Methodenartikel

De combinatie van Double Fluorescentie In Situ Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties

DOI:

10.3791/53976

⸱

26 maart 2016

 ,  ,  ,  , 
1Wolfson Institute for Biomedical Research, University College London

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het lokaliseren van genexpressie naar specifieke celtypen kan een uitdaging zijn vanwege het ontbreken van specifieke antilichamen. Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige driedubbele detectie van genexpressie door dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie te combineren met immunokleuring.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Detectie van genexpressie in verschillende hersencellen bijvoorbeeld neuronen, astrocyten, oligodendrocyten, oligodendrocyt voorlopers en microglia, kan worden belemmerd door het gebrek aan specifieke primaire of secundaire antilichamen voor immunokleuring. Hier beschrijven we een protocol voor de expressie van drie verschillende genen in dezelfde hersenpreparaat met dubbelzijdige fluorescentie in situ hybridisatie detecteren met twee genspecifieke probes, gevolgd door immunokleuring met een antilichaam met hoge specificiteit die is gericht tegen het eiwit dat wordt gecodeerd door een derde gen. De Aspartoacyclase (ASPA) gen, mutaties die leiden tot een zeldzame menselijke wittestofziekte - ziekte Canavan - wordt gedacht te worden uitgedrukt in oligodendrocyten en microglia, maar niet in astrocyten en neuronen. De precieze expressiepatroon van ASPA in de hersenen nog niet vastgesteld. Dit protocol heeft ons in staat gesteld om te bepalen dat ASPA wordt uitgedrukt in een subset van volwassen oligodendrocyten eennd kan algemeen worden toegepast op een breed scala van genexpressiepatroon studies.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gliacellen, die de meest voorkomende cellen in het centrale zenuwstelsel (CNS) zijn, omvatten oligodendrocyten (de myeliniserende cellen van CNS), oligodendrocyten precursors (OP's, ook bekend als "NG2 cellen"), astrocyten en microglia. Er is toenemende interesse in de functies van gliacellen en hun potentiële rol bij neurologische aandoeningen 1. Bijvoorbeeld, ziekte van Canavan (CD) is een erfelijke neurodegeneratieve aandoening de aanvang van de kinderjaren met spongiforme leukodystrofie en een progressief verlies van neuronen, wat leidt tot de dood gewoonlijk voor 10 jaar 2,3. Mutaties in de Aspartoacyclase (ASPA) gen d....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethiek Verklaring:
Muis veehouderij en de behandeling zijn in overeenstemming met de Britse ministerie van Binnenlandse Zaken verordeningen en de UCL richtlijnen ethische commissie, die voldoet aan de Dieren (Scientific Procedures) Act 1986 van het Verenigd Koninkrijk en zijn amendement Regulations 2012.

LET OP: Alle oplossingen moeten worden gemaakt met diethylpyrocarbonaat (DEPC) - behandeld water om eventueel achtergebleven RNase vernietigen. Voor DEPC behandeling, voeg DEPC (1 ml per liter), schud krachtig tot alle DEPC bolletjes vervolgens verdwenen Autoclaveer de DEPC degraderen.

1. RNA Probe Synthe....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een werkwijze voor dubbel fluorescentie ISH gevolgd door immunolabeling in muizenhersenen secties. Een korte beschrijving van dit protocol wordt getoond in figuur 1. De eerste stap was probes specifiek voor Aspa en Mbp (myeline basisch eiwit) synthetiseren. Nagaan of de probes waren gesynthetiseerd, een kleine hoeveelheid van elke reactie werd over agarose gel. De zwakke lineaire template en een groot deel van de RNA probe te zien.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol wordt stap-voor-stap procedure voor een dubbele RNA in situ hybridisatie gevolgd door immunokleuring. We hebben dit protocol dat wordt gebruikt om te bevestigen dat Aspa wordt uitgedrukt in mature oligodendrocyten in verschillende hersengebieden.

Deze multi-step procedure vele valkuilen die gevoeligheid kan beïnvloeden en moeten worden vermeden. Ten eerste, alle oplossingen en buffers voor opslag transcriptiereactie nodig RNase-vrij zijn. Ten tweede, de keuze v.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk in de laboratoria van de auteurs werd ondersteund door de UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 en BB/L003236/1), de Wellcome Trust (WT100269MA) en de European Research Council (ERC, "Ideas" Programma 293544). SJ werd ondersteund door een EMBO langetermijnbeurs. De auteurs danken Stephen Grant voor zijn technische assistentie.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
QIAprep MiniprepQiagen27104
Deionized formamideSigmaF9037voor ISH blokkeer buffer
Sodium chlorideSigmaS3014
Trizma BaseSigmaT1503
Hydrochloric acidVWR International20252.290
Sodium phosphate monobasic anhydrousSigmaS8282
Sodium phosphate dibasic dihydrateSigma30435
Yeast tRNARoche10109495001
50x Denhardt's solutionLife Technologies750018
Dextran sulfateSigmaD8906
Aspa cDNA cloneSource BioscienceIRAVp968C0654D
SalINew England BiolabsR0138
Sodium acetateSigmaS2889
Equilibrated phenolSigmaP4557
ChloroformSigma-AldrichC2432
Isoamyl alcoholAldrich496200
EthanolVWR International20821.321
T7 RNA polymerasePromegaP4074
Transcription bufferPromegaP118B
100 mM DTTPromegaP117B
UTP-DIG NTP mixRoche11277073910
RnasinPromegaN251B
ParaformaldehydeSigmaP6148
Filter paperFisher scientific005479470
SucroseSigma59378
Diethyl pyrocarbonateSigmaD5758
PentobarbitoneAnimalcare LtdBN43054
Dissecting scissorsWorld Precision Instruments15922
25 gauge needleTerumo300600
Peristaltic pumpCole-Parmer Instrument Co. LtdWZ-07522-30
Iris scissorsWeiss103227
No.2 tweezersWorld Precision Instruments500230
Coronal Brain MatrixWorld Precision InstrumentsRBMS-200C
Razor bladePersonna MedicalPERS60-0138
OCT mediumTissue tek4583
Cryostat/microtomeBright
Superfrost plus slidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Sodium citrateSigmaS4641voor 65 °C was buffer
FormamideSigma-AldrichF7503
Tween-20Sigma-AldrichP1379
CoverslipsVWR International631-0146
Coplin JarSmith Scientific Ltd2959
Blocking reagentRoche11096176001
Heat-inactivated sheep serumSigmaS2263
Hydrophobic penCosmo BioDAI-PAP-S1:500
α-FITC POD-conjugated antibodyRoche11426346910
TSA™ Plus Fluorescein SystemPerkin ElmerNEL741001KT1:1,500
α-DIG AP-conjugatedRoche11093274910
Fast red tabletsRoche11496549001
.22 µM filterMillexSLGP033RS
α-Olig2 Rabbit antbodyMilliporeAB9610
Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibodyLife technologiesA-315731:1,000
bisBenzimide H 33258sigmaB2883
Mounting mediumDakoS3023
Leica SP2 confocal microscopeLeica

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
  2. Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Immunolabellingtechniekdetectie van genexpressieRNA sondehybridisatieantilichaamconjugatiefluorescentiemicroscopiepreparatie van weefselcoupesplasmidepurificatierestrictie enzymdigestie

Gerelateerde artikelen