Foerageren Path-length Protocol Drosophila melanogaster Larven

Samenvatting

We bieden een gedetailleerd protocol voor een Drosophila melanogaster foerageerpadlengte-assay. We bespreken de voorbereiding en het omgaan met testdieren, hoe de assay uit te voeren en de gegevens te analyseren.

Samenvatting

De Drosophila melanogaster larvale weglengte fenotype is een gevestigde methode om de genetische en omgevingsfactoren bijdragen aan gedragsvariatie bestuderen. De larvale weglengte test werd ontwikkeld om individuele verschillen in foerageergedrag die later werden gekoppeld aan het foerageren gen te meten. Larvale weglengte is een makkelijk scoorde eigenschap dat het verzamelen van grote steekproefomvang faciliteert, tegen minimale kosten, voor genetische screens. Hier hebben wij een gedetailleerde beschrijving van de huidige protocol voor larvale weglengte assay eerst door Sokolowski. Het protocol beschrijft hoe reproduceerbaar te behandelen proefdieren, voeren de gedrags-test en de gegevens te analyseren. Een voorbeeld van hoe de test kan worden gebruikt om gedrags plasticiteit in respons op omgevingsveranderingen te meten, door het toevoeren omgeving manipuleren voor het uitvoeren van de test, wordt ook voorzien. Tot slot, geschikte test design en milieu-factoren die kunnen wijzigenlarvale weglengte zoals de kwaliteit van het eten, ontwikkelingsleeftijd en dag effecten worden besproken.

Inleiding

Sinds de ontdekking van het witte gen in het laboratorium Thomas Hunt Morgan in 1910, heeft de fruitvlieg Drosophila melanogaster (D. melanogaster), gebruikt als model voor de studie van de moleculaire en fysiologische onderbouwing van verschillende biologische processen. De populariteit van D. melanogaster grotendeels voort uit de aanzienlijke hoeveelheid en de verscheidenheid van genetische instrumenten. Drosophila kleine formaat, relatieve gemak van de behandeling en korte generatie tijd maken het een ideaal model voor genetische studies. Even belangrijk is Drosophila vermogen om veel van de fenotypes met meer complexe organismen zoals zoogdieren tot expressie te tonen. Dit omvat complexe fenotypen zoals gedrag die staan ​​op het grensvlak tussen het organisme en zijn omgeving. Als zodanig, behavioral studies over de fruitvlieg aanzienlijk hebben bijgedragen aan ons begrip van hoe genen en het milieu te bemiddelen gedrag1.

Een van de eerste studies D. melanogaster larven gedrag onderzocht individuele verschillen in larvale foerageerstrategieën door het meten van het pad-lengtes van de larven ² tijdens het voeden. Padlengte is gedefinieerd als de totale afstand die een larve op gist, binnen vijf minuten. Zowel laboratoriumstammen en vliegen van een natuurlijke populatie Toronto gevarieerd in hun gedrag voederen en er een genetische component aan individuele verschillen in weglengte. Twee larvale foerageren morphs werden beschreven vanuit de kwantitatieve weglengte distributies en ze waren rover en sitter genoemd. Rovers vertonen langere weg-lengtes, terwijl het doorkruisen van een groter gebied, terwijl op een voedingsmiddel substraat dan sitters. Met behulp van deze weglengte assay, de Belle et al. ³ in kaart gebracht het foerageren (voor) gen verantwoordelijk voor deze individuele gedragsverschillen een discrete locatie op chromosoom- 2 (24A3-24C5). De D. melanogaster voor gen werd later gekloneerd ⁴ en openbaarde een cGMP afhankelijke eiwitkinase ^5, een modulator fysiologie en gedrag in Drosophila en andere organismen ⁶ zijn.

Hier schetsen we de huidige protocol voor de larvale weglengte assay oorspronkelijk ontwikkeld in Sokolowski ^2. Hoewel bepaalde aspecten van de test loop der jaren veranderd, het concept achter het ontwerp niet. We bieden ook gegevens aan het potentieel van de test om genetische en omgevingsfactoren bijdragen aan individuele verschillen in het foerageergedrag van Drosophila larven te beoordelen te illustreren. Het larvale weglengte test is eenvoudig, efficiënt en toch robuust. Een enkele persoon kan testen tot 500 larven met gemak vier uur en de resultaten kunnen worden verkregen met een hoge reproduceerbaarheid. Oorspronkelijk ontwikkeld om te lokaliseren, kan worden gebruikt in genetische, quantitative trait locus in kaart brengen en in studiesvan gen-by-omgeving (GxE) interacties. Bovendien zijn de eenvoud en de reproduceerbaarheid maken het tot een geweldige bron voor undergraduate onderwijs.

