De combinatie van Double Fluorescentie In Situ Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties

Samenvatting

Het lokaliseren van genexpressie naar specifieke celtypen kan een uitdaging zijn vanwege het ontbreken van specifieke antilichamen. Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige driedubbele detectie van genexpressie door dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie te combineren met immunokleuring.

Samenvatting

Detectie van genexpressie in verschillende hersencellen bijvoorbeeld neuronen, astrocyten, oligodendrocyten, oligodendrocyt voorlopers en microglia, kan worden belemmerd door het gebrek aan specifieke primaire of secundaire antilichamen voor immunokleuring. Hier beschrijven we een protocol voor de expressie van drie verschillende genen in dezelfde hersenpreparaat met dubbelzijdige fluorescentie in situ hybridisatie detecteren met twee genspecifieke probes, gevolgd door immunokleuring met een antilichaam met hoge specificiteit die is gericht tegen het eiwit dat wordt gecodeerd door een derde gen. De Aspartoacyclase (ASPA) gen, mutaties die leiden tot een zeldzame menselijke wittestofziekte - ziekte Canavan - wordt gedacht te worden uitgedrukt in oligodendrocyten en microglia, maar niet in astrocyten en neuronen. De precieze expressiepatroon van ASPA in de hersenen nog niet vastgesteld. Dit protocol heeft ons in staat gesteld om te bepalen dat ASPA wordt uitgedrukt in een subset van volwassen oligodendrocyten eennd kan algemeen worden toegepast op een breed scala van genexpressiepatroon studies.

Inleiding

Gliacellen, die de meest voorkomende cellen in het centrale zenuwstelsel (CNS) zijn, omvatten oligodendrocyten (de myeliniserende cellen van CNS), oligodendrocyten precursors (OP's, ook bekend als "NG2 cellen"), astrocyten en microglia. Er is toenemende interesse in de functies van gliacellen en hun potentiële rol bij neurologische aandoeningen ^1. Bijvoorbeeld, ziekte van Canavan (CD) is een erfelijke neurodegeneratieve aandoening de aanvang van de kinderjaren met spongiforme leukodystrofie en een progressief verlies van neuronen, wat leidt tot de dood gewoonlijk voor 10 jaar ^2,3. Mutaties in de Aspartoacyclase (ASPA) gen die leiden drastisch verminderde activiteit ASPA ⁴ CD geïdentificeerd. ASPA is een enzym katalyseert de deacetylering van N-acetylaspartate (NAA), een molecuul sterk geconcentreerd in de hersenen, het genereren acetaat en aspartaat ^5-7. Veel cd patiënten vertonen hogere NAA door gebrek aan ASPA acteit. Sommige studies speculeren dat NAA-afgeleide acetaat een belangrijke bron van vetzuren / lipiden in de hersenen tijdens de ontwikkeling zou kunnen zijn en CD gevolg kunnen zijn van verminderde myeline synthese tijdens de ontwikkeling veroorzaakt door het falen van NAA worden afgebroken ^3,5,6.

ASPA wordt vooral aangetroffen in de nieren, de lever en witte stof van de hersenen, en gezien de belangrijke rol van ASPA in CD, heeft de cellulaire expressie van dit enzym in de hersenen bestudeerd door verschillende laboratoria. Door te kijken naar ASPA enzymatische activiteit in de hersenen, eerdere studies bleek dat de toename van ASPA activiteit tijdens hersenontwikkeling loopt parallel met het tijdsverloop van myelinisatie ^8-10. Op cellulair niveau assays voor enzymactiviteit als in situ hybridisatie (ISH) en immunohistochemie (IHC) analyses blijkt dat ASPA vooral uitgedrukt in oligodendrocyten in de hersenen, maar niet in neuronen en astrocyten ^11-16. Een paar studies bleek dat ASPA zou ookuitgedrukt in microglia in het CZS ^12,14. Tot nu toe gegevens over ASPA meningsuiting in OP's zijn beperkt. Volgens een recente studie waarin transcriptomes verschillende celtypen bij muizen cerebrale cortex inclusief neuronen, astrocyten, OP's, nieuw gevormde oligodendrocyten, myeliniserende oligodendrocyten, microglia, endotheelcellen en pericyten werden geanalyseerd door RNA sequentie ¹⁷ wordt ASPA uitsluitend uitgedrukt in oligodendrocyten , in het bijzonder in myelinating oligodendrocyten (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Ondanks deze studies ASPA expressiepatroon in de hersenen, een aantal onzekerheden blijven.

