Intra-iliaca Injectie voor Efficiënte en Selectieve Modellering van Microscopisch botmetastase

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft de gedetailleerde procedure van intra-iliacale arteriële (IIA) injectie, een techniek om kankercellen specifiek af te leveren aan weefsels van de achterpoten, inclusief botten, om experimentele botmetastasen te creëren. Hoewel het oorspronkelijk werd vastgesteld met borsttumormodellen, kan dit protocol gemakkelijk worden uitgebreid naar andere soorten kanker.

Samenvatting

Injectie in de intra-iliacale slagader (IIA) is een efficiënte methode om metastaserende laesies van verschillende kankercellen bij dieren te introduceren. In vergelijking met de veel gebruikte intra-cardiale en intra-tibiale injecties, biedt IIA-injectie verschillende voordelen. Ten eerste kan het een grote hoeveelheid kankercellen specifiek naar de achterpootbeenderen brengen, waardoor tijd- en ruimtelijk gesynchroniseerde vroege kolonisatie-evenementen worden geboden en een robuuste kwantificering en snelle detectie van gedisseminateerde tumorcellen mogelijk worden. Ten tweede injecteert het kankercellen in de bloedcirculatie zonder de lokale weefsels te beschadigen, waardoor ontstekings- en wondgenezingsprocessen worden vermeden die het botkolonisatieproces beïnvloeden. Ten derde veroorzaakt IIA-injectie zeer weinig metastatische groei in niet-botorganen, waardoor voorkomen wordt dat dieren bezwijken aan andere vitale metastasen en continue monitoring van indolente botlaesies mogelijk wordt. Deze voordelen zijn vooral nuttig voor het inspecteren van de progressie van enkele kankercellen naar micrometastasen met meerdere cellen, wat in het verleden grotendeels ongrijpbaar is geweest. In combinatie met geavanceerde benaderingen van biologische beeldvorming en bothistologie, kan IIA-injectie worden toegepast op verschillende onderzoeksdoeleinden met betrekking tot botmetastasen.

Inleiding

Metastasen goed voor meer dan 90% van de sterfgevallen als gevolg van solide tumoren. Bot is de meest voorkomende orgaan beïnvloed door metastasen van verscheidene soorten kanker, in het bijzonder borstkanker en prostaatkanker. Wanneer de diagnose in de kliniek, meestal botmetastasen al hebt ingevoerd gevorderde stadia met ofwel osteolytische of osteoblastische veranderingen in bot, vaak gepaard met neurologische symptomen.

Eerdere studies voornamelijk gericht op de openlijke osteolytische botmetastasen ^1-3, maar we momenteel beperkte begrip van micrometastasen in botten voor het begin van het proces osteolytische. Dit is althans gedeeltelijk te wijten aan gebrek aan geschikte experimentele modellen en benaderingen. Genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker metastaseren vaak longen, maar veel minder efficiënt botten ^4. Ook de orthotopically getransplanteerde tumoren ontwikkelen zelden spontaan botmetastasen, met een aantal bot-tropische 4T1 borstklier carcinoomeen sub-klonen en MSP overexpressie PyMT transgene muismodel als uitzonderingen ^5-7. Intra-scheenbeen boren kan kankercellen te leveren aan het bot ^8-10, maar zij maakt ook schade en ontstekingen aan de lokale weefsels. Momenteel intracardiale injectie van borstkanker cellijnen belangrijke benadering bot kolonisatie ^11-13 onderzoeken geweest. Echter, na kankercellen worden ingebracht in linker ventrikel slechts een beperkt deel zal uiteindelijk bij bot en beenmerg, waardoor het moeilijk microscopische uitzaaiingen volgen op een meetbare manier.

In deze studie hebben we vastgesteld techniek, namelijk intra-iliacale arterie (IA) injectie ^14, om kankercellen selectief leveren aan achterpoot weefsels, waardoor kankercellen in bot en beenmerg verrijken zonder schade aan lokale weefsels. Door het bot specificiteit, deze benadering ook voldoende voor indolent kankercellen uiteindelijk koloniseren alvorens het eenij dieren bezwijken voor primaire tumoren en uitzaaiingen in andere vitale organen. In combinatie met verschillende andere technieken, zoals bioluminescentie, immunofluorescentie kleuring en bothistomorfometrie, IIA injectie is potentieel nuttig voor een breed scala aan onderzoeksdoeleinden verband met botmetastasen, vooral voor de overgang van één kankercellen meerdere cellen volgen micrometastasen. In het bijzonder hebben we aangetoond dat IIA injectie kunnen we de interacties tussen kankercellen en diverse omringende cellen in het bot micro visualiseren.