Protocol

1. Bereid Grape Platen en Holding Flessen voor verzamelen van Larven

1. Om die flessen te maken, knippen gaten in de ene kant van 6 oz fly cultuur flessen, groot genoeg om een vlieg flacon stekker voor luchttoevoer passen (Fig. 1D).
2. Om druif platen te maken, voor te bereiden 250 ml van druivensap medium (1,8% agar, 45% druivensap, 2,5% azijnzuur, 2,5% ethanol) door het koken van de agar, druivensap en het grootste deel van het water, afkoelen tot 70 ºC ( roer tijdens het afkoelen), voeg dan azijnzuur en ethanol en aan tot de streep met water.
3. Gebruik een spuit (zonder naald) tot 35 x 10 mm petrischaal deksels te vullen tot het oppervlak van het druivensap medium maakt een koepel boven de lip van het deksel (afb. 1A).
4. WINKEL druif platen in een vochtige en luchtdichte houder bij 4 ° C tot gebruik (tot maximaal 2 weken).

2. bereiding van voedsel Plates

1. Bereid standaard vlieg voedsel recept.
   Opmerking: Om test opfokvoeder kwaliteit effecten op de weglengte gebruikten we lage voedingsstof vlieg voedsel: 10% sucrose, 1,3% agar, 0,8% kaliumnatriumtartraat, 0,1% monokaliumfosfaat, 0,05% natriumchloride, 0,05% calciumchloride, 0,05% magnesiumchloride, 0,05% ijzersulfaat, 5% gist en 0,5% propionzuur in water; en hoge nutriënten vlieg voedsel: 1,5% sucrose, 1,4% agar, 3% glucose, 1,5% maïsmeel, 1% tarwekiemen, 1% sojameel, 3% melasse, 3,5% gist, 0,5% propionzuur, 0,2% Tegosept en 1 % ethanol in water. Voor zowel voedingsmiddelen Autoclaveer de oplossing en laat afkoelen tot 50 ^o C voor het toevoegen van het propionzuur, Tegosept en ethanol.
2. Giet 40 ml vlieg voedsel in 100 x 15mm Petri gerechten.
3. Bewaar voedsel platen in een vochtige en luchtdichte container bij 4 ° C tot gebruik (tot een maximum van 2 weken).

3. Bereid Test Plates

1. Bereid 58 x 25 cm, 6 mm dikke zwarte plexiglas platen met 10, 1 mm diepe ronde putjes, 10 cm in diameter en aangebracht in een 2 x 5 design (Fig. 1C) larven testen.
   Nb: Tot 30 larven kunnen worden getest om tegelijkertijd 3 of meer van bovenstaande plexiglas platen zijn. Als alternatief kunnen larven worden getest in petrischalen, 10 cm in diameter. Deze optie is veel omslachtiger en maakt lagere aantallen larven te testen.
2. Het verkrijgen van een zwarte 39 x 8 cm, 6 mm dik plexiglas verspreider voor het verspreiden van de gist pasta op het plexiglas testplaten.
3. Bereid 100 x 15 mm petrischaal deksels voor het opnemen van larvale pad-lengtes door het scheiden van deksels van de bodems van tevoren.

4. Het opzetten van Parental Populaties

1. Houd het grootbrengen voorwaarden constant gedurende de gehele test (bijvoorbeeld 25 ° C, 60% vochtigheid en een 12:12 licht: donker cyclus op standaard vlieg voedsel).
2. Raise ouderlijke bevolking in dezelfde kweekomstandigheden.
3. Verzamel 100-150 vrouwen en 50 - 75 mannen en ze rijpen 5 ± 1 dagen voor een optimale vruchtbaarheid.
4. laat females en mannetjes paren 's nachts in een 6 oz fly cultuur fles met standaard vlieg voedsel.
5. Transfer vliegt in een bedrijf fles en zet een druif plaat (een kleine hoeveelheid verse gist pasta op de druif plaat zal bevorderen eierleggende; fig. 1B) over de top met plakband (afb. 1E).
6. Laat flessen stond op zijn kop (Fig. 1F), met de druif plaat aan de onderkant te laten volwassenen om eieren te leggen op de druif plaat.
7. Gooi de eerste druif plaat na 24 uur en plaats een nieuwe druif plaat op het bedrijf fles. Dit zal de druif plaat waaruit larven de volgende dag worden verzameld zijn.
   Opmerking: Grape platen zullen moeten worden vrijgesproken van larven 22 uur na opgezet, opgezet borden zodat ze begin volgende dag kan worden gewist (bijv., Het opzetten van plaat bij 12:00 en duidelijk om 10 uur de volgende dag). Het is raadzaam om de eerste druif plaat Negeren om niet-eieren die vrouwen kunnen zijn roerende en tha voorkoment kan worden voortbewogen in ontwikkeling.

