We demonstreren de procedure voor intra-tracheale inoculatie van Haemophilus influenzae in de onderste luchtwegen van muizen. Dit is een zeer nuttige tool om signaleringsroutes te bestuderen die luchtwegontsteking reguleren in muismodellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hier hebben we een gedetailleerde procedure te beschrijven om efficiënt en rechtstreeks te leveren Haemophilus influenzae in de onderste luchtwegen van muizen. We tonen de procedure voor het bereiden van H. influenzae entstof, intratracheale indruppeling van H. influenzae in de longen, het verzamelen van broncho-alveolaire lavage vloeistof (BALF), analyse van immuuncellen in de BALF en RNA-isolatie van differentiële genexpressie analyse. Deze procedure kan worden gebruikt om de long ontstekingsreactie op bacteriën, virussen of fungi. Direct tracheale instillatie wordt meestal de voorkeur boven intranasale of aërosol inhalatie procedures omdat het efficiënter levert het bacteriële inoculum in de onderste luchtwegen minder dubbelzinnigheid.
Inleiding
Ontsteking is een fundamenteel immuun mechanisme van verdediging tegen infectieuze agentia. Het bevordert pathogeen uitroeiing en de reparatie van beschadigd weefsel. Het vergemakkelijkt ook het herstel naar een normale gezonde toestand 1. Echter, ontregelde ontsteking leidt vaak tot chronische ontstekingsziekten 2. Luchtwegontsteking een initiële trigger voor verschillende longziekten zoals chronische obstructieve longziekte (COPD), astma en longfibrose 3.
De niet-typeerbare (ingekapseld) Haemophilus influenzae (NTHi) is geassocieerd met chronische bovenste en onderste long ontstekingsziekten
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Baylor Research Institute.
1. Het kweken van niet-typeerbare Haemophilus influenzae (NTHi) en voorbereiden Inoculum
- NTHi plaat op een chocolade agar plaat en houden de plaat ondersteboven in een bevochtigde CO2 incubator gedurende de nacht bij 37 ° C en 5% CO2. De volgende dag, de cultuur van de bacteriën in de hersenen het hart infusie bouillon. Voeg vervolgens 1 ml van de kweekvloeistof in een steriele 1,5 ml buis.
- Centrifugeer bij 4000 xg gedurende 5....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Intratracheale instillatie leidde tot een duidelijk verhoogde aantal leukocyten in BALF (Figuur 1A, linkerpaneel) inrichtingskosten met zoutoplossing. De differentiële telling analyse van de leukocyten bleek duidelijk toegenomen infiltratie van neutrofielen (figuur 1, rechter paneel). De FACS analyse van de cellen in de BALF voorts bevestigd het toegenomen aantal neutrofielen (figuur 1B). Histologische analyse van H & E-gekleurde cou.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hierin wij een unieke en minimaal invasieve procedure beschrijft de longen van muizen te inoculeren met een bacteriële ziekteverwekker long. We tonen aan dat deze procedure kan worden gebruikt om de functie van verschillende genen bij muizen die deficiënt zijn in de genen van inflammatoire signaalroutes zijn bestuderen. Deze procedure kan ook worden gebruikt om de ontstekingsreacties op virale en fungale longinfecties bestuderen. De voordelen van deze werkwijze ten opzichte van andere werkwijzen zoals intranasale of aër.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We bedanken Dr. Carson Harrod voor het kritische lezen van het manuscript. We bedanken ook de heer Minghui Zeng en Drs. Mahesh Kathania en Prashant Khare voor hun bijdragen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Cancer Society (Research Scholar-subsidie, 122713-RSG-12-260-01-LIB) en het Sammons Cancer Center (Pilot Project-subsidie) aan K. Venuprasad.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Werkverdunning 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Werkverdunning 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
Referenties
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Barnes, P. J.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Meer artikelen verkennen