Verschillende technieken kunnen worden gebruikt om genexpressie patronen bestuderen. IHC is een algemeen gebruikte werkwijze voor het detecteren van functionele product (dwz eiwit) van genexpressie in weefselcoupes. Ondanks zijn grote nut, deze techniek heeft beperkingen als de toepassing ervan en specificiteit zijn afhankelijk van to de beschikbaarheid en specificiteit van het antilichaam nodig is. Ter vergelijking, ISH heeft het voordeel dat de expressie van elk gen onthullen op het mRNA-niveau. Het kan echter technisch moeilijk om meerdere probes tegelijkertijd om een ​​genexpressie tot specifieke celtypen te lokaliseren. In dit artikel beschrijven we een protocol combineert dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie met fluorescentie immunolabel van een eiwit. We hebben deze set van technieken die worden gebruikt om de expressie patroon van Aspa in muizenhersenen te onderzoeken. Deze methode kan de precieze studie van genexpressie met behulp van confocale microscopie.

Protocol

Ethiek Verklaring:
Muis veehouderij en de behandeling zijn in overeenstemming met de Britse ministerie van Binnenlandse Zaken verordeningen en de UCL richtlijnen ethische commissie, die voldoet aan de Dieren (Scientific Procedures) Act 1986 van het Verenigd Koninkrijk en zijn amendement Regulations 2012.

LET OP: Alle oplossingen moeten worden gemaakt met diethylpyrocarbonaat (DEPC) - behandeld water om eventueel achtergebleven RNase vernietigen. Voor DEPC behandeling, voeg DEPC (1 ml per liter), schud krachtig tot alle DEPC bolletjes vervolgens verdwenen Autoclaveer de DEPC degraderen.

1. RNA Probe Synthesis

1. LET OP: Bij het hanteren van formamide, Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en gebruik een veiligheidskabinet. Bereid hybridisatiebuffer:-DEPC behandeld gedeïoniseerd water met 50% (v / v) gedeïoniseerd formamide, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH _{2PO 4,} 5 mM Na ₂ HPO _4, 0,01 mg / ml gist tRNA, 1 x Denhardt's solution, en 10% w / v dextran sulfaat.
2. Kies een DNA kloon die de cDNA-sequentie van het gen van belang in een plasmide met RNA polymerase promoters bevat. Voor dit voorbeeld, gebruik dan een pCMV-sport6 ​​kloon, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934), met T7 en Sp6 RNA-polymerase promoters voor Aspa (aanvullende figuur 1).
3. Bereid gelineariseerd plasmide-DNA als template.
   1. Groeien de DNA-kloon, extraheer het plasmide met een kleinschalige plasmide zuivering kit volgens het protocol van de fabrikant en de sequentie met T7 en Sp6 universele primers.
   2. Digest 1020 ug plasmide-DNA met een restrictie enzym dat knipt op het 5'-uiteinde van de sense streng van het cDNA. Voor dit voorbeeld gebruiken 100 unit Sall aan de pCMV-SPORT6- Aspa plasmide verteren. Incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 ^oC
   3. Voer een kleine hoeveelheid op een agarosegel om te controleren of het plasmide volledig lineair.
4. Zuiver hetgelineariseerde plasmide met behulp van fenol-chloroform.
   1. Voeg 1/10 volume 3 M natriumacetaat, één volume 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) - geëquilibreerde fenol en één volume chloroform / isoamylalcohol (IAA) (24: 1).
   2. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur (20 - 25 ° C, RT) en extraheer bovenste waterfase.
   3. Dient een hoeveelheid chloroform / IAA, centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 1 min en extraheer bovenste waterfase.
   4. Herhaal stap 1.4.3.
   5. Voeg 2 volumina ethanol en laat bij -20 ^° C gedurende 1 uur of O / N.
   6. Centrifugeer bij 16.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant.
   7. Was de pellet met 70% koude ethanol en resuspendeer in bij benadering 1 ug cDNA per 2,5 pl in TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5).
5. Synthetiseren de twee probes, een gelabeld met digoxigenine (DIG) en een met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC).
   1. Selecteer de geschikte RNA polymerase om de anti-se makenNSE probe (complementair aan het doel mRNA). Voor dit voorbeeld gebruikt T7 RNA polymerase te maken Aspa probe.
   2. Bereid in vitro transcriptiereactie: voeg 1 ug van het gelineariseerde DNA, 4,0 ui 5 x transcriptiebuffer, 6,0 pl 100 mM DTT, 2,0 ui 10X DIG of FITC RNA labeling mix met dNTPs, 1 pl RNase inhibitor, en 20 - 40 eenheden van RNA-polymerase; de uiteindelijke volume tot 20 ul met DEPC behandeld water.
   3. Incubeer bij 37 ^° C gedurende 1,5 uur.
6. Run1 ul van de transcriptie reactie op een 1,0% agarosegel om te controleren of de reactie heeft gewerkt. De gel moet de lineaire sjabloon en een lichte band van de sonde te laten zien.
7. Voeg een volume van 100 ul met hybridisatiebuffer en bewaar 10 gl aliquots bij -80 ° C.