5. Verzamel L1 (Eerste Instar) Larven van Grape Plates

1. Verwijder druif platen uit flessen 22 uur nadat ze werden opgericht en plaats in een 60 x 15 mm petrischaal.
2. Plaats een nieuwe druif plaat met verse gist plakken op het bedrijf fles.
3. Duidelijke en gooi alle larven van de geënte druif plaat met behulp van een dissectie sonde.
4. Incubate ontruimd druif platen voor 4 uur in normale omstandigheden.
5. Na 4 uur, pick-100 L1 larven per soort uit de druif borden en leg op voedsel borden.
   1. Plaats larven op het voedsel voorzichtig (zonder perforeren het eten en het begraven van de larven) en verdringing te voorkomen door het verspreiden van de larven in de voedselverwerkende industrie plaat.
6. Incubate voedsel platen tot proefdieren zijn ongeveer 10 uur voor de start van zwerven.
   Opmerking: Bij 25 ºC, 10 uur voor het algemeen zwerven komt overeen met 72-96 uur na het uitkomen. de exact hoeveelheid incubatietijd dient te worden vastgesteld vóór het begin van het experiment door het verzamelen van een eerste reeks van larven voor elke stam en het registreren van het aantal uren tot de start van het zwerven (dwalen larven zal verhuizen van het voedsel op de zijkanten en het deksel van het voedsel platen).
   Opmerking: Indien nodig, kan dezelfde ouders worden gebruikt om larven 3 verzamelen - 4 dagen van het testen door het herhalen van stappen 4,7-5,5. De volgorde waarin stammen worden opgezet en getest in dagen een testorde effect op weglengte voorkomen. Test dezelfde "control" stam / stammen elke dag van het testen om te controleren voor de dag effecten.
7. Als veel stammen worden getest, spreiden de opzet en ophaaltijden van de larven mogelijk maken het testen van elke stam op het juiste tijdstip later.

6. Larvale Path-length Test

1. Ontbinden droge-actieve bakkersgist in water bij een 1: 2 verhouding (gewicht naar volume). De afgewerkte gistpasta moet dunner zijn dan pancake beslag, zodanig dat bij het optillen van een lepel uit de pasta, het druppelt en achterlaat linten op het oppervlak van de pasta die snel wegsmelten.
   Opmerking: De consistentie van de gistpasta is belangrijk en moet constant gedurende het experiment. De exacte gist: water verhouding zou moeten worden aangepast afhankelijk van het merk en batch gist.
2. Voorzichtig plukken larven van de eerste stam te testen uit het voedsel plaat met behulp van een kwast.
3. Verzamel larven in een petrischaal en voorzichtig te wassen met water om al het voedsel te verwijderen.
   1. Snel wassen larven met 1-2 ml water en voorzichtig deppen larven droog met een laboratorium af te vegen om te vermijden dat er geen water bij het plaatsen van de larven op de test plaat. Om stress te vermijden, houden larven vochtig maar niet ondergedompeld in water.
4. Schik drie testplaten naast elkaar en ligt op 5 minuten timer voor elke test plaat.
5. Toepassen gistpasta naar de top van de testplaten en met de spreider, een dunne layer gist pasta op elke testplaat zodat alle putjes een gelijkmatige laag van gist.
6. Plaats voorzichtig een larve in het midden van elk putje starten van de timer 5 min na het plaatsen van de eerste larven op elke plaat. Opmerking: Drie platen kan tegelijk, waardoor een steekproefomvang van 30 / stam / testdag, tot een totaal van 500 larven.
7. Plaats een petrischaal deksel bovenop elk putje.
8. Wanneer de timer afloopt, zonder het verwijderen van de larven van de plaat, start het opsporen van de pad-lengtes achtergelaten in de gist met behulp van een permanent marker. Trace pad-lengte in dezelfde volgorde als larven werden op de testplaten.
   1. Voer traceren op dezelfde snelheid als larven op de platen werden geplaatst. Voor de consistentie in latere data-analyse, maken gebruik van dezelfde marker voor alle pad-lengtes. Permanent marker is aan te bevelen.
9. Herhaal de stappen 6.2 tot 6.8.1 voor elke stam te testen. Pick elke stam uit het voedsel dat onmiddellijk voor het testen om de honger effecten op pa voorkomenth-length.

