig zijn voor de DOE berekenen.
  6. Harvest tabaksbladeren en Bereid de Extract.
    1. Verwijder de top zes leaves (of zoveel als symbool in de procesinstructies) vanaf tabaksplanten van een geschikte tijd, bijvoorbeeld 6 weken oud, en deze in een geschikte afzuiginrichting zoals een homogenisator of een schroefpers.
    2. Voeg drie volumes extractiebuffer per gram biomassa, bv 300 ml per 100 g, en mix voor 8 min.
    3. Bereid afzonderlijke fragmenten met de geschikte buffers of verschillende pH en / of geleidbaarheid worden getest. Hier gaat het homogeniseren van het plantmateriaal voor 3 x 30 sec in een blender of een sapcentrifuge 34.
    4. Alternatief bereiden het extract op een wijze die representatief is voor het proces dat wordt onderzocht.
  7. Aliquot de Extract en Voeg de Buffer.
    1. Handmatig en grondig roeren het extract gedurende de gehele procedure te waarborgen de monsters homogeen met een gelijkmatige verdeling van deeltjes.
    2. Precies extract verdelen de gelabelde reactiebuizen door decanteren,hier 20 ml in elk vat. Self-standing 50 ml buizen vereenvoudigen handling en zijn ideaal voor 20 ml monsters.
    3. Voeg het volume van elk extractiebuffer nodig om de vaste eindvolume voor elk reageerbuisje met een geschikte pipet handhaven.

3. vlokken de Plant Extracten met verschillende polymeren

  1. Pipetteer de vereiste hoeveelheid vlokmiddel voorraadoplossing, hier 0,1-2,0 ml, het sequentieel zoals aangegeven door de willekeurige volgorde van de run DoE monsters. onmiddellijk na de toevoeging van flocculant door intense handmatig schudden precies 20 seconden grondig te mengen elk monster.
    1. Indien nodig, pas de schudden tijd voor andere diervoeders voorraden grondig mengen te verzekeren, maar strikt zorgen voor een consistente mengtijden voor alle monsters. Houd in gedachten dat langdurig mengen kan de onomkeerbare verstoring van de vlokken veroorzaken en niet consequent toegepast geweld tijdens het schudden van de flocculatie resultaten kunnen vertekenen.
  2. Optioneel: Wijzig de procedure hierboven voor de gelijktijdige toepassing van twee of meer flocculanten.
    1. Optie 1: In plaats van een enkel polymeer voeg een mengsel van twee of meer flocculanten, hier PEI en chitosan. Gebruik de vlokmiddel combinaties gedefinieerd in de DoE. Verwerk de verhouding en absolute concentraties van de polymeren als afzonderlijke parameters tijdens de DoE setup (1.1).
    2. Optie 2: Voeg twee of meer polymeren achtereenvolgens aan het extract.
      1. Gebruik de individuele polymeer concentratie, het type, en de incubatie tijd tussen elke toevoeging aan het extract, als bijkomende factoren tijdens de DoE setup.
      2. Gebruik ook benadering om te testen of de herhaalde toevoeging van een enkel polymeer flocculatie kan verbeteren. Gebruik een stapsgewijze toevoeging aan de langzame toevoeging van een vlokmiddel te simuleren, bijvoorbeeld vier stappen, die elk het toevoegen van 0,25 ml 80 g L -1 flocculant voorraad om een 20 ml volume over 4 min kan de toevoeging van flocculant met na te bootseneen stroomsnelheid van 0,25 ml min -1.
      3. In alle gevallen bepalen een nieuwe maximum eindmonster volume van deze opstelling door toevoeging van de maximale hoeveelheden van vlokmiddelen aan het monstervolume, hier nog 22 ml, en herberekent de vereiste hoeveelheden flocculatiemiddel voorraadoplossingen en buffers voor volumeregeling indien nodig.
  3. Incubeer de monsters voor de in de DoE, meestal 3-30 min keer, tot vlokken vorming mogelijk te maken. Zorg ervoor dat alle andere incubatie-omstandigheden, bijvoorbeeld temperatuur, worden ingesteld op basis van het DoE.
  4. Observeren en de vorming document vlokken. Noteer de voortgang van vlokken formatie vereist, bijvoorbeeld als mm vlokken afwikkeling per minuut door het meten van de hoogte van de vaste stoffen. Eventueel verlengen flocculatie gedurende een verlengde tijdsperiode zoals overnacht.
  5. Filter de uitgevlokte Extract.
    1. Gebruik de filter materialen eerder bereide (2.3) aan de uitgevlokte extract te verduidelijken na de gepasteincubatietijd door decanteren van de uitgevlokte monsters door het filtermateriaal en in een schoon vat of reactiebuis.
      1. Niet resuspendeer vaste vlokken voor filtratie en het extract toe te passen met een snelheid van ~ 300 ml min -1 het filter, overeenkomend met 3-4 seconden voor een 20 ml monster.
      2. Bevestigen de prestatie van de filtratie stap als een ander materiaal wordt gebruikt in de bench-top experimenten dan in de definitieve proces inzake retentie deeltje, bijvoorbeeld door meting van de deeltjesgrootteverdeling in beide soorten monsters 11.
    2. Analyseer het filtraat qua troebelheid en / of deeltjesgrootteverdeling vereist met behulp van geschikte inrichtingen, bijvoorbeeld een troebelheidsmeter.
    3. Optioneel: herhaal de analyse na verlengde incubatietijden, bijvoorbeeld 12-24 uur, om de vorming of de hervorming van instabiele vlokken te onderzoeken.
  6. Analyseer de monsters in termen van de Pr-E gedefinieerde Responses (1.1.3).
    1. Monsters te nemen uit de filtraten en analyseren om aanvullende respons parameters, zoals de concentraties van verschillende doelgroepen eiwitten of waardevolle producten.
    2. Optioneel: Analyseer het retentaat (meestal vaste deeltjes) voor dezelfde parameters om de massabalans van de werkwijze sluiten. Vooral kwantificeren van de invloed van vlokmiddelen op vloeistofterugwinmechanisme door vergelijking van de vaste massa die overblijft na de monsters worden behandeld of niet behandeld met vlokmiddel.
  7. Controleer de kwaliteit van de gegevens en de overdracht van de resultaten aan de DoE software.
    1. Zoeken extreme waarden in de verzamelde responsgegevens, zoals onverwacht hoge waarden.
    2. Zorg ervoor dat alle respons gegevens correct worden uitgelijnd met de bijbehorende experimentele omstandigheden.
    3. Transfer van de resultaten in de DoE software en zorg ervoor dat de standaard en gerandomiseerde run bestellingen worden niet gemengd.