2. Perfusie, Fixatie en Tissue Collection

1. LET OP: Bij het hanteren van paraformaldehyde (PFA), zowel vast alswaterige, slijtage PPE en het gebruik van een veiligheidskabinet. Bereid formaldehyde oplossing door het oplossen van 4% (w / v) PFA in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing met warmte (55 ° C). Filter de formaldehyde-oplossing met filter papier.
2. Bereid sucrose oplossing door het oplossen van 20% (w / v) sucrose in gedestilleerd water en voeg 0,1% (v / v) DEPC oplossing. Laat O / N bij kamertemperatuur met een losse deksel en vervolgens autoclaaf.
3. Terminaal verdoven een muis door intraperitoneale injectie van pentobarbiton (50 mg / kg). Beoordeel de diepte van de anesthesie door teen knijpen en de afwezigheid van de terugtrekking reflex duidt diepe narcose.
4. Zodra de muis onder diepe narcose, een insnijding onder de ribbenkast en doorsnijden de ribbenkast aan beide zijden te tillen om het hart bloot te leggen.
5. Plaats een 25-G naald in de linker ventrikel van het hart. Maak een kleine incisie in de rechterboezem van het hart.
6. Perfuseren het dier met 20 ml PBS en 40 ml formaldehyde-oplossing. Voor P30 en oudermuizen, gebruikt een perfusie snelheid van 12 ml / min maar jonge dieren gebruiken een lagere (7-10 ml / min).
7. Ontleden de hersenen.
   1. Sever de muis hoofd met chirurgische schaar door het maken van een snede posterior uit de oren. Maak een caudale middellijn incisie in de huid en werken rostraal om de huid van de schedel te verwijderen.
   2. Vanaf het caudale deel, dwars door de bovenkant van de schedel middellijn langs en tussen de ogen met Iris schaar. Verwijder de pariëtale en frontale bot platen door het kantelen van de ene kant van een bot plaat elke keer en snapping het af met een pincet.
   3. Kantel de hersenen naar boven uit het voorste deel met een pincet en snijd de optische zenuwen en andere hersenzenuwen. Til de hersenen uit de schedel.
8. Plaats de hersenen in een muis coronale hersenen matrix. Snijd de hersenen in het 3 ongeveer 4 mm stuks met een veer scheermesje.
9. Breng de plakjes in 4% PFA-oplossing en incubeer O / N bij 4 ° C.
10. overdracht hersenenplakjes DEPC-behandeld 20% sucrose-oplossing en incubeer O / N bij 4 ° C
11. Plaats elke hersenen slice in een droge cryomould, omringen met optimale snij-temperatuur (LGO) medium en vries op droog ijs. Bewaar bij -80 ° C.

3. cryosectioning

1. Snij 15 micrometer secties van ingevroren weefsel in een cryostaat en het verzamelen van de secties op microscoop dia's. Indien nodig, nat van de secties met DEPC behandeld PBS en druk ze plat met een fijn penseel.
2. Laat de dia's drogen gedurende ongeveer 1 uur zodat het weefsel hecht aan de dia.