Protocol

Alle dierlijke werk werd gedaan in overeenstemming met de richtlijnen van het Baylor College of Medicine Animal Care.

1. Celbereiding

Op: verschillende kankercellijnen kunnen worden gebruikt voor injectie IIA afhankelijk onderzoeksdoeleinden. Wij hebben borstkankercellijnen MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 en prostaatkanker cellijn C4-2 in het onderzoek. We gebruiken meestal zowel GFP en vuurvlieg-luciferase gelabeld kankercellen voor onze studie en hier laten zien sommige gegevens van de GFP-Luciferase-label MCF7 cellijn.

1. Handhaven cellen in DMEM met 10% FBS en 0,1 mg / ml penicilline-streptomycine bij 37 ° C in _5% CO2.
2. Voordat IIA injectie trypsinize cellen bij 80-90% samenvloeiing met 0,25% trypsine / EDTA-oplossing. Gebruik koude PBS om cellen tweemaal wassen en resuspendeer cellen in 10 ml PBS celtelling. PBS Centrifugeer cellen te verwijderen bij 800 xg gedurende 5 minuten.
3. Resuspendeer cellenbij een concentratie van 5 x 10 ⁶ cellen / ml in ijskoude PBS.
4. Gebruik 100 ul GFP- en vuurvlieg-luciferase gelabeld kankercellen voor IIA injectie van één muis.
   Opmerking:. Daarom is het aantal cellen door elk dier ontvangen, is 5 x 10 ⁵ Dit aantal moet worden gewijzigd gebaseerd op de agressiviteit van cellijnen.
5. Houd celsuspensies op ijs.
   Noot: Trillingen kunnen nodig zijn om celaggregatie elke paar minuten te voorkomen totdat het klaar is voor injectie. Voor sommige cellijnen (zoals MDA-MB-231), kunnen strengere procedures (bijvoorbeeld, via 45 urn cel zeef) nodig om aggregatie te voorkomen. Houdt u er rekening mee dat de klomp van de schepen weefselnecrose kan veroorzaken, en daardoor verwarrende de experimenten.

2. Dier Voorbereiding

1. Voor dier pijn, geef 5 mg / kg / dag carprofen (of ander analgeticum) met voedingssupplement aan de muizen niet minder dan 24 uur voor de operatie. Behereneen dosis van 0,1 mg / ml subcutaan buprenorfine 60 min voorafgaand aan de operatie. Let op: een optionele procedure is om estradiol pallet te implanteren in de achterkant van de dieren om extra estradiol bieden. Hierdoor wordt de groei van ER + kankercellen (bijvoorbeeld MCF-7 cellen) ⁹ versnellen.
2. Verdoven een 4-6 weken oude muizen (ongeveer 20 g) met ketamine (80 - 100 mg / kg) en xylazine (10 -12,5 mg / ml) door intraperitoneale injectie.
3. Bevestig het juiste niveau van sedatie van een 20 g muis door teen knijpen en de waarneming van een vermindering van 50% van de ademhalingsfrequentie en roze slijmvliezen (bv, muis oor huid en poot huid). Houd toezicht op deze vitale functies om de 15 minuten tijdens de operatie. Opmerking: geen beweging van het dier blijkt dat het dier voldoende verdoofd en klaar voor chirurgie.
4. Gebruik dierenarts zalf op de ogen om uitdroging te voorkomen.
5. Scheer de muis in de onderbuik, in het bijzonder de rechter lies gebied waar de operatie en injectie zalplaatsvinden.
   Opmerking: Dit is niet nodig als athymische naakt muizen worden gebruikt.
6. Zet de muis op zijn rug, spreidde de benen in hun natuurlijke positie en plak de tenen naar mobiele dissectie karton met tape.
7. Veeg de rechter liesstreek met 70% isopropyl ethanol gedrenkt steriele wattenstaafjes, volgde met betadine chirurgische scrub meerdere malen.