4. Evalueerhet DoE

  1. Gebruik de ingebouwde data analyse-instrumenten van het DoE software om een voorspellend model te ontwikkelen zoals eerder beschreven 20.
    1. Kies de juiste data transformatie modus als nodig is om modelbouw te vergemakkelijken, hier aanmelden 10. Een verhouding groter dan 10 voor grootste vs kleinste respons waarde geeft aan dat een gegevenstransformatie worden verlangd. Identificeer de meest geschikte transformatie met de juiste statistische instrumenten, bijvoorbeeld een Box-Cox plot 35.
    2. Koos een basismodel dat (i) aansluit op de geselecteerde DoE (1,2) en (ii) is het met voorkennis over het systeem onderzochte basis van de variantieanalyse (ANOVA) instrumenten van de DoE software, bijvoorbeeld een tweede orde polynoom vaak beter past bij het waargenomen effect van de incubatietijd is dan een eerste-orde polynoom.
    3. Verwijder onbelangrijke model factoren, bijvoorbeeld p> 0,05, of factor interacties iteratief door ze te deselecteren, deReby verminderen van de modelcomplexiteit en verhoging van de voorspellende kracht.
    4. Bevestig het model kwaliteit door het vergelijken van R2, gecorrigeerd R2 en voorspelde R2, samen met de normale kans plot van de studentized residuen, residuen-vs-run, voorspelde-vs-actuele en Box-Cox plots 36. Alle R2-waarden moeten binnen een 0,2 bereik.
    5. Zorg ervoor dat het uiteindelijke model is het eens met uitgangspunten van de natuurkunde en de thermodynamica, dwz geen negatieve concentraties worden voorspeld.
  2. Gebruik het model aan de voorwaarden die het meest gunstig is voor het systeem waarop het onderzoek, is hier een lage troebelheid zijn te voorspellen.
    1. Selecteert u de belangrijkste reacties en hun favoriete staten, bijvoorbeeld minimaal troebelheid. Combineer deze selecties door het maximaliseren van een wenselijkheid functie of vergelijkbare instrumenten, die zijn ingebouwde functies van de verschillende DoE softwarepakketten 36.
    2. Afhankelijk van de beoogde toepassing of het model, selecteert u een bevestiging loopt naar de optimale voorwaarden en / of de voorspellende kracht van het model in het algemeen, bijvoorbeeld nagaan of de voorwaarden voorspelde meest gunstig te zijn maakten geen deel uit van de eerste DoE selecteer ze als follow-up experimenten.