4. hybridisatie

1. Bereid 65 ° C wasbuffer: 150 mM NaCl, 15 mM Na ₃ C ₃ H ₅ O (COO) ₃ (= 1x saline natriumcitraat), 50% (v / v) formamide en 0,1% (v / v) Tween- 20.
2. Bereid MABT buffer: 100 mM maleïnezuur, 150 mM NaCl, 0,1% (v / v) Tween-20, pH 7,5.
3. Verdun de twee sondes (DIG gemerkte en FITC-gelabelded) 1/1000 in hybridisatiebuffer voorverwarmd tot 65 ° C en meng.
4. Toepassen ongeveer 300 gl hybridisatiemengsel op elke dia coverslipwith oven gebakken (200 ^° C) dekglaasjes en geïncubeerd O / N bij 65 ° C in een bevochtigde kamer.
5. Overdracht van de dia's in een Coplin pot met voorverwarmde wasbuffer. Was de dia's voor 30 minuten tweemaal bij 65 ° C met wasbuffer.
6. Was de dia's voor 10 min driemaal met MABT bij kamertemperatuur.

5. Visualisatie van de FITC Probe

1. Bereid ISH blokkeerbuffer: MABT met 2% blokkeerreagens en 10% door warmte geïnactiveerd serum schapen.
2. Optioneel: gebruik een hydrofoob pen om cirkels rond de weefselcoupes maken van de schuif naar volume antilichaam oplossingen vereist verminderen.
3. Incubeer de glaasjes gedurende 1 uur bij KT met ISH blokkerende buffer in een bevochtigde kamer.
4. Incubeer de glaasjes O / N bij 4 ° C met een mierikswortel peroxidase (POD) - conjugaatd anti-FITC antilichaam verdund 1/500 (v / v) in blokkeerbuffer ISH.
5. Plaats de objectglaasjes in een Coplin pot met PBS met 0,1% (v / v) Tween-20 (PBST). Was 3 keer voor 10 min in PBST en vervangen door verse PBST elke keer.
6. Vlak voor het gebruik, de voorbereiding van de fluorescerende tyramide door verdunning 100 keer in de Amplification verdunner. Voor dit voorbeeld gebruiken FITC-tyramide.
7. Voeg dit toe aan de dia en laat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
8. Plaats de objectglaasjes in een Coplin jar en was 3 keer in PBST gedurende 10 minuten.

6. Visualisatie van de DIG Probe

1. Bereid 0,1 M Tris-HCl pH 8,2.
2. Incubeer de glaasjes met ISH blokkerende buffer gedurende 1 uur bij KT.
3. Incubeer de glaasjes O / N bij 4 ° C met alkalische fosfatase (AP) geconjugeerd anti-DIG antilichaam verdund 1/1500 (v / v) in blokkeerbuffer ISH.
4. Wassen met MABT gedurende 10 min driemaal.
5. Was tweemaal met 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
6. Vlak voor het gebruik, voor te bereiden Fast Rode oplossing door het oplossen van de tabletten in 0,1 M Tris pH 8,2. Filtreer de oplossing door een 0,22 pm filter.
7. Incubeer de glaasjes bij 37 ° C met Fast Red-oplossing in een bevochtigde kamer. Aangezien de tijd voor een optimale ontwikkeling varieert, controleer de objectglaasjes regelmatig met een fluorescentiemicroscoop om de neerslagvorming te controleren. Voor dit voorbeeld, stop de reactie na 2-3 uur.
8. Wassen met PBST gedurende 10 min driemaal.

7. Immunohistochemie

1. Bereid IHC blokkerende buffer: 10% (v / v) serum (van een andere soort dan primair antilichaam host) in PBST.
2. Incubeer dia's met IHC blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer.
3. Bereid primaire antilichaam: verdun het primaire antilichaam in een geschikte verdunning in PBST met 5% serum (van een andere soort dan primaire antilichaam host). Voor dit voorbeeld, gebruik maken van een konijn anti-Olig2 antilichaam bij 1/400 (v / v) verdunning.
4. Incubeer in het primaire antilichaamoplossing bij 4 ° CO / N.
5. Wassen met PBST gedurende 10 min driemaal.
6. Bereid secundair antilichaam: verdun een fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam bij een passende verdunning in PBST met 5% (v / v) serum (van een andere soort dan primair antilichaam host) en 0,1% (v / v) Hoechst 33258. Voor dit voorbeeld gebruik een ezel anti-konijn secundair antilichaam bij Alexa647 1/1000 (v / v) verdunning.
7. Incubeer in het secundaire antilichaamoplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
8. Wassen met PBST gedurende 10 min driemaal.

