We demonstreren de procedure voor intra-tracheale inoculatie van Haemophilus influenzae in de onderste luchtwegen van muizen. Dit is een zeer nuttige tool om signaleringsroutes te bestuderen die luchtwegontsteking reguleren in muismodellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hier hebben we een gedetailleerde procedure te beschrijven om efficiënt en rechtstreeks te leveren Haemophilus influenzae in de onderste luchtwegen van muizen. We tonen de procedure voor het bereiden van H. influenzae entstof, intratracheale indruppeling van H. influenzae in de longen, het verzamelen van broncho-alveolaire lavage vloeistof (BALF), analyse van immuuncellen in de BALF en RNA-isolatie van differentiële genexpressie analyse. Deze procedure kan worden gebruikt om de long ontstekingsreactie op bacteriën, virussen of fungi. Direct tracheale instillatie wordt meestal de voorkeur boven intranasale of aërosol inhalatie procedures omdat het efficiënter levert het bacteriële inoculum in de onderste luchtwegen minder dubbelzinnigheid.
Inleiding
Ontsteking is een fundamenteel immuun mechanisme van verdediging tegen infectieuze agentia. Het bevordert pathogeen uitroeiing en de reparatie van beschadigd weefsel. Het vergemakkelijkt ook het herstel naar een normale gezonde toestand 1. Echter, ontregelde ontsteking leidt vaak tot chronische ontstekingsziekten 2. Luchtwegontsteking een initiële trigger voor verschillende longziekten zoals chronische obstructieve longziekte (COPD), astma en longfibrose 3.
De niet-typeerbare (ingekapseld) Haemophilus influenzae (NTHi) is geassocieerd met chronische bovenste en onderste long ontstekingsziekten 4,5. Het is de dominante species geïsoleerd uit de lagere luchtwegen van kinderen en volwassenen met chronische obstructieve longziekte 4,6,7. De ontstekingsreactie na NTHi infectie wordt gekenmerkt door de verhoogde expressie van pro-inflammatoire cytokinen (zoals TNF en IL-1β) en wordt gemedieerd by mitogeen geactiveerd proteïne kinase (MAPK) en nucleaire factor-kB (NF-KB) door middel van toll-like receptoren (TLRs) 8.
Muis zijn zeer nuttige hulpmiddelen voor het analyseren van de onderliggende pathologie van long- ontsteking vanwege de beschikbaarheid van verschillende gen-deficiënte lijnen. Verscheidene methoden zijn voor levende / verzwakte bacteriën en bacteriële producten, waaronder intranasale instillatie en aërosol inhalatie 9,10 inoculeren. Hier tonen we intra-tracheale instillatie. Hoewel minder frequent gebruikt, deze benadering is efficiënter en zeer reproduceerbare vanwege de directe levering van het entmateriaal tot de onderste luchtwegen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Baylor Research Institute.
1. Het kweken van niet-typeerbare Haemophilus influenzae (NTHi) en voorbereiden Inoculum
- NTHi plaat op een chocolade agar plaat en houden de plaat ondersteboven in een bevochtigde CO2 incubator gedurende de nacht bij 37 ° C en 5% CO2. De volgende dag, de cultuur van de bacteriën in de hersenen het hart infusie bouillon. Voeg vervolgens 1 ml van de kweekvloeistof in een steriele 1,5 ml buis.
- Centrifugeer bij 4000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens gooi het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml steriel 1x PBS. Herhaal deze stap een keer.
- Transfer 100 ul geresuspendeerde oplossing in 900 pl 1x PBS en meet de absorptie van de verdunde kweek bij golflengte 600 nm in een spectrofotometer.
- Bepaal de levensvatbaarheid en kiemgetals (CFU's) van het inoculum door het kweken 01:10 seriële verdunningen op chocolade-agarplaten en gedurende de nacht incuberen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Gebaseerd op de levensvatbaarheid en CFU's bepaald uit de vorige stap, passen de entmateriaal tot een eindconcentratie van 20 x 10 6 CFU / ml.
2. intratracheale (it) Blaasinstillatie
- Injecteer de muis intraperitoneaal (ip) met 0,1 ml / 10 g lichaamsgewicht van muizen met 150 mg / ml ketamine + 20 mg / ml xylazine oplossing. De procedure moet worden gedaan in de kap met een lichtbron om het dier warm te houden.