3. Het gemeenschappelijk Iliac Vein en Artery Locatie en Scheiding

1. Maak een incisie in de huid van 1,0-1,2 cm lang tussen de 4 ^e en 5 ^e tepels in de rechter onderbuik met steriele, # 10 koolstofstaal scalpelmesjes gehouden in een nummer 3 handvat. Maak dan gebruik van een steriele chirurgische laken om het dier lichaam te bedekken met uitzondering van de incisie.
2. Verplaats het dier standaard bench top dissectie microscoop. Gebruik een vergroting 4x voor injectie.
3. Onder 4X vergroting van de dissectie microscoop, steek stompe tang scheiding tussen het vetweefsel en de peritoneum, en druk op de weefsels naar buiten aan beide zijden van de iliacale vaten en zenuwen (zie figuur 1) bloot te leggen.
   Opmerking: De slagader tussen aorta van de middellijn en het onderste deel van slagader takken wordt bekkenslagader genoemd. Dit is waar de injectie plaatsvindt.
4. Gebruik een paar rechte fijne tang te breken door het bindweefsel (zoals een membraan) tussen schepen en de zenuw, dichter bij de schepen.
5. Schakel de rechte fijne tang aan de linkerhand. Pak een paar schuine fijne tang met de rechterhand. Steek de rechterhand tang in dezelfde positie waar het bindweefsel zijn gebroken. En dan vasthouden aan de rechterhand tang door en onder de schepen.
6. Op hetzelfde moment, plaatst de linkerhand een tang in het bindweefsel aan de linkerkant van de schepen aan de rechterhand tang gaan door te leiden.
7. Zodra de rechter tang krijgt onder de schepen, proberen om de schepen te scheiden van de omliggende tissue een beetje meer, en dan blijven ze op de top van de rechterhand tang.
8. Gebruik linkerhand tang om het uiteinde van een 4-0 zijden hechtdraad te leveren aan de rechterhand een tang, en trek de hechtdraad voorzichtig en langzaam door middel van onder de schepen. Opmerking: Nu zowel de gemeenschappelijke ader en slagader schepen worden opgesteld door de hechtdraad opgeheven (zie figuur 2).

4. Injectie en Post-injectie Care

1. Maak de cellen voor injectie in een 31 G insulinespuit. Gebruik 100 gl celsuspensie in PBS per injectie. Zorg ervoor dat u pipet op en neer meerdere malen om de cellen te scheiden en aggregatie te vermijden, zodat de geïnjecteerde cellen niet zal verstoppen en blokkeren de bloedstroom.
2. Met de schuine pincet in de linkerhand, zet de tang onder de schepen langs de leiding van de hechtdraad, en open vervolgens de twee takken van de tang, met de vaten voorzichtig gehouden op de tang.
   Opmerking: De tijd tussen de twee takken van de tang zal de i wordennjection website.
3. Houd de 31 G naald met 100 gl celsuspensies in de rechterhand, met de schuine kant van de naald naar boven, klaar voor injectie.
4. Steek de naald in de slagader lumen (bloed zal de naald in te voeren). Duw vervolgens celsuspensie langzaam in om de cellen te injecteren. De celsuspensie zal wegduwen van de rode bloedcellen in het vat. Probeer niet om de schepen breken of lekken, de celsuspensie uit.
5. Wanneer de injectie is voltooid, voorzichtig terug te trekken van de naald en houd houden van de schepen tot aan de linkerkant een tang om het bloeden te stoppen. Trek vervolgens weg van de hechtdraad.
6. Weg te trekken de linkerhand een tang, en snel gebruik maken van een wattenstaafje om de slagader incisie gebied drukken om het bloeden te stoppen.
   Opmerking: Meestal 5-10 min voortdurende druk is voldoende om het bloeden te stoppen.
7. Als het bloeden stopt, gebruik dan de huid lijm om de huid randen van de operatie gebied te sluiten. Maak een oormerk, en controleer op bioluminescentie signalering naar de verdeling van de geïnjecteerde cellen te onderzoeken.
   Opmerking: Een succesvolle injectie resulteert in een afbeelding soortgelijk aan figuur 3.
   1. Raadpleeg bioluminescentie signalering door injectie van 100 pi 15 mg / ml luciferine in PBS bij 75 mg / kg muis concentratie via het intra-orbitale sinus.
      1. Voor intra-orbitale injectie, zet vingers aan beide zijden van de muis oog, gebruik druk om maken oogbol iets pop uit het oog kader, neem 28 G insulinespuit naalden tussen de oogbol en neus, en duw dan langzaam spuit luciferine injecteren .
         Opmerking: Bij de juiste positie, moet de naald in staat tot een diepte van 2 bereikt - 3 mm alvorens hard weefsel (bot).
      2. Plaats de muis in afbeeldingsstelsel voor in vivo beeldvorming van gehele dieren 10-60 sec in 5 minuten (zie figuur 3).
         Opmerking: Een optionele procedure is om estradiol pellet implanteren in de achterkant van de dieren om extra estradiol bieden. Hierdoor zal de groei van ER + kankercellen (bijvoorbeeld MCF-7 versnellencellen) ^15.
8. Laat de muis op een warme verwarming pad totdat hij wakker wordt. Bewaken van de bloeden, zwelling, tekenen van dehiscence en pijn tijdens de post-operatieve periode. Leg de muizen terug naar de kooi met pijnstillende dekking (carprofin voedingssupplement voorgesteld) gegeven voor pijnbestrijding totdat er geen tekenen van pijn. Besteed veel aandacht en zorg aan de dieren gedurende 7 dagen na de operatie.