8. Montage

1. Gedeeltelijk Droog de glaasjes bij kamertemperatuur, en monteer met een fluorescentie montage medium. Laat de dia's beeld, 20X en 63X doelstellingen gebruikt 4 verschillende kanalen met de volgende golflengten drogen en in een confocale microscoop onder 10X: 570 nm voor Fast Red, 488 nm voor FITC, 647 nm voor Olig2 immunolabeling en 350 nm voor Hoechst .

Resultaten

Dit artikel beschrijft een werkwijze voor dubbel fluorescentie ISH gevolgd door immunolabeling in muizenhersenen secties. Een korte beschrijving van dit protocol wordt getoond in figuur 1. De eerste stap was probes specifiek voor Aspa en Mbp (myeline basisch eiwit) synthetiseren. Nagaan of de probes waren gesynthetiseerd, een kleine hoeveelheid van elke reactie werd over agarose gel. De zwakke lineaire template en een groot deel van de RNA probe te zien...

Discussie

Dit protocol wordt stap-voor-stap procedure voor een dubbele RNA in situ hybridisatie gevolgd door immunokleuring. We hebben dit protocol dat wordt gebruikt om te bevestigen dat Aspa wordt uitgedrukt in mature oligodendrocyten in verschillende hersengebieden.

Deze multi-step procedure vele valkuilen die gevoeligheid kan beïnvloeden en moeten worden vermeden. Ten eerste, alle oplossingen en buffers voor opslag transcriptiereactie nodig RNase-vrij zijn. Ten tweede, de keuze v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
QIAprep Miniprep	Qiagen	27104
Deionized formamide	Sigma	F9037	voor ISH blokkeer buffer
Sodium chloride	Sigma	S3014
Trizma Base	Sigma	T1503
Hydrochloric acid	VWR International	20252.290
Sodium phosphate monobasic anhydrous	Sigma	S8282
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma	30435
Yeast tRNA	Roche	10109495001
50x Denhardt's solution	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
Aspa cDNA clone	Source Bioscience	IRAVp968C0654D
SalI	New England Biolabs	R0138
Sodium acetate	Sigma	S2889
Equilibrated phenol	Sigma	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Isoamyl alcohol	Aldrich	496200
Ethanol	VWR International	20821.321
T7 RNA polymerase	Promega	P4074
Transcription buffer	Promega	P118B
100 mM DTT	Promega	P117B
UTP-DIG NTP mix	Roche	11277073910
Rnasin	Promega	N251B
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Filter paper	Fisher scientific	005479470
Sucrose	Sigma	59378
Diethyl pyrocarbonate	Sigma	D5758
Pentobarbitone	Animalcare Ltd	BN43054
Dissecting scissors	World Precision Instruments	15922
25 gauge needle	Terumo	300600
Peristaltic pump	Cole-Parmer Instrument Co. Ltd	WZ-07522-30
Iris scissors	Weiss	103227
No.2 tweezers	World Precision Instruments	500230
Coronal Brain Matrix	World Precision Instruments	RBMS-200C
Razor blade	Personna Medical	PERS60-0138
OCT medium	Tissue tek	4583
Cryostat/microtome	Bright
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Sodium citrate	Sigma	S4641	voor 65 °C was buffer
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
Blocking reagent	Roche	11096176001
Heat-inactivated sheep serum	Sigma	S2263
Hydrophobic pen	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	1:500
α-FITC POD-conjugated antibody	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	1:1,500
α-DIG AP-conjugated	Roche	11093274910
Fast red tablets	Roche	11496549001
.22 µM filter	Millex	SLGP033RS
α-Olig2 Rabbit antbody	Millipore	AB9610
Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody	Life technologies	A-31573	1:1,000
bisBenzimide H 33258	sigma	B2883
Mounting medium	Dako	S3023
Leica SP2 confocal microscope	Leica