- Knijp de tussenklauwspleet van de muis om te controleren of de muis op adequate wijze wordt verdoofd.
- Plaats de muis op de rug. Scheer de ventrale gebied van de nek en ontsmet met chloorhexidine en 70% ethylalcohol.
- Til de huid van het bovenste ventrale deel van de nek met behulp rat tand tang. Voeg een kleine incisie (0,5-1,0 cm) boven de thymus met behulp van een scalpelen zorgvuldig ontleden de spier de luchtpijp bloot.
- Met behulp van een 1 ml spuit met een 27 G naald en injecteer langzaam 0,05 ml lucht, gevolgd door 0,05 ml NTHi verkregen afdeling 1 of zoutoplossing als controle, gevolgd door nog 0,05 ml lucht. Houd dier verticaal voor ongeveer 1 min.
- Sluit de incisie met chirurgische lijm. Houd de muis zijwaarts ligfiets en warm voor ongeveer 10 minuten.
3. BALF Collection
- Offer de muis door cervicale dislocatie 24 uur na infectie.
- Open de buikholte van de muis met anatomische schaar en snijd de ventrale aorta te bloeden. Expose het ventrale deel van de long.
- Expose de luchtpijp en intuberen het met een 20 gauge katheter. Inboezemen 0,8 ml BALF buffer (1x PBS, 0,1% dextrose, 10 U / ml heparine) en het verzamelen van de lavage door zachte aspiratie. Herhaal deze procedure drie keer.
- Tel het aantal cellen in 100 ui BALF suspensie op met een hemocytometer onder 10x vergroting met trypan Blue kleuring.
- Bereid je dia's voor gemodificeerde Giemsa kleuring. Aliquot 100 ul van BALF in de geschikte putjes van de Cytospin en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. Droog de objectglaasjes gedurende 10 minuten en vlekken op de cellen onder toepassing van gemodificeerde Giemsa-kleuring volgens de protocollen van de fabrikant.
- Met de resterende cellen voor daaropvolgende analyse, zoals fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), confocale microscopie, genexpressie en Western blot 11-13.
4. Histopathologie Voorbereiding
- Voor histopathologie-analyse, infecteren muizen met NTHi zoals beschreven in stap 2.4. Na 24 uur van de infectie, offeren de dieren door cervicale dislocatie. Opengesneden de borstholte anatomische schaar om de longen en luchtpijp zoals eerder vermeld bloot. Steek dan de 20 gauge katheter in de luchtpijp.
- Vul de long met 2% agarose warme oplossing bereid in 4% formaline. Zodra delongen volledig opgeblazen, plaats ijs bovenop de longen naar de agarose oplossing stollen.
- Verwijder dan voorzichtig de thoracale stekker en zet het in een 50 ml oplossing van 4% formaline in 1x PBS totdat het wordt verwerkt voor hematoxyline en eosine (H & E) secties.
5. FACS kleurende cellen in de BALF
- Zet 1 x 10 5 cellen uit de BALF vloeistof in een 96-well V-bodem microtiterplaat.
- Was de cellen met 300 pi koude 1x PBS en centrifugeren bij 4000 g gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Vlekken op de cellen met een oplossing cel vlek in 100 pl 1x PBS (1: 1000 verdunning) en bewaar bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Was de cellen met 300 pi koude 1x PBS bij 4000 g gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Blijf cellen in 100 gl FACS wasbuffer [wasbuffer (1 x PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA, 0,1% natriumazide] met 1: 100 verdund Fc-Block for 15 min bij 4 ° C.
- Centrifugeer cellen bij 4000 xg gedurende 3 minuten en gooi supernatant.
- Vlek cellen met 100 pi oppervlak kleuring cocktail (1: 100 verdunning) in FACS wasbuffer gedurende 30 min bij 4 ° C.
- Was de cellen drie maal met 300 ui FACS wasbuffer bij 4000 g gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Fix cellen in 100 pi 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen tweemaal met 300 gl 1 x PBS bij 400 g gedurende 3 min bij 4 ° C en resuspendeer in 300 ul FACS wasbuffer.
- Maak een kleur kleuring controles met behulp van flowcytometrie kralen.
- Één druppel kralen in de 96-well V-bodem microliter plaat en wassen met 200 pl 1x PBS.