7. Levensmiddelen beroving

1. Als larven zijn voedsel verstoken van de proef, verzamelen larven zoals beschreven in stap 6,2-6,3, maar de gewenste hoeveelheid voedselontbering tijd eerder (bijv., Wanneer larven worden waaraan voedsel is onthouden gedurende 4 uur, verzamel larven 4 uur voor testtijd).
2. Verdeel gewassen larven in twee groepen en plaats het voedsel verstoken groep in een 60 x 15 mm petrischaal met 5 ml 1% agar en de controlegroep in een petrischaal met 5 ml standaard eten.
3. Plaats een gewicht boven op het omgekeerde deksel van de petrischalen (anders larven kunnen kruipen bij het zoeken naar voedsel).
4. Incubeer de eerder vastgestelde voedsel ontbering periode en ga verder met het testen zoals beschreven in de stappen 6,2-6,9.
5. Als veel stammen worden getest, wankelen de voedselontbering starttijden om voor het testen van elke stam op het juiste tijdstip.

8. Data Analysis

Opmerking: Deze sectie beschrijft een werkwijze voor analyse met behulp ImageJ ⁷ of ⁸ Fiji verwerking van pad-lengte, hoewel andere software kan worden gebruikt.

1. Gebruik een lichte tafel om alle getraceerd pad-lengtes van de petrischaal deksels over te dragen aan white paper (deksels kan worden gewassen met ethanol en hergebruikt voor verdere weglengte opname).
2. Trace een 50 mm rechte referentielijn op een van de vellen papier.
3. Scan de pad-lengtes met een resolutie van 300 dpi en opslaan als bitmap of tiff beeldbestanden.
4. Open het image-bestand, selecteert u de "Process" tab> "Binary"> "Maak binary". Vervolgens onder het tabblad "Process", selecteer "Binary"> "schets maken". Dit levert een één pixel breedte lijn, ongeacht de dikte van het spoor.
5. Zorg ervoor dat elke weglengte verschijnt als een continue enkele regel zonder crossovers.
6. Scheid elke kruispunten met behulp van de "Straight line functie "en het inkleuren van de lijn wit (de continuïteit van het pad kan worden gecontroleerd met de" Wand "(tracing) tool, moet het hele pad geel gemarkeerd (afb. 2).
7. Selecteer de "Analyse" tabblad> Set metingen en selecteer "Perimeter" en "display label".
8. Selecteer de "Analyse"> tabblad "Stel schaal" en selecteer "schaal verwijderen".
9. Op de afbeelding, selecteert u de verwijzing regel alleen, selecteert u het tabblad "Analyse"> "Analyse deeltjes" en selecteer "Show: Outlines", "Toon resultaten" en "Clear resultaten table". Let op: De uitgang zal het aantal pixels dat overeenkomt met de 50 mm schaal lijn laten zien.
10. Selecteer "Analyse"> tabblad "Stel schaal" en in het aantal pixels in "Distance in pixels" en de bijbehorende afstand (50 mm) in de "bekende afstand" in te vullen.
11. Tot slot, selecteert u alle weglengte tekeningen van een genotype eenta tijd, selecteer de "Analyse"> tabblad "Analyse deeltjes" en selecteer "Show: contouren", "Toon resultaten" en "Clear resultaten table".
    1. Verwijder eventuele schriftelijke labels of voor de hand liggende vreemde markeringen (ze zullen worden erkend als path-lengtes) binnen het geselecteerde gebied door het gebied te selecteren en vullen wit.
12. Inspecteer de "Outlines" output file te zorgen voor de perimeters correct werden vastgesteld. De uitgang een weglengte in mm per weglengte tekening de selectie tonen. Dit kan gemakkelijk worden geëxporteerd naar een spreadsheet en geanalyseerd met statistische software.

Resultaten

Verschillen in weglengte van de rover en sitter voor stammen en het effect van voedsel op deprivatie weglengte zijn geïllustreerd in Fig. . 3 verzamelde gegevens gedurende drie opeenvolgende dagen testen toonde een significante stam effect (F _(1,421) = 351,89, p <2,20 x 10 ^-16; fig. 3A), met rovers verder dan sitters reizen. Naast het effect stam, was er een significant behandelingseffect voedselef...

Discussie

De weglengte assay hier geschetste biedt een robuuste en eenvoudige maatregel van het foerageergedrag van Drosophila larven. Het protocol volgt de algemene methodiek Sokolowski ² beschreven, maar is sindsdien verbeterd met betrekking tot efficiëntie en experimentele controles. Voor zover wij weten is deze methode de enige beschikbare werkwijze voor het meten larvale weglengte. De oorspronkelijke versie van de weglengte protocol ^{2, 3, 15, 16} geteste larven op petrischalen met een dun laagje...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
6 oz fly cultuur flessen	Fisher Scientific	AS355
Fly flespluggen	Droso-Plugs	59-201
35 x 10 mm Petri schotels	Falcon	351008
100 x 15 mm Petri schotels	Fisher	875712
60 x 15 mm Petri schotels	VWR	25384-168
Dissectie-sondes	Almedic	2325-58-5300
Gist	Lab Scientific	FLY-8040-20F