5. Toezicht gemetastaseerde Growth

1. histomorfometrie:
   1. Harvest tumordragende botweefsel, bevestig de botten in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur, vervolgens ontkalken ze in pH 7,0 14% EDTA oplossing voor 3-5 dagen, en deze te onderwerpen aan inbedden in paraffine zoals eerder beschreven ^14.
   2. Gedeelte paraffine inbedding botweefsel met een dikte van 3 urn en uitvoeren standaard histologische Werkwijze hematoxyline / eosine kleuring zoals eerder beschreven ^14.
2. Immunohistochemisproberen:
   1. Onderwerp paraffine ingebedde tumor dragende bot glijdt naar immunohistochemie kleuring voor diverse doeleinden zoals eerder beschreven ^14. In het kort immunostain MCF7 kankercellen door anti-GFP antilichamen en immunostain osteogene cellen (pre-osteoblasten en Osteoblasten) door anti-Osterix antilichamen en anti-alkalische fosfatase (ALP) antilichamen, respectievelijk.

Resultaten

Figuur 1 toont de anatomische locatie en de relatie van bekkenslagader (rood) en ader (blauw).

Figuur 2 toont relatieve positie van iliacale bloedvaten en zenuwen onder dissectie microscoop. Zoals weergegeven in figuur 2A, de vaten en zenuwen direct onder de peritoneale wand en kan worden onthuld na de incisie wordt gemaakt en het peritoneum wordt weggeduwd. De vena iliaca com...

Discussie

Hoewel slechts de iliacale slagader is het doelwit van injectie voor kankercellen, adviseren wij de scheiding van zowel ader iliacale slagader en uit de omliggende weefsels, en om ze samen te heffen als een bundel. Dit komt omdat de ader en slagader intensief contact met elkaar, en de veneuze vaatwand is dun en gemakkelijk te breken. Daarom is voor een succesvolle injectie, bespaart tijd en moeite bij elkaar houden van de twee vaten, hoewel kankercellen worden geïnjecteerd alleen de slagader. Een 4-0 zijden hechtdraad w...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materials
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
Pen/Strep Amphatericin B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
Trypsin/EDTA solution	HyClone	SH30042.01
45 μM cell strainer	VWR International Laboratory	195-2545
MediGel CPF with carprofen	Controlled item from veterinary care in BCM		Voor pijnbeheersing
Buprenorphine	Controlled item from veterinary care in BCM		Voor pijnbeheersing
Estradiol pellet	Innovative Research of America	SE-121
Ketamine and xylazine	Controlled item from veterinary care in BCM
Vet ointment	Controlled item from veterinary care in BCM		Voorkom droge ogen
Shaver	Oster	78005-050	Voor muizen met vacht
Isopropyl ethanol	ACROS	67-63-0
Betadine surgical scrub	Controlled item from veterinary care in BCM
#10 scalpel blades	Ted Pella, Inc	549-3CS-10	Meerdere
No. 3 handle	Ted Pella, Inc	541-31	Moet worden geautoclaveerd
Sterile surgical drape	Sai Infusion Technology	PSS-SD1
Straight forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5132	Moet worden geautoclaveerd
Straight fine forceps	Fine Science Tools	11253-20	Moet worden geautoclaveerd
Edged fine forceps	Fine Science Tools	11253-25	Moet worden geautoclaveerd
4-0 Vicryl silk suture	Johnson & Johnson Health Care	J214H
31 G insuline syringes	BD	328418	Meerdere
Q-tips cotton swabs (Sterile)	VWR International Laboratory	89031-272
Skin glue	Henry Schein Animal Health	31477	Voor het sluiten van de huid op de operatieplek
Ear Tag Applicator	Fine Science Tools	24220-00
Ear tags	Fine Science Tools	24220-50
D-luciferin	Gold Biotechnology	LUCK	Vermijd licht en zet op ijs
28 G insulin syringes	BD	329410	Voor intra-orbitale injectie
Paraformadehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	Voor weefselfixatie
EDTA	OmniPur	4050	Voor decalcificatie van botweefsel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Equipment
Dissection microscope	Leica	Leica S6E stereo
IVIS Lumina II imaging system	Advanced Molecular Vision
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Antilichamen
Anti-GFP antibodies (JL-8)	Clontech	632381
Anti-ALP antibodies	Abcam	ab108337
Anti-Osterix antibodies	Abcam	ab22552