- Voeg 1 pl kleuring antilichaam aan 100 pl 1x PBS en kralen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Was kralen tweemaal met 300 pl 1x PBS.
- Analyseer enkele gekleurde controles en cellen door flowcytometrie 14.
6. Homogenisatie van longweefsel RNA isoleren
- Na infectie, het verzamelen van een klein stukje van de long (20-40 mg) en bewaar het in RNA stabiliserend reagens bij 4 ° C gedurende de nacht. Vervolgens slaan bij -80 ° C tot de volgende stap.
- Was het longweefsel in koude 1x PBS om zich te ontdoen van het RNA stabilisatie reagens te krijgen.
- Plaats het weefsel in een 1,5 ml centrifugebuis bevattende lysisbuffer (1 ml lysis buffer + 10 gl β-mercaptoethanol).
- Hak het weefsel in kleine stukjes met behulp van puntige schaar en homogeniseren met behulp van een draadloze motor pellet stamper voor 20-40 sec.
- Houd het lysaat op ijs gedurende 5 minuten en ga verder met stap 7.1.
7. RNA isolatie uit de Lung
- Centrifugeer het lysaat bij 18.000 xg gedurende 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren voorzichtig overbrengen naar een nieuwe 1,5 ml buis.
- Voeg 1 volume 70% ethanol aan het lysaat. Meng onmiddellijk door pipetteren en wacht 2-4 min.
- Transfer tot 700 ul lysaat een spinkolom geplaatstin een 2 ml verzamelbuis.
- Centrifugeer bij 9600 xg gedurende 15 sec en gooi het doorstroomkanaal.
- Voeg 350 ul stringente wasbuffer en centrifugeer bij 9600 xg gedurende 15 sec. Gooi het doorstroomkanaal.
- Voeg 80 ul DNase I direct naar spinkolom membraan en bewaren bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Voeg 350 ul stringente wasbuffer om de spin kolom en centrifugeer bij 9600 xg gedurende 15 sec. Gooi het doorstroomkanaal.
- Voeg 500 ul RNA wasbuffer en centrifugeer bij 9600 xg gedurende 15 sec. Gooi het doorstroomkanaal.
- Voeg 500 ul RNA wasbuffer en draaien op 9600 xg gedurende 2 minuten. Gooi het doorstroomkanaal.
- Plaats de spinkolom in een nieuwe 2 ml verzamelbuis en centrifugeer bij 9600 xg gedurende 1 min. Gooi het doorstroomkanaal.
- Voeg 30-50 ul RNase-vrij water direct naar spinkolom en centrifugeer bij 9600 xg gedurende 1 min. RNA opslag bij -80 ° C.
- Voer RNAseq analyse 14.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Intratracheale instillatie leidde tot een duidelijk verhoogde aantal leukocyten in BALF (Figuur 1A, linkerpaneel) inrichtingskosten met zoutoplossing. De differentiële telling analyse van de leukocyten bleek duidelijk toegenomen infiltratie van neutrofielen (figuur 1, rechter paneel). De FACS analyse van de cellen in de BALF voorts bevestigd het toegenomen aantal neutrofielen (figuur 1B). Histologische analyse van H & E-gekleurde cou...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hierin wij een unieke en minimaal invasieve procedure beschrijft de longen van muizen te inoculeren met een bacteriële ziekteverwekker long. We tonen aan dat deze procedure kan worden gebruikt om de functie van verschillende genen bij muizen die deficiënt zijn in de genen van inflammatoire signaalroutes zijn bestuderen. Deze procedure kan ook worden gebruikt om de ontstekingsreacties op virale en fungale longinfecties bestuderen. De voordelen van deze werkwijze ten opzichte van andere werkwijzen zoals intranasale of aër...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We bedanken Dr. Carson Harrod voor het kritische lezen van het manuscript. We bedanken ook de heer Minghui Zeng en Drs. Mahesh Kathania en Prashant Khare voor hun bijdragen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Cancer Society (Research Scholar-subsidie, 122713-RSG-12-260-01-LIB) en het Sammons Cancer Center (Pilot Project-subsidie) aan K. Venuprasad.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Werkverdunning 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Werkverdunning 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
Referenties
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
- Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
- King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376(2015).
- Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
- King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
- Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
- Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
- Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
- Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
- Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188(2013).
- Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446(2015).
- Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22(2015).
- Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
- Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. Chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 379, 1341-1351 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