5. Verbetering van de Model en controleren de voorspellende kracht

  1. Een beperking van het eerste ontwerp ruimte om de meest wenselijke bedrijfsomstandigheden, zoals lage troebelheid in de 0-1,000 nefelometrische troebelheid eenheden (NTU) bereik, op basis van de modelvoorspellingen (4.2).
  2. Het opzetten van een nieuwe DoE binnen deze bereiken, met alleen die factoren die zijn geïdentificeerd als significant of relevant (4.1.2)).
    OPMERKING: Een factor kan belangrijk zijn wat betreft modale analyse, maar niet relevant voor een proces, namelijk het effect op een respons <1% vergeleken met die van andere factoren.
  3. Herhaal stappen 1-5,2 tot de kwaliteit van de voorspellingen is geselecteerd requirements, bijvoorbeeld de standaardafwijking van het model zoals aangegeven door de software voldoende is voor de beoogde toepassing. Wijzig de experimentele strategie indien nodig voor deze iteraties, bijvoorbeeld slechts één flocculant in de verfijning.
  4. Transfer en bevestigen de resultaten uit de schaal-down model om de pilot-schaal of definitieve productie schaal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Flocculatie tabak extract met verschillende polymeren

De hierboven beschreven werkwijze werd met succes toegepast op een werkwijze voor het uitvlokken van tabak extracten ontwikkelen tijdens de bereiding van een monoklonaal antilichaam (het HIV-neutraliserend antilichaam 2G12) en een fluorescent eiwit (DsRed) (figuur 1) 16, en is sindsdien overgebracht andere eiwitten zoals lectinen, malaria vaccin ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het belangrijkste aspect om te overwegen bij het ​​opzetten van een hinde naar deeltje flocculatie karakteriseren is dat het ontwerp moet in principe in staat zijn om de verwachte of mogelijke effecten 36,38, bijvoorbeeld de invloed van de pH, het type polymeer en polymeerconcentratie 16 detecteren en te beschrijven. Daarom is het belangrijk om de fractie van ontwerpruimte (FDS) evalueren voordat het eigenlijke experimenten. De FDS is de fractie van de multidimensionale experimentele ruimt...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteur heeft geen tegenstrijdige belangen te onthullen.

Dankbetuigingen

Ik wil Dr. Thomas Rademacher bedanken voor het verstrekken van de transgene tabakszaden en Ibrahim Al Amedi voor het kweken van de tabaksplanten. Ik wil Dr. Richard M Twyman bedanken voor redactionele assistentie en Prof. Dr. Rainer Fischer voor vruchtbare discussies. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de European Research Council Advanced Grant ''Future-Pharma'', voorstelnummer 269110, de Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) en de Fraunhofer-Gesellschaft Interne Programma's onder subsidienummer Attract 125-600164.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2100P Portable TurbidimeterHach4650000Turbidimeter
2G12 antibodyPolymunAB002Referentie-antilichaam
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01SPR-apparaat
BP-410Furh2632410001Zakfilter
Catiofast VSHBASF79002360Flocculerend middel
Centrifuge 5415DEppendorf5424 000.410Centrifuge
Centrifugebuisje 15 mlLabomedic2017106Reactiebuis
Centrifugebuisje 50 ml zelfstandigLabomedic1110504Reactiebuis
ChitosanCarl Roth GmbH5375.1Flocculerend middel
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n.v.t.DoE-software
DinatriumfosfaatCarl Roth GmbH 4984.3 Mediacomponent
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Meststof
Forma -86C ULT-vrieskastThermoFisher88400Vrieskast
Kassenkasn.v.t.n.v.t.Voor plantenkweek
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cmGrodan102446Kleiwolblok
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Mediacomponent
K700P 60DPall5302305Diepfilterlaag
KS50P 60DPallB12486Diepfilterlaag
MiraclothLabomedic475855-1RFilterdoek
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020pH-meter / geleidbaarheidsmeter
Osram koelwit 36 WOsram4930440Lichtbron
PhytotronIlka Zelln.v.t.Voor plantenkweek
Polymin PBASF79002360Flocculerend middel
POLYTRON PT 6100 DKinematica11010110Homogenisatieapparaat met aangepast mesgereedschap
Protein ALife technologies10-1006Antilichaambindend eiwit
NatriumchlorideCarl Roth GmbHP029.2Mediacomponent
Synergy HTBioTekSIAFRTFluorescentieplatelezer
TRISCarl Roth GmbH4855.3Mediacomponent
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3Mediacomponent
VelaPad 60PallVP60G03KNH4Filterhuis
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600DLS-meting van deeltjesgrootteverdeling

Referenties

  1. Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
  2. Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
  3. Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
  4. De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
  5. Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
  6. Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
  7. Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  8. Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
  9. Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
  10. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
  11. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
  12. Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
  13. Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
  14. Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
  15. Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
  16. Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
  17. Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
  18. Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
  19. Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Incorporated. (2007).
  20. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216(2014).
  21. Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
  22. Rathore, A. S., Sofer, G. Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , Taylor & Francis. (2012).
  23. Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
  24. Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
  25. Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
  26. Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
  27. Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
  28. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
  29. Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
  30. Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
  31. Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
  32. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
  33. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
  34. Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
  35. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, Taylor & Francis. (2000).
  36. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
  37. Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
  38. Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Flocculant effici ntieklaring van plantextractendesign of experimentstroebelheidsmetingpolymeerscreeningflocculatieprocesdieptefiltratietabbladextractprocesoptimalisatievaste vloeistofscheiding

Gerelateerde artikelen